Notch信號通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化加重自身免疫性甲狀腺炎

連小月，張志誠，李晨嫣

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點實驗室，沈陽 110001）

成熟巨噬細(xì)胞能在各種因素誘導(dǎo)下，出現(xiàn)表型和功能的分化，呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性，即極化現(xiàn)象［1］?？煞譃閮纱箢悾航?jīng)典活化型巨噬細(xì)胞M1型和選擇性活化巨噬細(xì)胞M2型［2-3］。如果M1型的巨噬細(xì)胞過表達(dá)，將會損害組織和細(xì)胞的修復(fù)，可能誘發(fā)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展［4-5］。Notch信號通路是調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的主要通路之一［6-7］，由表達(dá)于相鄰細(xì)胞上的Notch受體和配體，以及表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子、下游分子和其他調(diào)節(jié)分子組成。Notch信號通路激活促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化［8-10］。

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）的發(fā)生機(jī)制是困擾眾多研究者的難題。GEERS等［11］發(fā)現(xiàn)Graves’病患者的甲狀腺組織中Notch1、Notch4以及DLL4在甲狀腺細(xì)胞中高表達(dá)，但目前尚無Notch信號通路與AIT的相關(guān)研究。本研究利用碘誘導(dǎo)NOD.H-2h4小鼠AIT模型，探討Notch信號通路和巨噬細(xì)胞極化方向的改變對AIT的影響，進(jìn)而為治療AIT提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 材料

伊紅、蘇木素和中性樹脂均采購自北京試劑公司，二甲苯購自中國化工研究所，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均采購日本TaKaRa公司，抗甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibodies，TgAb）的ELISA試劑盒購自R&D公司，流式標(biāo)記抗體F4/80，CD11c，CD206，紅細(xì)胞裂解液均購自賽默飛公司，小鼠M-CSF刺激因子購自金斯瑞公司，胎牛血清、1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司。

1.2 實驗動物

NOD.H-2h4小鼠購自Jackson Laboratory（美國），其喂養(yǎng)和干預(yù)的方案均根據(jù)中國醫(yī)科大學(xué)對于實驗動物倫理的指南嚴(yán)格執(zhí)行，并獲得中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理：隨機(jī)將4周齡的NOD.H-2h4雌性小鼠（體質(zhì)量20 g）分為無菌水喂養(yǎng)對照組（Control組）和高碘水（0.05%碘化鈉）喂養(yǎng)的AIT模型組（SAT組）。每組動物于4、8、16周不同時間點麻醉處死。

1.3.2 實驗方法：

1.3.2.1 石蠟切片HE染色及AIT的評估 取小鼠的甲狀腺進(jìn)行HE染色，依據(jù)甲狀腺淋巴細(xì)胞浸潤面積對炎癥程度評分。

1.3.2.2 ELISA檢測小鼠血清中TgAb滴度 眼球取血，分離小鼠血清（4 ℃，30 min 8 000g），采取 ELISA試劑盒檢測TgAb。實驗步驟按照說明書進(jìn)行操作。

1.3.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腹腔細(xì)胞中M1/M2亞群 各組小鼠處死后，剪開小鼠腹腔皮膚，將3 mL 5%胎牛血清的1640培養(yǎng)基注射入腹腔，對小鼠腹腔輕輕按壓，持續(xù)2 min，將腹腔中的液體收集至10 mL離心管中，離心棄上清液，加入5 mL紅細(xì)胞裂解液10 min，離心分管。分別避光加入FITC標(biāo)記的F4/80、PE標(biāo)記的CD11c和APC標(biāo)記的CD206。

1.3.2.4 誘導(dǎo)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞 取各個時點小鼠的股骨和脛骨，用大頭針在小鼠長骨兩端打孔，無菌注射器注入10 mL PBS沖洗骨髓內(nèi)細(xì)胞，移入離心管，重復(fù)此步驟3～4次。將收集來的骨髓灌洗液離心棄上清。用3 mL 紅細(xì)胞裂解液，離心，棄上清。調(diào)整細(xì)胞至合適濃度，接種于6孔板中，加入40 ng/mL的集落刺激因子。37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜。于第8天收集細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.2.5 實時定量PCR分析 應(yīng)用TRIzol 試劑（美國Invitrogen公司）按照說明書提取不同時間點小鼠骨髓巨噬細(xì)胞總RNA，并鑒定純度及測定濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent kit RR037A）的說明書，將總RNA的原始濃度稀釋為500 ng/μL，并將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。依據(jù)NCBI中GenBank提供的基因序列信息，應(yīng)用Primer 5及NCBI中BLAST功能，分別設(shè)計出目的基因的上下游引物，由華大股份有限公司合成并純化，其序列見表1。

表1 實時PCR實驗引物序列Tab.1 Sequences of primers used for real-time PCR

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用±s描述，采用t檢驗和one-way ANOVAs進(jìn)行比較。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用M（P25～P75）中位數(shù)及四分位數(shù)間距描述，采用秩和檢驗和χ2檢驗進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清TgAb滴度的變化

SAT組小鼠TgAb分光度（optical density，OD）值在高碘干預(yù)8周和16周后均高于同齡Control組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05和P＜0.01）。而高碘喂養(yǎng)4周的SAT組小鼠TgAb OD值與Control組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異。見表2。

表2 NOD.H-2h4小鼠血清TgAb滴度的變化Tab.2 Changes in serum TgAb titers in NOD.H-2h4 mice

2.2 甲狀腺炎癥狀態(tài)評估

碘誘導(dǎo)4周時，SAT組以及Control組小鼠幾乎均不發(fā)生甲狀腺炎。從第8周開始SAT組出現(xiàn)不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤，較對照組明顯加重，炎癥比例升高，50%以上濾泡破壞嚴(yán)重，纖維化程度較廣，正常甲狀腺濾泡細(xì)胞幾乎不存在，而Control組75%小鼠未見明顯的濾泡增大，淋巴細(xì)胞浸潤。高碘喂養(yǎng)16周后，SAT組小鼠甲狀腺小葉內(nèi)可見濾泡大小不一，濾泡間隙淋巴細(xì)胞浸潤，上皮增生，而Control組小鼠僅有少數(shù)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤，且炎癥程度較低。見表3，圖1。

圖1 光鏡下NOD.H-2h4小鼠甲狀腺炎性評分 ×400Fig.1 Thyroid inflammatory score of NOD.H-2h4 mice under a light microscope ×400

表3 NOD.H-2h4小鼠甲狀腺炎癥評分（%）Tab.3 Thyroid inflammatory score of NOD.H-2h4 mice（%）

2.3 NOD.H-2h4小鼠腹腔中M1和M2的表達(dá)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腹腔中巨噬細(xì)胞群的分布狀況。根據(jù)流式細(xì)胞分析的結(jié)果，在F4/80+巨噬細(xì)胞中，高碘喂養(yǎng)8周和16周后的NOD.H-2h4小鼠SAT組與同齡Control組相比，腹腔M1型巨噬細(xì)胞（F4/80+CD11c+）比例明顯升高，M2型巨噬細(xì)胞（F4/80+CD206+）比例明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0.05）。而高碘喂養(yǎng)4周的NOD.H-2h4小鼠SAT組與同齡對照組相比，M1型和M2型巨噬細(xì)胞的比例并無明顯的上升或下降趨勢，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析NOD.H-2h4小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化群Fig.2 Flow cytometry analysis of the polarized peritoneal macrophage populations in NOD.H-2h4 mice

2.4 NOD.H-2h4小鼠骨髓巨噬細(xì)胞Notch信號通路Notch1、Notch3、Jagged1、Delta1 mRNA的表達(dá)

在高碘喂養(yǎng)8周和16周的SAT組小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中，Notch1、Notch3、Jagged1以及Delta1mRNA 的表達(dá)顯著高于同齡Control組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。但在高碘喂養(yǎng)4周的SAT組和同齡Control組小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中，上述mRNA未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表4。

表4 骨髓巨噬細(xì)胞Notch信號通路相關(guān)分子mRNA的表達(dá)Tab.4 mRNA expression of Notch signaling pathway-related genes in bone marrow macrophages

3 討論

研究［12-13］表明，M1型巨噬細(xì)胞極化增加是自身免疫性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和多發(fā)性硬化動物模型中，都發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)增加，從而加劇炎癥反應(yīng)。相反，通過減少M1型巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)，則可以有效地減輕炎癥反應(yīng)，從而緩解癥狀［14］。

本研究結(jié)果顯示，與正常飲水組相比，高碘飲水8周和16周后，NOD.H-2h4小鼠甲狀腺切片HE染色均出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤。相比于正常飲水的小鼠，在碘誘導(dǎo)的AIT小鼠中，腹腔巨噬細(xì)胞出現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞的極化明顯增加，而M2型巨噬細(xì)胞的極化明顯減少。隨著甲狀腺淋巴細(xì)胞的浸潤程度加重，M1型巨噬細(xì)胞的極化增加，M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)則降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。高碘飲水4周時，NOD.H-2h4小鼠甲狀腺HE切片染色均未出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤，實驗組和對照組的NOD.H-2h4小鼠均未發(fā)生AIT癥，腹腔M1/M2型巨噬細(xì)胞比例處于平衡，未出現(xiàn)上述的改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

在AIT中，巨噬細(xì)胞極化的發(fā)生過程至關(guān)重要。大量研究［15］表明Notch信號通路與炎癥相關(guān)的巨噬細(xì)胞M1型極化密切相關(guān)，抑制巨噬細(xì)胞上Notch信號通路可以抑制其向M1型極化。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型中，巨噬細(xì)胞高表達(dá)Notch1以及其下游靶分子Hes，給予Notch抑制劑后，炎癥浸潤程度降低，炎性細(xì)胞因子表達(dá)減少［16］。本研究也證實了在AIT小鼠中存在Notch信號通路相關(guān)分子的表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，AIT小鼠M1/M2巨噬細(xì)胞的動態(tài)平衡被破壞，極化明顯偏向M1型巨噬細(xì)胞，且隨著炎癥浸潤程度的加重而更加明顯。究其作用機(jī)制可能是通過激活Notch信號通路，增加M1型巨噬細(xì)胞極化，加重AIT。總而言之，本研究為AIT研究提供新的思路，有利于進(jìn)一步闡明AIT的發(fā)病機(jī)制。