ZNF568基因表達(dá)聯(lián)合DNA甲基化分析與食管癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)

劉雙，林征，俞凱莉，陳輝林，饒雯清，胡志堅(jiān)

（1.福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，福州 350122；2.泉州市安溪縣醫(yī)院放療科，福建 泉州 352400）

我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，2017 年《國家癌癥中 心最新研究報(bào)告》報(bào)道，食管癌發(fā)病率為14.09/10萬，居我國腫瘤發(fā)病第五位［1］。盡管治療技術(shù)在不斷改進(jìn)［2］，但患者總體預(yù)后仍然較差［3］。鋅指蛋白（zinc finger protein，ZNF）是最大的DNA結(jié)合蛋白家族，ZNF DNA結(jié)合域通常與核酸酶或其他效應(yīng)蛋白融合介導(dǎo)表觀遺傳反應(yīng)［4］，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究［5］發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因低表達(dá)與胃癌不良預(yù)后相關(guān)，可作為判斷腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物。然而，目前尚無ZNF568基因表達(dá)聯(lián)合DNA甲基化與食管癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)研究。因此，本研究通過聯(lián)合分析癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化與食管癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)，為食管癌預(yù)后的預(yù)測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)下載與預(yù)處理

通過TCGA數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)（https：//portal.gdc.cancer.gov），下載食管癌DNA甲基化數(shù)據(jù)、基因表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)，使用Perl腳本進(jìn)行注釋，并對注釋后的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。

1.2 癌細(xì)胞系百科全書（Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)下載

通過CCLE數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)（https：//portals.broadinstitute.org/ccle/），下載食管癌ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化數(shù)據(jù)，驗(yàn)證ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化之間的關(guān)聯(lián)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R軟件中的limma包對DNA甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行芯片歸一化處理，并對食管癌癌組織與癌旁組織進(jìn)行DNA甲基化差異分析；使用edgeR包分析食管癌癌組織與癌旁組織ZNF568基因的表達(dá)情況；篩選條件為錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR ）=0.05，fold change=1。ZNF568基因表達(dá)水平與DNA甲基化的關(guān)聯(lián)分析使用Spearman 秩相關(guān)。采用 Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，通過 log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行生存曲線的比較；使用Cox回歸模型對ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化與食管癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)進(jìn)行單因素和多因素分析，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）和95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。建立預(yù)測Cox回歸分析模型列線圖，內(nèi)部驗(yàn)證采用Bootstrap法，采用一致性指數(shù)（C指數(shù)）評價模型準(zhǔn)確度。本研究使用R軟件（3.5.3）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性檢驗(yàn)為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫食管癌癌組織和癌旁組織ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化差異分析

采用R軟件中的limma包對186例食管癌癌組織和16例癌旁組織進(jìn)行ZNF568DNA甲基化差異分析，發(fā)現(xiàn)ZNF568基因在癌組織中的甲基化水平高于癌旁組織（FDR＜0.001）；采用edgeR包對159例食管癌癌組織與10例癌旁組織進(jìn)行ZNF568基因表達(dá)差異分析，發(fā)現(xiàn)ZNF568基因在癌旁組織中的表達(dá)水平高于癌組織（FDR ＜0.001）。見圖1。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中食管癌癌組織和癌旁組織ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化Fig.1 ZNF568 gene expression and DNA methylation in esophageal cancerous and paracancerous tissues in the Cancer Genome Atlas database

2.2 DNA甲基化與基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)分析

對159例癌組織中ZNF568基因表達(dá)水平與DNA甲基化進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因表達(dá)水平與DNA甲基化存在負(fù)相關(guān)（P＜0.001），見圖2。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中ZNF568基因表達(dá)水平與DNA甲基化的關(guān)聯(lián)分析Fig.2 Correlation analysis of ZNF568 gene expression level and DNA methylation in TCGA database

2.3 CCLE數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證ZNF568基因表達(dá)水平與DNA甲基化的關(guān)聯(lián)性

下載CCLE數(shù)據(jù)庫中食管癌細(xì)胞系（17種食管癌細(xì)胞株）ZNF568基因表達(dá)、DNA甲基化數(shù)據(jù)，Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因表達(dá)水平與DNA甲基化存在負(fù)相關(guān)（P=0.002），見圖3。

圖3 CCLE 數(shù)據(jù)庫中ZNF568基因表達(dá)水平與DNA甲基化的關(guān)聯(lián)分析Fig.3 Correlation analysis of ZNF568 gene expression level and DNA methylation in the Cancer Cell Line Encyclopedia database

2.4 聯(lián)合分析ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化與食管癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)

Kaplan-Meier法繪制的生存曲線和log-rank檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化與食管癌生存無關(guān)聯(lián)（P=0.059，圖4）。調(diào)整性別、年齡、分化程度和TNM分期后，多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因表達(dá)水平和DNA甲基化聯(lián)合分析與食管癌預(yù)后存在關(guān)聯(lián)，ZNF568基因高表達(dá)、DNA低甲基化能改善食管癌預(yù)后（HR=0.70，95%CI：0.51～0.96，P=0.043），見表1。

圖4 ZNF568基因表達(dá)水平和DNA甲基化聯(lián)合分析與食管預(yù)后的生存曲線Fig.4 Kaplan-Meier overall survival curves according to combined ZNF568 gene expression and DNA methylation

表1 ZNF568基因表達(dá)水平和DNA甲基化聯(lián)合分析與食管癌預(yù)后的相關(guān)性Tab.1 Analyses of combined ZNF568 gene expression and DNA methylaiton in relation to overall survival

2.5 構(gòu)建ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化聯(lián)合分析的列線圖

使用多因素Cox回歸分析的變量構(gòu)建列線圖（圖5），ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化聯(lián)合分析能很好地預(yù)測食管癌預(yù)后，C指數(shù)為0.697（95%CI：0.543～0.851）。

圖5 ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化聯(lián)合分析預(yù)測食管癌總生存的列線圖Fig.5 Nomogram for overall survival according to combined ZNF568 gene expression and DNA methylation

3 討論

TCGA是一個國際項(xiàng)目，收集了高質(zhì)量的腫瘤和正常組織樣本，并在多個高通量平臺上進(jìn)行了分子分析，收錄了各種人類腫瘤的基因組變異、mRNA表達(dá)、DNA甲基化、臨床信息等數(shù)據(jù)［6］。在大數(shù)據(jù)時代的背景下，生物信息學(xué)分析利用如TCGA數(shù)據(jù)庫等高通量數(shù)據(jù)庫，在腫瘤的全面研究中發(fā)揮了重要作用。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析食管癌DNA甲基化和基因表達(dá)的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因高表達(dá)、DNA低甲基化能改善食管癌預(yù)后，使用ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化聯(lián)合分析構(gòu)建的列線圖能很好地預(yù)測食管癌預(yù)后，C指數(shù)為0.697，說明ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化聯(lián)合分析可作為預(yù)測食管癌預(yù)后的標(biāo)志物。

ZNF是最大的DNA結(jié)合蛋白家族，可作為真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子，并通過特征性鋅指結(jié)構(gòu)域選擇性結(jié)合靶基因啟動子中的特定DNA序列［7-8］。ZNF DNA結(jié)合域通常與核酸酶或其他效應(yīng)蛋白融合介導(dǎo)表觀遺傳反應(yīng)［4］。不同腫瘤的研究［9］已經(jīng)證明宿主DNA高甲基化導(dǎo)致腫瘤抑制基因沉默，而低甲基化區(qū)域與癌基因的表達(dá)增加。目前，尚無ZNF568基因表達(dá)聯(lián)合DNA甲基化與食管癌預(yù)后的研究，但ZNF家族基因DNA甲基化和基因表達(dá)與腫瘤預(yù)后已有研究報(bào)道。使用TCGA數(shù)據(jù)庫，ZHANG等［10］發(fā)現(xiàn)，ZNF726基因低表達(dá)能改善結(jié)腸癌的預(yù)后（HR=0.55，95%CI：0.34～0.89），使用CCLE數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步評估結(jié)腸癌細(xì)胞中ZNF726基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)甲基化的調(diào)節(jié)對ZNF726基因起重要作用。此外，在肺鱗狀細(xì)胞癌的研究［11］中發(fā)現(xiàn)，ZNF454基因是肺鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后相關(guān)的甲基化驅(qū)動基因，通過聯(lián)合分析ZNF454基因表達(dá)和DNA甲基化的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ZNF454基因低表達(dá)、DNA高甲基化能改善肺鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后（P＜0.05）；對肺鱗狀細(xì)胞癌ZNF454甲基化驅(qū)動基因進(jìn)行通路分析，發(fā)現(xiàn)ZNF454基因主要作用的途徑為“通用轉(zhuǎn)錄”“ RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄”和“基因表達(dá)”，提示ZNF454基因表達(dá)和DNA高甲基化存在關(guān)聯(lián)。以上的研究說明ZNF家族基因甲基化與腫瘤預(yù)后存在關(guān)聯(lián)，可作為判斷腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物。

目前，僅有一篇研究報(bào)道了ZNF568基因表達(dá)與胃癌的關(guān)聯(lián)，WANG等［5］使用TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因等5個基因是胃癌的突變基因，ZNF568基因低表達(dá)與胃癌預(yù)后存在關(guān)聯(lián)（P＜0.05），ZNF568基因表達(dá)可作為預(yù)測胃癌預(yù)后的標(biāo)志物。然而，目前尚無ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化與腫瘤預(yù)后的相關(guān)研究。本研究通過使用TCGA數(shù)據(jù)庫，聯(lián)合分析ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因高表達(dá)、DNA低甲基化與食管癌預(yù)后相關(guān)；構(gòu)建ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化聯(lián)合分析的列線圖，結(jié)果顯示，使用該基因能很好地預(yù)測食管癌的預(yù)后（C指數(shù)為0.697），說明ZNF568基因表達(dá)和DNA甲基化聯(lián)合分析可用于預(yù)測食管癌預(yù)后。與經(jīng)典遺傳學(xué)改變不同，甲基化修飾的過程動態(tài)可逆［12］，因此，抑制ZNF568DNA甲基化作用可使上調(diào)ZNF568基因重新表達(dá)，這一特性也為食管癌的臨床治療提供新的思路。

綜上所述，ZNF568基因高表達(dá)、DNA低甲基化與食管癌預(yù)后相關(guān)，檢測食管癌ZNF568基因表達(dá)水平和DNA甲基化程度有助于判斷食管癌的預(yù)后。