Polo樣激酶1在幽門螺桿菌感染慢性萎縮性胃炎癌前病變中的表達(dá)及意義

李永娟,劉永香,劉 倩,趙俊精,劉國(guó)通

(河北省廊坊市人民醫(yī)院1消化科,2針灸科,河北 廊坊 065000)

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是引發(fā)消化性潰瘍、慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）等消化系統(tǒng)疾病的公認(rèn)因子，Hp感染可引發(fā)胃上皮細(xì)胞損傷，改變其增殖及凋亡，導(dǎo)致胃黏膜病變甚至癌變[1-2]。Polo樣激酶1（polo like kinase 1，PLK1）是一種蘇氨酸/絲氨酸激酶，可調(diào)控細(xì)胞胞質(zhì)分離、有絲分裂及DNA損傷應(yīng)答等行為，高表達(dá)于肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤[3-4]。既往研究顯示[5]，PLK1在胃癌干細(xì)胞中高表達(dá)，且參與胃癌干細(xì)胞靜止與活動(dòng)狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)化及胃癌干細(xì)胞的增殖過程。另有研究顯示[6]，靶向抑制PLK1表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。因此，推測(cè)PLK1可能參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程。目前，關(guān)于PLK1在CAG癌前病變各階段中的表達(dá)變化研究尚少，且其對(duì)胃癌細(xì)胞惡性行為學(xué)的影響尚不明確。人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1作為永生化細(xì)胞株，因其基本上保留了正常細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，故是目前較為理想的Hp共培養(yǎng)模型細(xì)胞。本研究通過比較PLK1在Hp感染及未感染CAG癌前病變不同階段患者胃黏膜中的表達(dá)情況，并采用PLK1抑制劑BI2536干預(yù)Hp與GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)模型，觀察其對(duì)Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為胃癌的臨床防治提供理論依據(jù)。

1 研究對(duì)象、材料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2017年1月-2021年1月在河北省廊坊市人民醫(yī)院接受胃鏡檢查的260例患者，根據(jù)胃黏膜病理檢查分為淺表性胃炎組95例、CAG伴低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（L-IN）組70例、CAG伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（H-IN）組65例、胃癌組30例。淺表性胃炎組男性61例，女性34例，年齡20～74歲，平均（45.27±7.48）歲，病程6個(gè)月～18年，平均（4.04±1.53）年；LIN組男性40例，女性30例，年齡22～74歲，平均（46.36±7.32）歲，病程6個(gè)月～17.5年，平均（4.89±1.68）年；H-IN組男性39例，女性26例，年齡22～74歲，平均（46.36±7.32）歲，病程6個(gè)月～20.5年，平均（5.19±2.68）年；胃癌組男性19例，女性11例，年齡22～71歲，平均（47.41±7.80）歲，病程7個(gè)月～20年，平均（5.05±2.74）年。4組性別、年齡、病程臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：LFSRMYY-IRB-2019-013），所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者均符合《中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見》中相應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，且經(jīng)胃鏡檢查確診；（2）經(jīng)免疫組織化學(xué)染色法及快速尿素酶實(shí)驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)為Hp陽性，Hp陰性檢測(cè)結(jié)果為Hp陰性[8]；（3）精神正常，可配合完成研究；（4）均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他部位惡性腫瘤者；（2）糜爛性胃炎、急性胃黏膜病變、出血性胃炎、腐蝕性胃炎者；（3）近6個(gè)月使用過抗生素、抗炎藥物、抑酸藥物、益生菌制劑者；（4）合并嚴(yán)重心血管疾病、全身性代謝性疾病或肝腎功能不全者；（5）幽門梗阻性疾病者。

1.3 材料人胃上皮細(xì)胞GES-1，購于上海淳麥生物科技有限公司；Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637，來源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心；淺表性胃炎，CAG伴L(zhǎng)-IN、CAG伴H-IN、胃癌患者胃黏膜組織，于本院消化內(nèi)鏡中心進(jìn)行胃鏡檢查時(shí)留取，液氮保存。PLK1抑制劑BI2536，純度99.19%，購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.4 主要試劑、儀器兔抗人PLK1一抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；二甲基噻唑（dimethylthiazole，MTT）溶液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液、PI染液（美國(guó)Sigma公司）。Glite UV凝膠成像系統(tǒng)（江蘇偉禾生物科技有限公司）；Amnis?ImageStream?X MKⅡ流式細(xì)胞儀（德國(guó)Luminex公司）。

1.5 方法

1.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)胃黏膜組織PLK1表達(dá)量 取液氮保存的胃黏膜組織，充分剪碎后Trizol法提取組織中總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，產(chǎn)物經(jīng)鑒定后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，按照試劑盒說明書設(shè)定25μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 12.0μL，10μmol/L的上下游引物各1.0μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9.0μL；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4 min，95℃變性20 s，57℃退火35 s，72℃延伸45 s，重復(fù)38個(gè)循環(huán)。以GAPDH為管家基因，用2-△△CT計(jì)算PLK1 mRNA表達(dá)量。引物序列：PLK1：F:5'-ATGCGTAGTGCTGATGCGTGA-3',R:5'-CGTAGTGCGTGATGCTGATGC-3';GAPDH:F:5'-TAGCGTATGCTGTGATCGT-3',R:5'-GTAGCTGATGCTAACCTGC-3'。

1.5.2 GES-1細(xì)胞培養(yǎng) GES-1細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（含有10%FBS、1%雙抗）及標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境（5%CO2、37℃飽和濕度）中。觀察到細(xì)胞貼壁80%左右時(shí)，經(jīng)0.25%胰蛋白酶（含0.01%EDTA）消化、傳代。

1.5.3 Hp培養(yǎng) 培養(yǎng)于布氏培養(yǎng)基中（含有抗生素混合液與5%脫纖維凍融兔血），燭缸培養(yǎng)3 d（37℃飽和濕度），采用接種環(huán)輕刮培養(yǎng)基上Hp活菌，PBS懸浮，分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，采用DMEM培養(yǎng)基（含有10%FBS、無雙抗）調(diào)整菌液濃度至1×108cfu/mL。在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）操作。

1.5.4 Hp與GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)、分組、干預(yù) 將GES-1細(xì)胞按照2.4×104個(gè)/孔接種于96孔板，采用完全隨機(jī)化方式分為空白組、對(duì)照組、BI2536組，每組設(shè)置5個(gè)平行孔?？瞻捉M不做處理，對(duì)照組、BI2536組按照細(xì)菌∶細(xì)胞=1∶50的比例與細(xì)菌懸液混合。對(duì)照組加入正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，BI2536組加入終濃度為20 nmol/L的BI2536S培養(yǎng)。

1.5.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞PLK1表達(dá)量 取空白組、對(duì)照組、BI2536組細(xì)胞，總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、反應(yīng)體系及條件設(shè)置方式同1.5.1，以GAPDH為管家基因，用2-△△CT計(jì)算PLK1 mRNA表達(dá)量。

1.5.6 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)增殖能力 取各組細(xì)胞，在干預(yù)至24、48、72 h時(shí)，加入新制備的0.5%MTT溶液，每孔20μL，靜置2 h后棄去上清，加入DMSO溶液，每孔150μL，振蕩25 min使混合完全，靜置2 h后取上清，酶標(biāo)儀測(cè)定A490nm。A值越大，細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。所有操作重復(fù)3次，取均值。

1.5.7 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)凋亡能力 取各組細(xì)胞，干預(yù)至48 h時(shí)，binding buffer標(biāo)記液充分洗滌，3 000 r/min離心后棄上清，加入binding buffer標(biāo)記液重懸，與AnnexinV-FITC 5μL混合均勻，4℃遮光孵育20 min，加入PI染液5μL混合均勻，遮光孵育30 min，流式細(xì)胞儀在60 min內(nèi)檢測(cè)凋亡率。所有操作重復(fù)3次，取均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理、分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本計(jì)量資料采用方差分析檢驗(yàn)，以LSD-t檢驗(yàn)分析兩兩樣本。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達(dá)量比較與淺表性胃炎組和CAG伴L(zhǎng)-IN組比較，CAG伴H-IN組及胃癌患者胃黏膜PLK1表達(dá)量升高，且胃癌組高于CAG伴H-IN組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；淺表性胃炎組和CAG伴L(zhǎng)-IN組比較，胃黏膜PLK1表達(dá)量無差異（P>0.05）。見表1。

表1 CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達(dá)量比較（±s）

表1 CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達(dá)量比較（±s）

注：與淺表性胃炎組比較，a P<0.05；與CAG伴L(zhǎng)-IN組比較，b P<0.05；與CAG伴H-IN組比較，c P<0.05。

組別淺表性胃炎組CAG伴L(zhǎng)-IN組CAG伴H-IN組胃癌組F值P n 95 70 65 30 PLK1表達(dá)量0.19±0.04 0.20±0.05 0.36±0.05ab 0.95±0.06abc 172.987<0.001

2.2 Hp陰性、Hp陽性CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達(dá)比較Hp檢測(cè)結(jié)果顯示，Hp陽性患者103例（淺表性胃炎組26例、CAG伴L(zhǎng)-IN組23例、CAG伴H-IN組33例、胃癌組21例），Hp陰性患者157例（淺表性胃炎組69例、CAG伴L(zhǎng)-IN組47例、CAG伴H-IN組32例、胃癌組9例）。Hp陽性CAG患者PLK1表達(dá)量為（0.59±0.05），Hp陰性CAG患者的PLK1表達(dá)量為（0.21±0.04），與Hp陰性CAG患者比較，Hp陽性CAG患者PLK1表達(dá)量顯著升高（t=63.290，P<0.001）。

2.3 Hp陽性CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達(dá)比較與Hp陽性淺表性胃炎組和CAG伴L(zhǎng)-IN組比較，Hp陽性CAG伴H-IN組及胃癌患者胃黏膜PLK1表達(dá)量升高，且胃癌組高于CAG伴H-IN組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；淺表性胃炎組和CAG伴L(zhǎng)-IN組比較，胃黏膜PLK1表達(dá)量無差異（P>0.05）。見表2。

表2 Hp陽性CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達(dá)量比較（±s）

表2 Hp陽性CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達(dá)量比較（±s）

注：與淺表性胃炎組比較，a P<0.05；與CAG伴L(zhǎng)-IN組比較，b P<0.05；與CAG伴H-IN組比較，c P<0.05。

組別淺表性胃炎組CAG伴L(zhǎng)-IN組CAG伴H-IN組胃癌組F值P n 26 23 33 21 PLK表達(dá)量0.28±0.04 0.30±0.05 0.57±0.06ab 1.35±0.13abc 997.618<0.001

2.4 空白組、對(duì)照組、BI2536組細(xì)胞中PLK1表達(dá)比較空白組、對(duì)照組、BI2536組細(xì)胞中PLK1表達(dá)量分別為（0.08±0.01）、（0.47±0.06）、（0.24±0.04），與空白組比較，對(duì)照組、BI2536組細(xì)胞PLK1表達(dá)量升高（t=14.337，P<0.001；t=8.677，P<0.001）；與對(duì)照組比較，BI2536組細(xì)胞PLK1表達(dá)量降低（t=7.132，P<0.001）。

2.5 PLK1抑制劑BI2536對(duì)GES-1細(xì)胞增殖的影響24、48、72 h三個(gè)時(shí)刻MTT實(shí)驗(yàn)A值組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與空白組比較，對(duì)照組24、48、72 h三個(gè)時(shí)刻MTT實(shí)驗(yàn)A值均降低（P<0.05）；與對(duì)照組比較，BI2536組24、48、72 h三個(gè)時(shí)刻MTT實(shí)驗(yàn)A值均升高（P<0.05）。見表3。

表3 各組24、48、72 h三個(gè)時(shí)刻MTT實(shí)驗(yàn)A值比較（±s）

表3 各組24、48、72 h三個(gè)時(shí)刻MTT實(shí)驗(yàn)A值比較（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05。

組別空白組對(duì)照組BI2536組F值P 24 h 0.51±0.09 0.26±0.04*0.38±0.04#20.752<0.001 48 h 0.62±0.10 0.34±0.05*0.48±0.06#18.261<0.001 72 h 0.74±0.08 0.49±0.06*0.61±0.07#15.738<0.001

2.6 PLK1抑制劑BI2536對(duì)GES-1細(xì)胞凋亡的影響空白組、對(duì)照組、BI2536組細(xì)胞凋亡率分別為（30.47±7.44）%、（49.57±7.38）%、（41.29±5.31）%，凋亡率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與空白組比較，對(duì)照組凋亡率升高；與對(duì)照組比較，BI2536組凋亡率降低（P<0.05）。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡率

3 討論

胃癌發(fā)生是機(jī)體、環(huán)境多種因素綜合作用的結(jié)果，是一個(gè)多階段、多因素、多步驟的發(fā)展過程，其演變過程從淺表性胃炎到CAG，后發(fā)展至低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，直至胃癌，CAG到腸上皮化發(fā)生、低、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變作為胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵階段，被稱作癌前病變[9-10]。因此，對(duì)該階段進(jìn)行干預(yù)是預(yù)防胃癌發(fā)生的有效方式。Hp感染可導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞增殖與凋亡的失衡，誘發(fā)以生長(zhǎng)抑制或增生為主要表現(xiàn)的疾病如CAG、腫瘤等臨床結(jié)局。本研究所選菌株Hp NCTC11637是I型毒力菌株，可同時(shí)表達(dá)CagA、VacA毒力因子，具有較強(qiáng)毒性，在細(xì)菌與細(xì)胞比例為1∶50時(shí)即可獲取較好的感染效果[11]。PLK1抑制劑BI2536屬于二氫蝶啶酮類化合物，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表現(xiàn)出較為滿意的抗腫瘤活性，但關(guān)于其對(duì)Hp與GES-1共培養(yǎng)模型增殖、凋亡的影響尚少[12]。

細(xì)胞異常增殖、凋亡與一系列胃腸疾病的發(fā)生及正常細(xì)胞發(fā)生癌性轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。Hp感染不僅可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其引發(fā)的炎癥反應(yīng)也起到一定的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，胃黏膜細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，形成胃黏膜萎縮、潰瘍。為維持增殖與凋亡的平衡，胃黏膜上皮細(xì)胞將發(fā)生代償性增殖，不斷擴(kuò)大增殖帶，加快細(xì)胞更新速率[13-14]。在消化性潰瘍、CAG發(fā)生、發(fā)展的過程中可能發(fā)生細(xì)胞過度凋亡但無對(duì)應(yīng)細(xì)胞加速增殖，在胃癌進(jìn)程中則可能發(fā)生細(xì)胞迅速增殖，而無凋亡增加，顯著增加惡變風(fēng)險(xiǎn)。在Hp清除成功的CAG患者中，細(xì)胞增殖及凋亡指數(shù)可逐漸恢復(fù)正常[15]。本研究結(jié)果顯示，與淺表性胃炎組和CAG伴L(zhǎng)-IN組比較，CAG伴H-IN組及胃癌患者胃黏膜PLK1表達(dá)量升高，且胃癌組高于CAG伴H-IN組，Hp陽性患者PLK1表達(dá)量高于Hp陰性患者；Hp陽性的淺表性胃炎、CAG伴L(zhǎng)-IN、CAG伴H-IN、胃癌患者PLK1表達(dá)量依次升高，提示隨癌前病變階段的發(fā)展，PLK1表達(dá)逐漸升高，且在Hp陽性患者中更高。

此外，本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，對(duì)照組、BI2536組細(xì)胞PLK1表達(dá)量升高，與對(duì)照組比較，BI2536組細(xì)胞PLK1表達(dá)量降低；對(duì)照組24、48、72 h三個(gè)時(shí)刻MTT實(shí)驗(yàn)A值均低于空白組，凋亡率高于空白組，而BI2536組24、48、72 h三個(gè)時(shí)刻MTT實(shí)驗(yàn)A值均高于對(duì)照組，凋亡率低于對(duì)照組，提示Hp對(duì)GES-1細(xì)胞具有增殖抑制及凋亡促進(jìn)作用，而PLK1抑制劑BI2536可顯著拮抗該作用。PLK1不僅可通過直接調(diào)控細(xì)胞周期引發(fā)其異常增殖，還會(huì)與多種抑癌基因發(fā)生作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphate and tension homology deleted on chromsometen，PTEN）是重要的抑癌基因，在多種惡性腫瘤如胃癌中均發(fā)生PTEN失活，且其失活受到多層次調(diào)控[16-17]。研究表明[18]，PLK1可誘導(dǎo)PTEN碳尾端位點(diǎn)磷酸化，改變其結(jié)構(gòu)域，使其失去磷酸酶活性，擾亂其對(duì)下游基因的調(diào)節(jié)作用，影響細(xì)胞功能，從而增加腫瘤易感性。張耀中等[19]在研究PLK1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞腫瘤生物學(xué)行為的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)染PLK1 siRNA阻斷其表達(dá)，可抑制胃癌的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移，提示下調(diào)其表達(dá)對(duì)抑制腫瘤活性具有積極作用。

綜上所述，胃黏膜PLK1表達(dá)量在Hp感染的CAG癌前病變進(jìn)程中逐漸升高，PLK1可作為臨床中胃癌的早期篩檢的潛在指標(biāo)，具有重要臨床意義。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向抑制人胃上皮細(xì)胞GES-1中PLK1的表達(dá)可顯著降低Hp對(duì)GES-1細(xì)胞增殖和凋亡的抑制作用，進(jìn)一步為PLK1作為胃癌治療的可靠靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。在下一步的研究中，應(yīng)進(jìn)一步開展動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，為本研究結(jié)論提供更多、更充分的理論依據(jù)。