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    榆梔止血顆粒調(diào)控PI3K-Akt通路對(duì)子宮出血大鼠的保護(hù)作用*

    2021-10-28 07:37:04池曉蓉陳德招王趙偉李敏姜艷玲
    西部醫(yī)學(xué) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:棉球涼血子宮出血

    池曉蓉 陳德招 王趙偉 李敏 姜艷玲

    (1.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,福建 廈門 361000;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科,福建 福州 350001;3.中國(guó)制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 臨沂 276006)

    子宮出血是指與月經(jīng)無(wú)關(guān)的子宮異常出血,是臨床常見(jiàn)的婦科疾病[1-2]。子宮異常出血可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜病變、貧血甚至不孕等,其發(fā)病率較高,嚴(yán)重危害女性生命健康[3-4]。子宮出血機(jī)制復(fù)雜,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),子宮出血與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡、血管生成障礙、胞外基質(zhì)異常及激素水平異常等子宮局部微環(huán)境改變有關(guān)[5-6]。而磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B (Protein kinase B,Akt)可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡,且與血管生成關(guān)系密切[7-8],但PI3K-Akt通路在子宮出血病理過(guò)程中的調(diào)控作用研究較少。中醫(yī)藥在治療子宮出血方面有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì),榆梔止血顆粒(Yuzhi Zhixue Granule,YZZXKL)原名婦科止血顆粒,具有清熱涼血、調(diào)經(jīng)止血,臨床上常用于治療血熱所致的月經(jīng)過(guò)多,有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)在早孕子宮出血癥方面止血效果較好[9]。然而YZZXKL治療子宮出血的具體機(jī)制還不明確,這不利于YZZXKL的推廣和應(yīng)用,本研究通過(guò)建立大鼠子宮出血模型并設(shè)置PI3K-Akt通路抑制劑對(duì)此進(jìn)行研究,以期闡明PI3K-Akt通路在YZZXKL治療子宮出血中的作用,為臨床合理用藥及中醫(yī)藥走向國(guó)際化提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)同遺傳背景SD大鼠,體重 260~280 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2018-0002。所有大鼠于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件:自然光照,自由飲食、飲水,溫度25 ℃,相對(duì)濕度50%,噪音低于80分貝,保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本試驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),試驗(yàn)動(dòng)物符合3R原則。

    1.1.2 主要試劑及儀器 YZZXKL(成藥組成:地榆、梔子、墨旱蓮、黃芩、茜草、貫眾、槐花、蒲黃、拳參、大薊、丹皮、白芍、側(cè)柏葉(炒炭)、仙鶴草、當(dāng)歸等,批號(hào):2003L01364,由山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司生產(chǎn),規(guī)格:10 g/袋,國(guó)藥準(zhǔn)字Z20130019);蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin Staining,HE)染色試劑盒(貨號(hào):LMO105,廠家:上海聯(lián)邁生物工程有限公司);米非司酮(貨號(hào):10412,購(gòu)自北京凱瑞基生物科技有限公司);米索前列醇片(貨號(hào):RK170327,購(gòu)自深圳市洛克生化科技有限公司);血清雌二醇(E2)、孕酮(P)酶聯(lián)免疫(Enzyme linked immunosorbent assay,ELSA)試劑盒(貨號(hào):YE01847、YE01938,均購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司);PI3K抗體、Akt磷酸化p-Akt抗體、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1)、(貨號(hào)分別為:ab39307、ab38449、ab19956、ab32152、ab134184,均購(gòu)自美國(guó)abcam公司);BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶(貨號(hào)分別為P0768,P0231,均購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司)。手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(型號(hào)RM2125RTS,德國(guó)Leica公司);光學(xué)顯微鏡(型號(hào)SMZ745,日本尼康公司);蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)1659001、Trans-Blot SD,美國(guó)Bio-Rad公司);凝膠成像儀(型號(hào):GIS-500,Miulab公司)等。

    1.2 方法

    1.2.1 大鼠子宮出血模型建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)[9]建立大鼠子宮出血模型,具體操作方法為:將健康雌性SD大鼠80只、雄性大鼠40只,按2∶1比例合籠飼養(yǎng),于第2天8∶00進(jìn)行陰道涂片檢查,以發(fā)現(xiàn)精子為妊娠第1天,取妊娠大鼠60只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Normal組)、模型組(Model組)、YZZXKL低(4 g/kg)、高(16 g/kg)劑量組、PI3K/Akt通路抑制劑LY294002組(LY組,0.3 mg/kg)、YZZXKL+LY組(16 g/kg+0.3 mg/kg),各組10只。除Normal組外,其余各組大鼠均于妊娠第7天8∶00和18∶00時(shí)分別灌服米非司酮(13.8 mg/kg)和米索前列醇(135 μg/kg)復(fù)制子宮出血模型,并于大鼠陰道置于棉球,若次日取出棉球觀察,若棉球上有血,表明造模成功;Normal組于相同時(shí)間灌胃給予等量生理鹽水。各組大鼠均于造模成功后(妊娠第8 d)開(kāi)始給藥,YZZXKL參照文獻(xiàn)[9]及人與動(dòng)物等效劑量換算設(shè)置低、高劑量組,并用生理鹽水稀釋成0.4、1.6 g/mL的混懸液,LY294002參照文獻(xiàn)[10]用DMSO溶液配制為0.03 mg/mL的混懸液,YZZXKL低、高劑量組按10 mL/kg的劑量灌胃給予相應(yīng)濃度的YZZXKL混懸液;LY組按10 mL/kg的劑量腹腔注射給予相應(yīng)濃度的LY294002混懸液;YZZXKL+LY組按10 mL/kg的劑量灌胃給予YZZXKL混懸液和腹腔注射給予LY294002混懸液;Normal組和Model組均按10 mL/kg的劑量灌胃給予生理鹽水,并腹腔注射給予DMSO溶液。各組連續(xù)給藥7 d,1次/d。

    1.2.2 大鼠陰道出血量(UBQ)測(cè)定 各組大鼠均參照文獻(xiàn)[9]在給藥期間(妊娠第8 d~14 d)于陰道內(nèi)置入重量為75~80 mg棉球一個(gè)(塑料薄膜包裹半側(cè),以防血液漏出和尿液返流),次日分別于8∶00和18∶00將棉球取出,放入塑料袋中密閉冷藏保存,同時(shí)置換一個(gè)新棉球于陰道內(nèi),觀察陰道出血情況。將各組大鼠每天收集的子宮出血棉球分別置于燒杯內(nèi),根據(jù)出血量的情況加適量50 g/L NaOH浸泡擠壓、搓洗棉球血漬,浸洗后的溶液倒入一燒杯內(nèi)保存。并用50 g/L NaOH浸洗3~4次,收集所有浸洗液,混勻,并記錄所用50 g/L NaOH總體積,取5 mL浸提液過(guò)濾,取4 mL濾液,作為試驗(yàn)管。用血紅蛋白吸管,吸取大鼠尾靜脈血0.02 mL,加入50 g/L NaOH溶液4 mL,混勻作為空白對(duì)照管。將空白管和對(duì)照管在546 nm波長(zhǎng)記錄吸光度(A)值,根據(jù)公式子宮出血量(mL)=0.02×浸提液A值×浸提子宮血所用NaOH總體積(mL)/空白管A值/4,計(jì)算陰道出血量(UBQ)。

    1.2.3 大鼠血液指標(biāo)檢測(cè)及子宮組織標(biāo)本采集 各組大鼠在末次給藥24 h后,用3%戊巴比妥鈉麻醉,取頸總動(dòng)脈血6 mL (不加抗凝劑),全血以3000 r/min離心10 min,取上層血小板血漿 (PPP)用半自動(dòng)凝血分析儀按照凝血四項(xiàng)說(shuō)明書測(cè)定凝血四項(xiàng),另取全血2 mL,靜置30 min后以 3000 r/min 離心10 min,取上清液按ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清E2、P含量。處死大鼠,取子宮組織,剪取0.5 g子宮內(nèi)膜組織,用組織勻漿器勻漿、離心分離后取上清液于-20 ℃冰箱保存;剩余子宮組織,迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 HE染色觀察子宮組織形態(tài)變化 取1.2.3于4%多聚甲醛中固定的子宮內(nèi)膜組織,進(jìn)行常規(guī)透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm的切片。按HE試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色,置于顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化。

    1.2.5 Western blot法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-1、bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取1.2.3于-20 ℃冰箱保存的子宮內(nèi)膜組織勻漿液,于4 ℃冰箱中解凍后,用蛋白提取試劑盒提取蛋白,蛋白定量BCA試劑盒檢測(cè)蛋白總濃度后,取50 μg蛋白上樣,進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng),TBST溶液清洗后,加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h,TBST溶液清洗3次后,加入一抗(PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-1、bFGF、稀釋倍數(shù)分別為1∶1000)、β-actin(內(nèi)參,稀釋倍數(shù)為1:2000)抗體,4 ℃搖床室溫孵育過(guò)夜,TBST振洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)1∶2000),37 ℃搖床室溫孵育1 h,TBST清洗3次后,采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,以凝膠成像儀觀察條帶并拍照,并以Image-J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠UBQ及血清激素E2、P含量檢測(cè)結(jié)果 與Normal組相比,Model組和YZZXKL+LY組大鼠UBQ明顯增高 (P<0.05),E2、P含量均降低(P<0.05)。與Model組和YZZXKL+LY組相比,YZZXKL低、高劑量組大鼠大鼠UBQ均明顯降低(P<0.05),E2、P含量均升高 (P<0.05),且YZZXKL各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性;而LY組大鼠UBQ明顯增高 (P<0.05),E2、P含量均降低 (P<0.05)。Model組和YZZXKL+LY組相比,上述指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 各組大鼠UBQ及血清激素E2、P含量比較Table 1 Comparison of UBQ,E2 and P contents in serum of rats in each group

    2.2 各組大鼠凝血指標(biāo)TT、PT、APTT及FIB檢測(cè)結(jié)果 與Normal組相比,Model組和YZZXKL+LY組大鼠TT、PT、APTT均明顯升高 (P<0.05),F(xiàn)IB降低 (P<0.05)。與Model組和YZZXKL+LY組相比,YZZXKL低、高劑量組大鼠TT、PT、APTT均明顯降低 (P<0.05),F(xiàn)IB升高 (P<0.05),且YZZXKL各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性;而LY組大鼠TT、PT、APTT均明顯升高 (P<0.05),F(xiàn)IB降低 (P<0.05)。Model組和YZZXKL+LY組相比,上述指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2。

    表2 各組大鼠TT、PT、APTT及FIB比較Table 2 Comparison of TT,Pt,APTT and FIB of rats in each group

    2.3 各組大鼠子宮組織HE染色結(jié)果 Normal組大鼠子宮組織結(jié)構(gòu)正常。與Normal組相比,Model組和YZZXKL+LY組大鼠子宮內(nèi)膜固有層間質(zhì)細(xì)胞增生、血管擴(kuò)張、間質(zhì)纖維化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。與Model組和YZZXKL+LY組相比,YZZXKL低、高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜組織固有層基質(zhì)細(xì)胞略有增生,可見(jiàn)少量新生血管生成,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。而LY組大鼠子宮內(nèi)膜上皮柱狀細(xì)胞變性壞死,凋落,固有層纖維樣變性和增生及血管擴(kuò)張嚴(yán)重,可見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)至肌層,見(jiàn)圖1。

    圖1 各組大鼠子宮組織HE染色圖(400×)Figure 1 HE staining of uterus in each group

    2.4 各組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)結(jié)果 與Normal組相比,Model組和YZZXKL+LY組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低 (P<0.05),MMP-2蛋白表達(dá)升高 (P<0.05)。與Model組和YZZXKL+LY組相比,YZZXKL低、高劑量組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF相對(duì)表達(dá)水平均升高 (P<0.05),MMP-2蛋白表達(dá)降低 (P<0.05),且YZZXKL各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性;而LY組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低 (P<0.05),MMP-2蛋白表達(dá)升高 (P<0.05)。Model組和YZZXKL+LY組相比,上述指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3、圖2。

    圖2 各組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)免疫印跡圖Figure 2 Western blotting of PI3K,p-Akt,eNOS,VEGF and MMP-2 protein expression in uterine tissue of rats in each group注:A.Normal組;B.Model組;C.YZZXKL+LY組;D.YZZXKL低劑量組;E.YZZXKL高劑量組;F.LY組

    表3 各組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)比較 Table 3 Comparison of PI3K,p-Akt,eNOS,VEGF,MMP-2 protein expression in uterine tissue of rats in each group

    3 討論

    子宮異常出血是臨床常見(jiàn)、多發(fā)的疑難病癥,其中功能性子宮出血是子宮異常出血中最常見(jiàn)類型[11]。米非司酮聯(lián)合米索前列醇誘導(dǎo)早孕大鼠子宮出血是子宮出血?jiǎng)游锬P妥畛R?jiàn)和穩(wěn)定的造模方法[12]。本研究用上述方法復(fù)制大鼠子宮出血模型,結(jié)果提示用米非司酮聯(lián)合米索前列醇復(fù)制大鼠子宮出血模型后,Model組大鼠陰道出血增多,凝血時(shí)間延長(zhǎng),激素水平紊亂并伴隨子宮內(nèi)膜炎癥和微環(huán)境改變,與文獻(xiàn)[13-14]子宮出血模型指標(biāo)變化一致,表明造模成功。

    中醫(yī)藥在治療子宮出血方面有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[15],YZZXKL方中君藥炒地榆涼血瀉熱、收斂止血,旱蓮草入肝經(jīng)血分而涼血止血,為治血熱出血之要藥,二者相伍,清熱涼血止血,直中病機(jī)。臣藥梔子清三焦之火而清熱涼血,側(cè)柏葉和槐花入血分清血熱,而涼血止血;蒲黃可活血、收斂、止血,為活血行滯之要藥,且對(duì)崩漏不止效果較好;四者炒制可入血分而清熱涼血、收斂止血,并能輔助君藥清熱涼血。佐藥:仙鶴草、拳參、大薊、陳棕炭為清熱止血佳品,且入血分而止血甚佳;丹皮與紅茜草可涼血、止血、活血之功,可防苦寒滯留、除瘀;生地養(yǎng)陰生津,涼血止血;白芍柔肝斂陰而治熱盛津傷;黃芩、貫眾苦寒,直折其火。當(dāng)歸調(diào)經(jīng)止血,為婦科之良藥,與白芍、生地共伍,可養(yǎng)血而除煩,與蒲黃、丹皮同用,可理氣行滯,和血止痛,且當(dāng)歸性溫能散,味甘能緩,體潤(rùn)能補(bǔ),引諸藥以入沖任,共奏清熱涼血止血,調(diào)經(jīng)止血之功。尹艷艷等[9]發(fā)現(xiàn)YZZXKL即婦科止血顆粒對(duì)早孕大鼠子宮出血具有較好的治療作用。本研究結(jié)果提示YZZXKL低、高劑量組大鼠陰道出血減少,凝血時(shí)間降低,激素水平升高,子宮內(nèi)膜病變減輕且有新生血管生成,表明YZZXKL可提高子宮異常出血大鼠凝血功能、抑制子宮出血量,對(duì)異常出血子宮有一定的保護(hù)作用。然而其保護(hù)作用具體機(jī)制還不甚明確,本研究對(duì)此進(jìn)行繼續(xù)探究,以期為YZZXKL走向國(guó)際化提供理論依據(jù)。

    子宮異常出血機(jī)制復(fù)雜,近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜血管生成障礙是造成子宮出血的主要原因之一[6]。岳明等[13]發(fā)現(xiàn)激素可使子宮局部微環(huán)境發(fā)生改變,促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮和血管再生,是徹底終止子宮出血的重要機(jī)制,其中血管生成受到VEGF等不同生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)。MMPs可參與新生血管、胚胎形成以及傷口愈合[16],黃琪等[17]發(fā)現(xiàn)黃芩炭可通過(guò)升高VEGF和降低MMP-2、MMP-9表達(dá),降低早孕大鼠子宮出血量。本研究結(jié)果表明Model組大鼠子宮出血可能與VEGF降低和MMP-2表達(dá)升高有關(guān)。Nasirzadehd等[18]發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt-eNOS通路可參與血管生成。PI3K激活后可與Akt結(jié)合并促進(jìn)Akt磷酸化,激活的AKT可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜,通過(guò)磷酸化作用激活eNOS促進(jìn)其合成一氧化氮(nitricoxide,NO),進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成、增殖和防止血栓形成[19]。儲(chǔ)佳佳等[20]發(fā)現(xiàn)柚皮苷可通過(guò)激活PI3K-Akt-eNOS通路,減輕高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷。本研究結(jié)果提示Model組大鼠子宮組織PI3K-Akt-eNOS通路被抑制,YZZXKL降低大鼠子宮出血量的作用,可能是通過(guò)激活PI3K-Akt-eNOS通路蛋白表達(dá),促進(jìn)子宮組織血管生成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論,本研究設(shè)置PI3K-Akt通路抑制劑LY研究,結(jié)果表明PI3K抑制劑可阻滯YZZXKL對(duì)PI3K/Akt通路的激活作用,減弱其對(duì)子宮出血大鼠的保護(hù)作用。進(jìn)一步提示YZZXKL對(duì)異常出血的保護(hù)作用可能通過(guò)激活PI3K-Akt-eNOS通路實(shí)現(xiàn)。

    4 結(jié)論與啟示

    YZZXKL可提高子宮異常出血大鼠凝血功能和激素水平,改善出血情況,可能通過(guò)激活PI3K-Akt-eNOS通路,促進(jìn)血管生成實(shí)現(xiàn)。為闡明YZZXKL治療子宮出血機(jī)制提供了一定參考價(jià)值。但PI3K-Akt-eNOS通路,促進(jìn)血管生成抑制出血的機(jī)制十分復(fù)雜,且中藥治療疾病具有多靶點(diǎn)、多途徑的作用,YZZXKL還可能通過(guò)其他途徑抑制子宮出血,有待后續(xù)深入研究。

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