基于液相芯片篩查與肝癌相關(guān)血清自身抗體的研究

肖 靜，楊 舒，聞 琦，陳子恩，陳嘉童，王徐飛，陳文莉，龍 飛*，彭 濤

(1.廣州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 廣州霍夫曼免疫研究所，呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州511436；2.廣東省人民醫(yī)院 廣東醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所 感染科，廣東 廣州510080)

自身抗體是由于機(jī)體內(nèi)表位擴(kuò)展、性質(zhì)改變或隱蔽抗原釋放等原因所產(chǎn)生的針對(duì)自身正常組織抗原的相應(yīng)抗體，其異常表達(dá)通常與自身免疫性疾病發(fā)生密切相關(guān)。近年來，隨著關(guān)于病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等患者體內(nèi)檢測(cè)到自身抗體的報(bào)道越來越多，自身抗體與肝臟疾病的發(fā)生正逐漸成為近年來的一個(gè)研究熱點(diǎn)[1-2]。本文利用液相芯片技術(shù)制備多重自身抗體液相芯片，對(duì)肝炎、肝硬化、肝癌患者以及正常人的臨床血清進(jìn)行自身抗體檢測(cè)分析，篩查與肝癌相關(guān)的自身抗體，并對(duì)其肝癌診斷的臨床價(jià)值進(jìn)行初步評(píng)估，為今后自身抗體作為肝癌輔助診斷標(biāo)志物提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

肝病臨床血清樣本來源于廣東省人民醫(yī)院2015年12月到2017年12月份收治的患者，均告知患者研究目的并簽署知情同意書。包括40例肝炎患者，其中男30例，女10例，年齡18-78歲；32例肝硬化患者，其中男25例，女7例，年齡22-75歲；48例肝癌患者，其中男40例，女8例，年齡24-83歲；30例健康體檢者作為正常對(duì)照組，其中男19例，女11例，年齡20-84歲。肝癌樣本符合2005版《肝癌診治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，肝炎、肝硬化符合2005版《病毒性肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。同時(shí)收集了南方醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的10例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者的血清樣本驗(yàn)證方法學(xué)，SLE患者均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的分類標(biāo)準(zhǔn)[5]。將收集于血清分離管的全血標(biāo)本室溫放置1 h，然后1000×g離心20 min，取上清分裝至新的EP管中，置于-80℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用Bio-Rad公司液相芯片偶聯(lián)試劑盒得到20種自身抗體偶聯(lián)微球，用分析液(含1% BSA的PBS溶液)將偶聯(lián)微球稀釋混勻至1管，50 μL/孔加入到96孔板，用PBST洗滌2遍。使用樣品稀釋液將臨床血清、質(zhì)控樣本(人源IgG)以及陰性對(duì)照以1∶100 稀釋，50 μL/孔加入到96孔板，37℃避光震蕩1 h，清洗2遍后，加入50 μL/孔生物素標(biāo)記抗人IgG抗體，37℃避光震蕩0.5 h，清洗2遍再加入50 μL/孔SA-PE，37℃避光震蕩15 min，清洗3遍后重懸微球，Bio-Plex 200液相芯片系統(tǒng)讀取熒光值(MFI)。

為避免非特異吸收信號(hào)的干擾，采用特異性結(jié)合指數(shù)(SBI)評(píng)價(jià)自身抗體IgG水平：SBI=(待測(cè)樣本MFI值-陰性對(duì)照MFI值)/(質(zhì)控樣本MFI值-陰性對(duì)照MFI值)[6]。

生化指標(biāo)包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、采用Beckman coulter AU5821全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。甲胎蛋白(AFP)和高爾基蛋白(GP73)采用本實(shí)驗(yàn)室建立的液相芯片聯(lián)合檢測(cè)GP73和AFP體系進(jìn)行測(cè)定[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 多重自身抗體液相芯片檢測(cè)體系驗(yàn)證

利用SLE臨床血清樣本對(duì)所建立的多重自身抗體液相芯片檢測(cè)體系進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，Smith、U1-snRNP作為SLE的血清特異性自身抗體，其在SLE組中顯著高于正常對(duì)照組。與SLE血清相關(guān)的自身抗體，SSA/Ro和La-SSB也表現(xiàn)出在SLE組中顯著高于正常對(duì)照組。而Scl-70、Mi-2、tTG、EJ、TPO、LKM-1這些SLE非特異性自身抗體在SLE組和正常對(duì)照組中則無顯著性差異。說明所建立的檢測(cè)體系結(jié)果可靠(表1)。

表1 正常對(duì)照組與SLE患者自身抗體IgG表達(dá)水平比較分析

2.2 自身抗體在肝炎、肝硬化、肝癌和正常對(duì)照組的表達(dá)水平比較

肝炎、肝硬化、肝癌組的SSA/Ro、tTG、LC1、PR3、Scl-70、Mi-2、MPO、SSA/Ro以及TIF1-γ自身抗體在肝炎、肝硬化、肝癌組中的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組，且肝癌組SSA/Ro顯著高于肝炎和肝硬化組。SP100和P53自身抗體在肝炎、肝癌組中的水平顯著高于正常對(duì)照組，且肝癌組中的水平顯著高于肝炎和肝硬化組。U1-snRNP、GP73、P0和Smith自身抗體在肝癌組中表達(dá)水平顯著性高于正常對(duì)照組以及肝炎和肝硬化組，而肝炎、肝硬化組與正常對(duì)照組無顯著性差異。LKM-1、JO-1、EJ自身抗體在肝癌組的水平顯著高于正常對(duì)照組，而在肝炎和肝硬化組中與正常對(duì)照組、肝癌組相比均無顯著性表達(dá)差異。La-SSB、TPO、AFP自身抗體在肝炎、肝硬化和肝癌中的水平與正常對(duì)照組間無顯著性差異(表2)。

表2 正常對(duì)照組與肝炎、肝硬化和肝癌患者各自身抗體IgG水平比較分析

2.3 自身抗體對(duì)肝癌的診斷價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，SSA/Ro、tTG、LC1、PR3、Scl-70、Mi-2、SP100的ROC自身抗體診斷肝癌的曲線下面積優(yōu)于AFP，其中tTG的靈敏度和特異性最高(表3)。

表3 自身抗體對(duì)肝癌的診斷效率

2.4 肝癌相關(guān)自身抗體與生化指標(biāo)相關(guān)性分析

結(jié)果顯示，肝癌相關(guān)自身抗體之間呈顯著正相關(guān)，生化指標(biāo)之間GGT與ALT、AST、GP73呈顯著正相關(guān)；ALT與AST顯著正相關(guān)；AST與ALB顯著負(fù)相關(guān)；GP73與AFP顯著正相關(guān)；而自身抗體與生化指標(biāo)之間無顯著相關(guān)性(表4)。

表4 肝癌相關(guān)自身抗體與生化指標(biāo)的Spearman相關(guān)性分析

3 討論

目前認(rèn)為持續(xù)的炎癥反應(yīng)、免疫失調(diào)是肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病理機(jī)制之一[8]，肝癌的發(fā)生通常與病毒性肝炎、肝硬化、環(huán)境因素等密切相關(guān)。隨著越來越多報(bào)道，一些慢性肝炎、肝癌患者血清中有異常的自身抗體表達(dá)，認(rèn)為肝病與自身免疫反應(yīng)密切相關(guān)[9-10]。研究認(rèn)為HCV感染會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂可能破壞Ro蛋白等自身抗原的存在環(huán)境，從而引起SSA/Ro、Mi-2和Scl-70等ENA自身抗體大量產(chǎn)生[11]，并且隨著肝炎病情進(jìn)展，ENA抗體陽(yáng)性率可能持續(xù)升高[12]，這與本研究抗SSA/Ro在肝癌中的水平顯著高于肝炎和肝硬化結(jié)果一致，提示SSA/Ro異常表達(dá)可能與肝癌的發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。此外，病毒性肝炎可伴發(fā)周圍神經(jīng)病變，肝外表現(xiàn)可能與血管炎等有關(guān)[13]，進(jìn)而可能引起血管炎相關(guān)的PR3和MPO等自身抗體異常表達(dá)?？筁C1通常被認(rèn)為是自身免疫性肝炎的標(biāo)志物。有研究認(rèn)為抗LC1陽(yáng)性提示AIH患者可能伴隨有其他自身免疫性疾病、重癥肝炎或肝硬化等[14]?？筍P100自身抗體作為原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體，其在肝癌組的水平顯著高于正常對(duì)照及肝炎和肝硬化組，顯示其在肝癌鑒別診斷方面的潛能。此外，值得注意的是本研究發(fā)現(xiàn)作為特異性血清抗體被用于乳糜瀉大規(guī)模高危人群篩查的tTG自身抗體對(duì)肝癌診斷的靈敏度和特異度均很高，表現(xiàn)出良好的肝癌診斷潛在價(jià)值。乳糜瀉可合并自身免疫性肝病，常伴發(fā)肝臟損傷，因此在慢性肝炎、自身免疫性疾病等多種疾病中均有一定抗tTG抗體陽(yáng)性率[15-16]。

此外，相關(guān)性結(jié)果顯示自身抗體之間呈顯著正相關(guān)，說明在肝癌的發(fā)展進(jìn)程中，通常存在多種自身抗體異常表達(dá)的情況，這可能與肝癌發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。在我國(guó)，約70%的肝癌是由病毒感染引起的病毒性肝炎發(fā)展為肝硬化、肝癌，這不僅發(fā)生肝臟的免疫病理?yè)p傷，還可誘發(fā)多種肝外自身免疫現(xiàn)象，引起免疫系統(tǒng)紊亂[17]。而自身抗體與生化指標(biāo)之間無顯著相關(guān)性則提示肝癌發(fā)展進(jìn)程中所引起的肝損傷和肝外系統(tǒng)損傷可能是由不同機(jī)制所致，但其具體機(jī)制和臨床意義有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究利用自身抗體多重檢測(cè)液相芯片體系，篩選到SSA/Ro、tTG、LC1、PR3、Scl-70、Mi-2和SP100自身抗體在肝炎、肝硬化、肝癌中存在異常表達(dá)。這提示在肝癌的發(fā)展進(jìn)程中不僅引起肝功能損傷，還引起患者機(jī)體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致多種自身免疫抗體水平異常表達(dá)。臨床上自身抗體的檢測(cè)有助于了解肝病患者病情狀況，自身抗體異常表達(dá)提示需積極預(yù)防肝癌的發(fā)生。當(dāng)然本研究存在一定局限性，如樣本例數(shù)偏少,樣本類型不多等，后續(xù)還需進(jìn)一步擴(kuò)大驗(yàn)證。