種雞禽流感抗體的檢測(cè)與分析

高 琛，周穎璐

(嵊州市畜牧業(yè)發(fā)展中心，浙江 嵊州 312400)

禽流感(Avian Influenza，AI)是禽類流行性感冒的簡(jiǎn)稱，是由正黏病毒科，流感病毒屬，A 型流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)引起的一種禽類(家禽和野禽) 、哺乳動(dòng)物的高發(fā)病率、高死亡率和高變異性的重大動(dòng)物傳染病。

根據(jù)禽流感病毒致病性和毒力的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感(High Pathogenic Avain Influenza，HPAI)、低致病性禽流感(Low Pathogenic Avain Influenza，LPAI)或溫和型禽流感(Mildly Pathogenic Avain Influenza，MPAI)。禽流感病毒可分為16個(gè)H亞型和9個(gè)N亞型。一般情況下，由H5和H7亞型毒株(以H5N1和H7N7為代表) 所引起的禽流感稱為高致病性禽流感，發(fā)病率和死亡率高、風(fēng)險(xiǎn)危害大。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE) 將高致病性禽流感列為A類動(dòng)物疫病[2]，我國(guó)將其列入一類動(dòng)物疫病。幾乎每次AI的暴發(fā)，尤其是HPAI的暴發(fā)都給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)沉重的打擊，有時(shí)也引起人的感染、發(fā)病甚至死亡，對(duì)人類健康構(gòu)成極大威脅，因此已經(jīng)引起世界各國(guó)的高度關(guān)注[3]。AIV低毒力株能明顯降低家禽的生產(chǎn)性能，引起產(chǎn)蛋異常和肉雞死亡等，并在禽類間隱性傳播，經(jīng)抗原漂移或抗原轉(zhuǎn)變形成新毒株或毒力增強(qiáng)，也開(kāi)始受到關(guān)注[4]。我國(guó)大規(guī)模的免疫措施收到了顯著的防控效果，然而我國(guó)禽流感疫情提示，活禽運(yùn)輸和免疫不全面等因素是疫情的重要起因。Shingo Iwami等認(rèn)為疫苗免疫雖然是控制禽流感疫情發(fā)生的有效工具，但倘若應(yīng)用不當(dāng)將不利于其防控[5]。

為了解濰坊市某些種雞場(chǎng)種雞禽流感的免疫抗體水平，便于更好為禽流感免疫做出評(píng)價(jià)，作者在山東工作時(shí)期應(yīng)用血凝(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)方法, 隨機(jī)抽樣對(duì)種雞進(jìn)行禽流感抗體檢測(cè)和分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1被檢血清 昌邑和壽光市9個(gè)雞場(chǎng)種雞188羽份血清。

1.1.2試劑及耗材 H5、H9亞型禽流感標(biāo)準(zhǔn)抗原。上述抗原由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司提供。1%雞紅細(xì)胞懸液自制。96孔微量反應(yīng)板，恒溫箱，微量移液器及配套的吸頭。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1H5亞型禽流感抗體檢測(cè)

1.2.1.1微量血凝試驗(yàn) (HA試驗(yàn)) 于微量血凝板的第一行每孔中滴加生理鹽水50 μL，吸取禽流感H5亞型禽流感診斷抗原50 μL滴加于第1孔，用微量移液器混勻后吸出50 μL 加入第2孔，混勻后吸出50 μL加入第3孔，以此類推，稀釋至第11孔，吸取50 μL棄去。第12孔不加抗原。于每孔加入1%紅細(xì)胞懸液50 μL。手持血凝板輕輕振蕩，放37℃ 15-20 min，根據(jù)血凝圖像判定結(jié)果，以出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度為該抗原的血凝效價(jià)。以上試驗(yàn)做2次重復(fù)，取2次抗原血凝效價(jià)的平均值。

1.2.1.2微量血凝抑制試驗(yàn)(HI試驗(yàn)) 于微量血凝板的每行每孔加入生理鹽水50 μL，每行第1孔加入待檢血清50 μL，用微量移液器混勻后吸出50 μL 加入第2孔，混勻后吸出50 μL加入第3孔，以此類推，稀釋至第11孔，吸取50 μL棄去。第12孔不加血清。每行1-12孔加入濃度為4個(gè)血凝單位的抗原，每孔50 μL；每行1-12孔加入1%紅細(xì)胞，輕輕振蕩，37 ℃下作用15-20 min，判定血凝抑制效價(jià)。

1.2.2H9亞型禽流感抗體檢測(cè) 方法同上述HA試驗(yàn)和HI試驗(yàn)。

2 結(jié)果

昌邑和壽光市9個(gè)種雞場(chǎng)抽檢188羽種雞的血凝抗體檢測(cè)結(jié)果匯總于表1。

表1 昌邑和壽光市種雞場(chǎng)抗體檢測(cè)結(jié)果

由表1可見(jiàn)，這9個(gè)種雞場(chǎng)共抽查了188羽份種雞血清進(jìn)行了血凝試驗(yàn)。其中昌邑1場(chǎng)到7場(chǎng)各抽檢20份血清，H5、H9亞型禽流感免疫全部合格，合格率為100%。壽光1場(chǎng)抽檢30份血清，H5亞型禽流感免疫合格數(shù)量為22，合格率為73.33%，H9亞型禽流感免疫合格數(shù)量為8，免疫合格率為26.67%。壽光2場(chǎng)抽檢18份血清，H5亞型禽流感免疫合格數(shù)量為16，免疫合格率為88.89%，H9亞型禽流感免疫合格數(shù)量為11，免疫合格率為61.11%。

3 討論

3.1抗體檢測(cè)分析 通過(guò)試驗(yàn)表明，昌邑市種雞禽流感H5、H9亞型禽流感抗體檢測(cè)平均合格率為100%。結(jié)果表明這7個(gè)種雞場(chǎng)的禽流感免疫做的是非常成功的，此場(chǎng)的肉種雞禽流感免疫程序：16 d禽流感單價(jià)疫苗H5-5滴眼、H9頸皮下注射(0.5 DOSE)，35 d禽流感單價(jià)疫苗H5-5胸肌、H9頸皮下注射(0.5 DOSE)，11 wks禽流感單價(jià)疫苗H5-5滴眼、H9頸皮下注射(0.5 DOSE)，20 wks禽流感單價(jià)疫苗H5-5滴眼、H9頸皮下注射，25 wks禽流感單價(jià)疫苗H5-5胸肌注射、H9頸皮下注射，40 wks禽流感單價(jià)疫苗H5-5胸肌注射(備注：20周齡以后的免疫依照抗體檢測(cè)情況而決定是否進(jìn)行再次免疫)。壽光市兩個(gè)種雞場(chǎng)禽流感H5亞型禽流感抗體檢測(cè)平均合格率為79.17%，H9亞型禽流感抗體檢測(cè)平均合格率為39.58%。結(jié)果表明這兩個(gè)場(chǎng)的禽流感免疫做的效果不是很好，此場(chǎng)48份血清中，H5亞型禽流感有10份抗體效價(jià)>12log2，H9亞型禽流感有29份抗體效價(jià)>12log2。從理論和實(shí)踐方面推測(cè)壽光這兩個(gè)種雞場(chǎng)的種雞被野毒株感染過(guò)。

壽光市這兩個(gè)種雞場(chǎng)的免疫程序和昌邑市7個(gè)場(chǎng)的免疫程序基本是相同的，疫苗和檢測(cè)抗體也是相同的。然而兩個(gè)地區(qū)的免疫合格效果卻參差不齊。昌邑市7個(gè)種雞場(chǎng)的禽流感H5、H9亞型禽流感抗體檢測(cè)平均合格率為100%，壽光市兩個(gè)種雞場(chǎng)H5亞型禽流感平均合格率79.17%、H9亞型禽流感平均合格率只有39.58%。在不同的種雞場(chǎng)，用相同免疫程序、疫苗和檢測(cè)抗體，卻造成了免疫效果的不同。通過(guò)理論和實(shí)踐分析免疫效果不同的原因，可能有以下幾個(gè)方面：

(1)飼養(yǎng)管理，昌邑市7個(gè)種雞場(chǎng)在日常工作中能夠按照種雞的飼養(yǎng)管理方法來(lái)對(duì)雞場(chǎng)的種雞進(jìn)行飼養(yǎng)管理。平時(shí)能夠及時(shí)地打掃雞舍的衛(wèi)生，能夠按時(shí)對(duì)雞舍進(jìn)行消毒，嚴(yán)格控制種雞場(chǎng)的溫度。而壽光市2個(gè)種雞場(chǎng)在這些方面做得不夠全面，特別是對(duì)于雞舍的按時(shí)消毒。

(2)野毒早期感染或強(qiáng)毒株感染，雞體接種疫苗后需要一定時(shí)間才能產(chǎn)生免疫力，而這段時(shí)間恰恰是一個(gè)潛在的危險(xiǎn)期，一旦有野毒入侵或機(jī)體尚未完全產(chǎn)生抗體之前感染強(qiáng)毒，就導(dǎo)致疾病的發(fā)生，造成免疫失敗。環(huán)境中的病毒超強(qiáng)毒株的存在可能會(huì)使種雞機(jī)體的抗體效價(jià)高于正常標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)壽光市2個(gè)種雞場(chǎng)H5亞型禽流感抗體效價(jià)有10份>12log2，H9亞型禽流感抗體效價(jià)有29份>12log2，推測(cè)壽光市2個(gè)種雞場(chǎng)的種雞有早期感染或強(qiáng)毒感染。

(3)免疫抑制性疾病，昌邑市7個(gè)種雞場(chǎng)在整個(gè)飼養(yǎng)階段種雞沒(méi)有患過(guò)免疫抑制疾病，而壽光市2個(gè)種雞場(chǎng)在前期種雞患過(guò)傳染性法氏囊病，病毒損害了雞的免疫器官法氏囊等，從而導(dǎo)致免疫抑制。特別是傳染性法氏囊病病毒感染可以造成免疫系統(tǒng)的破壞和抑制，從而影響其它傳染病的免疫。在接種禽流感疫苗時(shí)沒(méi)有起到應(yīng)有的作用，致使種雞受到病毒感染。

(4)工作人員操作，工作人員操作不規(guī)范，導(dǎo)致接種的疫苗受到外界環(huán)境中強(qiáng)毒株的污染。在進(jìn)行免疫時(shí)，壽光市2個(gè)種雞場(chǎng)的工作人員沒(méi)有進(jìn)行嚴(yán)格的技術(shù)操作，對(duì)種雞接種疫苗更換雞舍時(shí)，沒(méi)有進(jìn)行嚴(yán)格的消毒，另外疫苗沒(méi)有預(yù)溫，導(dǎo)致疫苗失效。

3.2抗體檢測(cè)方法的比較 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法，比其他血清學(xué)試驗(yàn)敏感性好、特異性高、重復(fù)性好，特別是單克隆抗體技術(shù)和ELISA 技術(shù)的聯(lián)合，成為檢測(cè)病原的良好手段。薛松果通過(guò)配對(duì)試驗(yàn)選擇1C6 和4D5 分別為包被單抗和酶標(biāo)單抗，建立單抗夾心ELISA。同年蔣鳳英等報(bào)道也建立了單抗夾心ELISA，主要用于檢測(cè)雞泄殖腔棉拭子樣品。該方法與HA/HI 試驗(yàn)相比，陽(yáng)性符合率為99.3%，陰性符合率為99.7%，重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)在8%以內(nèi)。該報(bào)道中特別提到，將新鮮的尿囊液凍融一次再進(jìn)行檢測(cè)能很好的減少假陽(yáng)性的發(fā)生，值得平時(shí)在工作中嘗試ELISA 方法檢測(cè)AIV，操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定實(shí)用，特別適合基層獸醫(yī)部門和雞場(chǎng)AIV 進(jìn)行血清學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查[13]。