李潤洲,周欣
(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科,沈陽 110004)
卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,致死率居婦科惡性腫瘤首位[1-2]。卵巢癌患者早期無明顯癥狀,約3/4的卵巢癌患者首次確診即為晚期,預(yù)后不良[3]。因此,深入研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制,并在此基礎(chǔ)上尋找卵巢癌相關(guān)的分子標志物,對提高卵巢癌的診治水平及改善患者的預(yù)后具有重要意義。
ACAP1(ADP-ribosylation factor GTPase-activating proteins with coiled-coil,ankyrin repeat and PH domains 1)是ACAP家族成員之一,屬于GTP酶激活蛋白(GTPase-activating proteins,GAPs),可調(diào)節(jié)GTP結(jié)合蛋白ADP核糖基化因子-6(ADP-ribosylation factor 6,ARF6)的功能。ARF6在內(nèi)吞、分泌、吞噬、細胞黏附和遷移中起調(diào)節(jié)作用[4-8]。ACAP1是ARF6特異性的GAP,可以與ARF6共同參與多種細胞功能的調(diào)節(jié)。ACAP1還能調(diào)節(jié)整合素內(nèi)循環(huán),從而調(diào)節(jié)細胞遷移[9-14]。研究[15]表明,泛素特異性蛋白酶6(ubiquitin-specific protease 6,USP6)表達下調(diào)可能通過影響ARF6/ACAP1依賴的途徑抑制細胞增殖和胞質(zhì)分裂。ACAP1可能與多種疾病相關(guān)[16-23],但它與卵巢惡性腫瘤關(guān)系的研究較少。因此,本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測ACAP1在卵巢漿液性囊腺癌組織及正常卵巢組織中的表達情況,分析其與卵巢癌患者臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián),并初步探討ACAP1在卵巢惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能的作用機制。
通過Oncomine網(wǎng)站(http://www.oncomine.org)分析ACAP1mRNA水平與卵巢癌的相關(guān)性[24];通過cBioportal網(wǎng)站(http://www.cbioportal.org)分析卵巢癌中ACAP1基因突變的類型[25];通過GeneMANIA網(wǎng)站(http://www.genemania.org)分析ACAP1相關(guān)信號通路以及相互作用蛋白[26]。
收集中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院2012年9月至2015年9月手術(shù)切除且病理診斷為卵巢漿液性囊腺癌的癌組織88例,其中,配對卵巢癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶組織67例,因良性病變切除的卵巢組織16例。納入標準:術(shù)前未經(jīng)任何治療;術(shù)后病理確診為卵巢漿液性囊腺癌。排除標準:術(shù)前經(jīng)過放化療或靶向治療;轉(zhuǎn)移性卵巢癌;有其他腫瘤病史。本研究獲得中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院倫理委員會批準。
主要試劑包括抗ACAP1多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),兔SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。取標本蠟塊制5 μm厚連續(xù)切片,應(yīng)用EliVision 二步法進行免疫組化染色,依次行烤片、二甲苯脫臘、梯度乙醇水化、抗原修復(fù)、PBS緩沖液沖洗、抗體孵育、DAB顯色、流水沖洗和蘇木素復(fù)染等步驟,最終以中性樹膠封片。根據(jù)著色強度及陽性細胞百分比進行半定量評分。光鏡下每張切片隨機選取10個高倍視野。先根據(jù)著色強度進行評分:無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。再根據(jù)陽性細胞百分比評分:陽性細胞百分比≤25%為1分,>25%~50%為2分,>50%~75%為3分,>75%為4分。2項評分相乘,每張切片所有視野評分取平均值,1~2分為(-),3~4分為(+),5~8分為(++),9~12分為(+++)。將5~12分定義為高表達。
采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用t檢驗比較ACAP1表達的組間差異。采用χ2檢驗進行ACAP1表達水平與臨床病理因素間的關(guān)系分析。采用Kaplan-Meier分析探討ACAP1在卵巢癌原發(fā)灶中的表達水平與總生存期的關(guān)系。采用Cox 回歸對影響卵巢癌預(yù)后的臨床病理因素進行單因素及多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
應(yīng)用Oncomine 網(wǎng)站分析ACAPsmRNA在不同癌癥中的表達情況(圖1,表1),比較卵巢癌中的7個數(shù)據(jù)集[27-32],其中2個數(shù)據(jù)集結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。ADIB 等[27]比較16例卵巢漿液性囊腺癌與4例卵巢癌組織,發(fā)現(xiàn)ACAP1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達上調(diào)(P=0.019,fold change=1.389)。BONOME等[30]比較185例卵巢癌組織與10例卵巢組織,發(fā)現(xiàn)ACAP1在卵巢癌組織中表達上調(diào)(P=1.9e-4,fold change=1.268)。
表1 ACAP1 在卵巢癌組織中的表達情況Tab.1 The expression of ACAP1 in ovarian cancer
圖1 ACAPs mRNA在不同癌癥中的表達情況Fig.1 Expression levels of ACAPs mRNA in various cancers
應(yīng)用cBioportal網(wǎng)站檢測4個ACAP家族成員,發(fā)現(xiàn)存在不同程度的基因變異,ACAP1、ACAP2、ACAP3、ACAP4均存在基因的重復(fù)及缺失,ACAPs總變異率為29.85%,其中最多的基因變異為重復(fù),變異率為28.13%(數(shù)據(jù)集:TCGA,F(xiàn)irehose Legacy)。見圖2。
圖2 ACAPs的基因變異率分析Fig.2 The analyses of genetic variations of ACAPs
應(yīng)用GeneMANIA 網(wǎng)站繪制ACAP家族基因相互作用圖,同時分析互作蛋白的功能,見圖3。與ACAP家族關(guān)系最密切的5個基因是GULP1(engulfment adaptor PTB domain containing 1)、ARF6、RAB11FIP3(RAB11 family interacting protein 3)、SLC2A4(solute carrier family 2 member 4)、VAMP3(vesicle associated membrane protein 3)。GULP1與ACAP1及ARF6存在通路上的聯(lián)系。ARF6與ACAP1、ACAP2存在通路關(guān)系,與ACAP4存在物理互作。這些互作蛋白主要參與肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)及胞內(nèi)體回收等功能。
圖3 ACAPs 基因互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.3 The gene-gene interaction network of ACAPs
免疫組化結(jié)果表明,ACAP1 蛋白主要在細胞質(zhì)中表達,它在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達水平(5.4±1.9)高于正常卵巢組織(3.3±1.1),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),見圖4、圖5。
圖4 ACAP1在正常卵巢組織、卵巢癌原發(fā)灶及卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中的表達情況Fig.4 The expression of ACAP1 in normal ovarian tissues,primary ovarian carcinoma and metastatic lesion of ovarian cancer
圖5 ACAP1在正常卵巢組織與卵巢癌組織中的表達情況Fig.5 The expression of ACAP1 in normal ovarian tissues and ovarian carcinoma
根據(jù)免疫組化結(jié)果評分,將88例卵巢癌分為ACAP1低表達組(-/+)及ACAP1高表達組(++/+++),應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示,在年齡、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移、腹水量等方面,ACAP1高表達組與低表達組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。
表2 ACAP1表達與臨床病理因素的關(guān)系Tab.2 Relationships between ACAP1 expression in ovarian serous carcinoma and clinicopathological factors
本研究對88例卵巢漿液性癌患者進行隨訪,隨訪時間截止至2020年4月30日,實際隨訪85例,失訪3例,隨訪率為97%。應(yīng)用IBM SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示,ACAP1在卵巢癌原發(fā)灶中的高表達與患者的不良預(yù)后相關(guān)(P=0.037)。見圖6。
圖6 ACAP1在卵巢漿液性囊腺癌原發(fā)灶中的表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系Fig.6 Correlations of ACAP1 expression with the prognosis of patients with serous ovarian carcinoma
免疫組化結(jié)果顯示,ACAP1在卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中的表達水平(7.7±2.0)明顯高于原發(fā)灶(5.5±1.8),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
以隨訪死亡或隨訪結(jié)束為觀察終點,計算患者總生存期(overall survival OS),應(yīng)用Cox回歸模型進行卵巢癌預(yù)后相關(guān)因素的單因素及多因素分析。單因素分析結(jié)果提示,ACAP1的表達(P=0.041)、腹水量(P=0.003)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)、FIGO分期(P=0.001)與患者OS顯著相關(guān)。多因素分析結(jié)果提示,F(xiàn)IGO分期(P=0.031)是影響卵巢漿液性囊腺癌預(yù)后的獨立危險因素。見表3。
表3 卵巢癌預(yù)后的單因素及多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate Cox regression analysis of the OS of patients with serous ovarian carcinoma
卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,致死率居女性生殖系統(tǒng)腫瘤之首[1]。大多數(shù)卵巢癌患者一經(jīng)確診即為晚期,晚期(Ⅲ~Ⅳ期)患者5年生存率僅為30%~40%,而早期(Ⅰ~Ⅱ期)患者5年生存率可達70%[33-34]。因此,深入研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制,尋找新的診治靶點,對改善卵巢癌患者預(yù)后具有重要意義。本研究通過生物信息學分析及免疫組化實驗,探討了ACAP1在卵巢癌組織中的表達情況,并對其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制進行初步探討。
免疫組化結(jié)果顯示,ACAP1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達水平明顯高于正常卵巢組織,提示ACAP1過表達可能與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。有研究[15]表明,敲除ACAP1可抑制細胞增殖及胞質(zhì)分裂,提示ACAP1可能參與胞質(zhì)分裂過程,結(jié)合本研究結(jié)果,提示ACAP1過表達可能通過促進胞質(zhì)分裂過程而促進細胞增殖,從而促進卵巢癌的發(fā)生。ACAP1是ARF6的特異性GAP[35],2007年MA等[7]在細胞水平驗證了ACAP1過表達可以降低ARF6-GTP的水平,而過表達GULP1可部分抑制ACAP1的這種作用。本研究通過GeneMANIA 網(wǎng)站構(gòu)建ACAP1蛋白互作圖,結(jié)果提示,ACAP1與GULP1存在信號通路及物理互作關(guān)系,提示ACAP1可能通過GULP1-ACAP1-ARF6通路促進卵巢癌的發(fā)生。
本研究還發(fā)現(xiàn),ACAP1在卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中的表達水平高于卵巢癌原發(fā)灶,提示ACAP1可能參與卵巢癌的腹腔轉(zhuǎn)移進程。有研究[9-10]通過細胞實驗證明敲除ACAP1可抑制細胞遷移,ACAP1被Akt磷酸化后可影響β1整合素內(nèi)循環(huán),從而促進細胞遷移,提示ACAP1可能通過促進細胞遷移而促進卵巢癌的發(fā)展。腫瘤細胞的免疫浸潤及腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[36-37]。2020年ZHANG等[20]應(yīng)用多個生物信息學網(wǎng)站分析ACAP1與卵巢癌腫瘤免疫浸潤的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ACAP1與TILs正相關(guān),ACAP1的表達與多種免疫抑制因子、免疫激活因子、趨化因子相關(guān);通過GSEA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)ACAP1與免疫檢查點相關(guān);通過Kaplan-Meier plotter 網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn),ACAP1高表達與卵巢癌患者預(yù)后不良有關(guān)。該研究認為,ACAP1與卵巢癌細胞的免疫浸潤及腫瘤微環(huán)境相關(guān)。還有研究[19]發(fā)現(xiàn),ACAP1可能是決定膀胱尿路上皮癌免疫浸潤水平的候選基因。以上均表明ACAP1可能與腫瘤細胞的免疫浸潤及腫瘤微環(huán)境相關(guān),ACAP1可能通過相似的機制促進卵巢癌的腹腔轉(zhuǎn)移。
本研究中,對88例卵巢癌患者進行術(shù)后隨訪,以探討ACAP1在卵巢癌原發(fā)灶中的表達與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示,ACAP1在卵巢癌原發(fā)灶中的高表達與不良預(yù)后相關(guān),但ACAP1的表達與患者的年齡、腫瘤分期、CA125水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移情況及腹膜轉(zhuǎn)移情況無明確相關(guān)性。提示ACAP1有可能是影響卵巢癌預(yù)后的獨立危險因素,但多因素分析結(jié)果未能證實此結(jié)論,這可能與研究樣本數(shù)量偏小有關(guān),今后有必要進一步擴大樣本量進行分析。
綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)ACAP1蛋白在卵巢漿液性囊腺癌組織中呈高表達,在卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移灶中的表達高于原發(fā)灶,原發(fā)灶中ACAP1高表達與患者的不良預(yù)后相關(guān),提示ACAP1可能參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展進程,并可能成為卵巢癌診治的潛在靶點。生物信息學分析結(jié)果提示,ACAP1可能通過GULP1-ACAP1-ARF6通路促進卵巢癌的發(fā)生。