用Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)對(duì)血友病B家系F9基因行突變分析及產(chǎn)前診斷

劉安，馬定遠(yuǎn)，劉剛，林穎，李璃，許爭(zhēng)峰，鐘天鷹

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院&南京市婦幼保健院a.產(chǎn)前診斷中心，b.檢驗(yàn)科，南京210004)

血友病B(hemophilia B, HB)是一種X連鎖隱性遺傳性出血性疾病，其發(fā)病機(jī)制為凝血因子Ⅸ(coagulation factor Ⅸ, FⅨ)的編碼基因F9缺陷所導(dǎo)致的凝血功能障礙[1]。在男性人群中HB的發(fā)病率為1/30 000；女性血友病患者罕見(jiàn)，通常為攜帶者[2]。根據(jù)癥狀的輕重及凝血因子Ⅸ活性(factor Ⅸ coagulant activity, FⅨ:C)，臨床上將HB分為輕型(FⅨ:C 5%～40%)、中型(FⅨ:C 1%～5%)和重型(FⅨ:C<1%)。HB的主要表現(xiàn)為出血，出血部位為皮膚黏膜、關(guān)節(jié)、肌肉及深部組織器官，可危及生命[3]。目前臨床上尚無(wú)有效的根治方法，患者主要以輸注FⅨ制劑或新鮮全血的替代治療為主。因此，開(kāi)展F9基因診斷、攜帶者篩查及產(chǎn)前診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[1,3]。本研究應(yīng)用Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)對(duì)11個(gè)HB家系進(jìn)行F9基因突變分析，以期明確遺傳病因，為進(jìn)一步指導(dǎo)妊娠提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2014年2月至2018年10月于南京市婦幼保健院遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷門(mén)診就診的11個(gè)HB家系，其中家系3有3例患者。13例患者在本院或者外院診斷為HB，其中11例患者在本院進(jìn)行了基因診斷，其余2例患者在外院進(jìn)行基因診斷。對(duì)11個(gè)家系中的女性成員進(jìn)行攜帶者篩查，并為7個(gè)家庭提供了產(chǎn)前診斷。家系成員非近親結(jié)婚，染色體核型和微陣列檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異?；蚩截悢?shù)變異，并對(duì)其進(jìn)行Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序檢測(cè)以尋找致病基因及位點(diǎn)。本研究獲得南京市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(寧婦倫字[2019]-KY086)，患者本人或患兒家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要儀器及試劑 Lab-Aid 820核酸提取儀(廈門(mén)致善公司)，ABI A3500Dx基因分析儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。血液DNA提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)，Lab-Aid核酸(DNA)分離試劑盒(廈門(mén)致善公司)，21-三體和性染色體多倍體檢測(cè)試劑盒(廣州達(dá)安基因公司)。Ion AmpliSeq Library Kit 2.0試劑盒、Ion PGM Sequencing 200試劑盒、Ion OneTouch系統(tǒng)、Ion Torrent 316芯片及Ion Torrent PGM測(cè)序儀均由美國(guó)Life technologies 公司提供，Sanger測(cè)序試劑和配套儀器由美國(guó)Applied Biosystems公司提供，PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自南京諾唯贊公司，SALSA mLPAPO95染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒(荷蘭MRC Holland公司)。

1.3標(biāo)本采集和DNA提取 采集所有受檢者就診時(shí)EDTA-K2抗凝的新鮮靜脈血2 mL；按照全血DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取外周血基因組DNA；采用羊膜腔穿刺術(shù)采集胎兒羊水樣本10 mL，2 000×g離心，PBS洗滌2次，按照Lab-Aid核酸(DNA)分離試劑盒說(shuō)明書(shū)提取胎兒羊水細(xì)胞DNA。所得樣本濃度均>10 ng/μL，總DNA量>2.0 μg，吸光度(A260/A280 nm)值為1.8～2.0，外周血、羊水細(xì)胞沉淀與基因組DNA樣本均置于-20 ℃保存。

1.4羊水標(biāo)本母體污染檢測(cè)及胎兒性別鑒定 按照21-三體和性染色體多倍體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增胎兒及其父母基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)A3500Dx基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，對(duì)7個(gè)STR位點(diǎn)(D21S11、D21S1411、D21S1435、DXS6809、DXS981、X22和AMXY)進(jìn)行分析，排除母體DNA污染并確定親源關(guān)系。采用SALSA MLPA P095染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒對(duì)胎兒基因組DNA進(jìn)行多重連接依賴(lài)探針擴(kuò)增(multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA)分析，參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以判斷胎兒性別。

1.5Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序 Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[5]進(jìn)行。文庫(kù)構(gòu)建：采用Ion AmpliSeq Library Kit 2.0試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物加入序列標(biāo)簽及測(cè)序接頭，制備的文庫(kù)平均片段大小約為300 bp；乳液PCR和ISPs富集：采用Ion PGM Xpress Template 200試劑盒在Ion OneTouch系統(tǒng)上進(jìn)行乳液PCR，對(duì)模板陽(yáng)性磁珠顆粒(Ion Sphere Particles，ISPs)在Ion OneTouch ES模塊上進(jìn)行富集；Ion Torrent測(cè)序：采用Ion PGM Sequencing 200試劑盒及Ion Torrent 316芯片在Ion Torrent PGM測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，用Ion Torrent Suite v3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)提取、參考基因組(UCSC hg19)序列比對(duì)及SNVs和Indels提取。

1.6生物信息學(xué)分析 通過(guò)dbSNP137(http://www.bioinfo.org.cn/relative/dbSNP%20Home%20Page.htm)、Genome Aggregation Database(http://gnomad-old.broadinstitute.org/)、the 1000 Genomes Project(http://www.internationalgenome.org/)等數(shù)據(jù)庫(kù)獲得變異的最小等位基因頻率，SIFT(http://sift.jcvi.org/)、Mutation Taster(http：//www.mutationtaster.org)、Polyphen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)及CADD(http：//cadd.gs.washington.edu/等軟件進(jìn)行危害性預(yù)測(cè)，再結(jié)合HGMD、NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)[6]，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG，2015)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行致病性判斷。

1.7Sanger測(cè)序 對(duì)F9基因(NM_000133.4)突變位點(diǎn)進(jìn)行家系驗(yàn)證。使用NCBI在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)PCR引物，由蘇州金唯智公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括25 μL PCR mix，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min，共35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智公司測(cè)序驗(yàn)證。

表1 Sanger測(cè)序驗(yàn)證引物序列

2 結(jié)果

2.1各HB家系基因突變檢測(cè)結(jié)果 13例HB患者均存在F9基因致病性突變，共發(fā)現(xiàn)10種突變，其中錯(cuò)義突變7種，無(wú)義突變2種，整碼突變1種。Sanger 測(cè)序結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果完全一致，結(jié)果見(jiàn)圖1。基于先證者的突變位點(diǎn)，對(duì)11個(gè)家系中的20名女性受檢者進(jìn)行攜帶者篩查檢測(cè)，其中15例女性為F9基因突變攜帶者，其突變類(lèi)型及檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 11例家系HB患者及女性成員F9基因突變檢測(cè)結(jié)果

注：A，患者P1a的Sanger測(cè)序結(jié)果，箭頭示c.128G>A突變；B，患者P2a的Sanger測(cè)序結(jié)果，箭頭示c.128G>A突變; C，患者P3a的Sanger測(cè)序結(jié)果，箭頭示c.190T>C 突變; D，患者P4a的Sanger測(cè)序結(jié)果，箭頭示c.343T>C突變; E，患者P5a的Sanger測(cè)序結(jié)果，箭頭示c.356G>A突變;F，患者P6a的Sanger測(cè)序結(jié)果，箭頭示c.454A>T突變; G，患者P7a的Sanger測(cè)序結(jié)果，箭頭示c.677G>A突變; H，患者P8a的Sanger測(cè)序結(jié)果，箭頭示c.688G>A突變; I，患者P9a的Sanger測(cè)序結(jié)果，箭頭示c.892C>T突變; J，患者P10a的Sanger測(cè)序結(jié)果，箭頭示c.1220G>A突變; K，患者P11a 的Sanger測(cè)序結(jié)果，箭頭示c.1130_1132del突變。

2.2產(chǎn)前診斷結(jié)果 依據(jù)F9基因檢測(cè)結(jié)果，對(duì)7個(gè)家系中的高危胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，其中為6個(gè)家庭提供了1次產(chǎn)前診斷，1個(gè)家庭孕婦兩次妊娠，并提供了2次產(chǎn)前診斷，羊膜腔穿刺術(shù)后無(wú)出血、感染、流產(chǎn)及胎死宮內(nèi)等并發(fā)癥。8例胎兒中1例為半合子突變，判斷其罹患HB，經(jīng)遺傳咨詢，胎兒家屬選擇終止妊娠。2例為雜合突變，為HB女性攜帶者，5例不攜帶母源致病突變，為正常胎兒。

3 討論

人F9基因定位于Xq27.1，全長(zhǎng)約為34 000 bp，由8個(gè)外顯子和7例內(nèi)含子組成，編碼461個(gè)氨基酸的FⅨ[8]。F9基因突變類(lèi)型多種多樣，且無(wú)明顯的突變熱點(diǎn)，其中點(diǎn)突變占73.1%，其中單個(gè)堿基的突變約占80%，點(diǎn)突變的錯(cuò)義突變約占64%，無(wú)義突變約占15 %[9]。

在本研究中，13例HB患者共發(fā)現(xiàn)10種突變，其中錯(cuò)義突變7種，無(wú)義突變2種，整碼突變1種，錯(cuò)義突變發(fā)生率占70%，是F9基因的主要突變方式，與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的結(jié)果基本相符。本研究發(fā)現(xiàn)有3種突變發(fā)生在第8外顯子，約占30%，該區(qū)域發(fā)生突變的頻率較高，提示第8外顯子是FIX基因的突變高發(fā)區(qū)[10]，P10a患者c.1220G>A導(dǎo)致407位上的半胱氨酸被酪氨酸取代，P11a患者c.1130_1132del使377位上的纈氨酸缺失，突變均發(fā)生在絲氨酸蛋白酶催化區(qū)域，使FIX蛋白催化活性降低，影響其在FX向FXa的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮功能，而P9a患者c.892C>T導(dǎo)致298位上的精氨酸突變?yōu)榻K止密碼子，使FIX蛋白多肽鏈合成提前終止，無(wú)義突變產(chǎn)生縮短的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入血液循環(huán)。此外，第2外顯子編碼前肽區(qū)域，通過(guò)形成谷氨?；然傅慕Y(jié)合位點(diǎn)觸發(fā)γ-羧基谷氨酸區(qū)(GLA區(qū)域)的羧化，進(jìn)而形成與磷脂結(jié)合的部位；第4外顯子編碼與鈣離子結(jié)合的表皮樣生長(zhǎng)因子1區(qū)(EGF-1區(qū)域)部位，第2號(hào)、第4號(hào)外顯子突變發(fā)生率也稍高[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，有3種(30%)突變類(lèi)型發(fā)生在CpG位點(diǎn)，這進(jìn)一步證實(shí)了CpG二核苷酸是人類(lèi)生殖細(xì)胞FIX熱點(diǎn)突變位點(diǎn)[9]。同時(shí)，筆者還發(fā)現(xiàn)有3種(30%)突變類(lèi)型導(dǎo)致精氨酸密碼子發(fā)生改變，這可能是由于精氨酸密碼子中的胞嘧啶因甲基化容易發(fā)生脫氨基作用，變成胸腺嘧啶或腺嘌呤，從而導(dǎo)致精氨酸突變?yōu)槠渌?lèi)型的氨基酸[12]。然而，由于本研究中的樣本量較少，無(wú)法進(jìn)行HB臨床表型與基因型的相關(guān)性分析，需要后期在更大樣本量的研究中進(jìn)行分析驗(yàn)證。

經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，筆者發(fā)現(xiàn)1種新突變(c.343T>C, p.Tyr115His)，且未見(jiàn)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道，該位點(diǎn)不位于CpG二核苷酸。PolyPhen軟件和SIFT 軟件預(yù)測(cè)該突變表型均為有害突變。同一位點(diǎn)多個(gè)其他類(lèi)型的突變(p.Tyr115Asn，p.Tyr115Ser和p.Tyr115Cys)被報(bào)道可致病[13-15]。根據(jù)ACMG原則，判定該突變?yōu)榭梢芍虏⊥蛔兾稽c(diǎn)。根據(jù)家屬要求，基于此突變位點(diǎn)進(jìn)行產(chǎn)前基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)胎兒不攜帶該突變，選擇繼續(xù)妊娠，在后續(xù)的隨訪中新生兒表型無(wú)異常。研究發(fā)現(xiàn)，約10%～15%的F9基因突變女性攜帶者也可表現(xiàn)出血癥狀，這主要是由于女性的1條X染色體隨機(jī)失活導(dǎo)致的[16]。在本研究的15例女性F9基因突變攜帶者中，有1例(6.7%，1/15)表現(xiàn)為HB癥狀。有血友病癥狀的女性F9基因突變攜帶者比例略低于其他文獻(xiàn)報(bào)道，這可能與本研究中樣本量較少有關(guān)。

基于Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、通量大的優(yōu)勢(shì)，可有效檢測(cè)出點(diǎn)突變和微小缺失重復(fù)，再對(duì)檢測(cè)出的致病突變用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，可建立有效可靠的F9基因檢測(cè)方法，便于臨床應(yīng)用及推廣。本研究中的13例HB患者經(jīng)基因測(cè)序均發(fā)現(xiàn)F9基因突變的存在，并發(fā)現(xiàn)了F9基因新的突變類(lèi)型。綜上所述，本研究不僅豐富了F9基因的突變譜，還對(duì)臨床進(jìn)行F9基因突變的攜帶者的產(chǎn)前診斷具有一定的指導(dǎo)意義。