潘春勤 周學(xué)才 杜鵬舉 劉杰
(長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院 1.腎病內(nèi)科;2.心血管內(nèi)科,湖北 仙桃 433000)
糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥,是導(dǎo)致其死亡的主要原因,DN的特征是:腎小球硬化、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)增多、間質(zhì)纖維化[1-2],ECM和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是促纖維化因子,TGF-β1可以誘導(dǎo)DN的ECM沉積和腎小管上皮細(xì)胞的EMT發(fā)生[4]。Smad是TGF-β1下游基因,抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路可以抑制EMT和腎間質(zhì)纖維化[5]。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(Runt-related transcription factor 3,RUNX3)屬于矮結(jié)構(gòu)域家族,在腎細(xì)胞癌中RUNX3可以靶向miR-6780a-5p /E-cadherin /EMT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸,抑制腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲[6]。目前關(guān)于DN中TGF-β/Smad/RUNX3通路發(fā)揮作用的報(bào)道較少,本研究通過(guò)觀察在DN大鼠中TGF-β、Smad、RUNX3表達(dá)變化,探究TGF-β/Smad/RUNX3通路在DN大鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT中的作用。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取6周齡SPF級(jí)Wistar雄性健康大鼠45只,體重120 g左右,由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠的處理符合動(dòng)物倫理要求,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)。
1.2 主要試劑及儀器 吡非尼酮(pirfenidone,PFD)(貨號(hào):53179-13-8)購(gòu)自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司;鏈脲佐菌素(貨號(hào):V900890-1G)購(gòu)自SIGMA公司;白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒(貨號(hào):ml063132)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒(貨號(hào):ml02828)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技公司;兔單克隆α-平滑肌肌蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(貨號(hào):SAB5500002)、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)、兔多克隆TGF-β1抗體(貨號(hào):SAB4503751)、Smad3抗體(貨號(hào):SAB4300564)、Smad4抗體(貨號(hào):HPA019154)、RUNX3抗體(貨號(hào):SAB2107939)購(gòu)自德國(guó)Merck公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(HRP)的山羊抗兔二抗(貨號(hào):BHR101)購(gòu)自北京博爾西科技有限公司;酶聯(lián)免疫分析儀(型號(hào):EVO75)購(gòu)自澳大利亞Techan公司;超低溫冰箱(型號(hào):MDF-U32V)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;生物顯微鏡(型號(hào):Eclipse E200)購(gòu)自日本尼康公司;凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào):GelDoc EZ)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。
1.3 方法
1.3.1 DN大鼠模型構(gòu)建及分組 將45只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分成三組:對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組,每組各15只。實(shí)驗(yàn)組和模型組參考文獻(xiàn)[7]構(gòu)建DN大鼠模型,大鼠用高脂高糖飼料飼養(yǎng)1個(gè)月,造模前禁食12 h后,腹腔注射鏈脲佐菌素45 mg/kg,72 h后采集大鼠尾靜脈血,血糖值>16.6 mmol /L,尿蛋白含量>30 mg/24 h,則DN大鼠模型構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)組大鼠用TGF-β抑制劑PFD(250 mg/kg/d)灌胃,對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水,連續(xù)灌胃6周。
1.3.2 標(biāo)本采集 末次給藥后,留取24 h尿液,稱(chēng)取其體積后備用;腹腔注射10%水合氯醛麻醉,采集腹主動(dòng)脈血10 mL,一部分用于測(cè)血糖含量,一部分離心后分離血清備用;處死各組大鼠,取其腎臟組織,剪取約0.5 g用于提取組織蛋白,儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中備用,剩余腎臟組織用4%多聚甲醛溶液固定,做常規(guī)石蠟切片,備用。
1.3.3 各組大鼠生化指標(biāo)檢測(cè) 用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠24 h尿蛋白、血尿素氮及血肌酐含量,血糖儀檢測(cè)其血糖含量。
1.3.4 各組大鼠腎臟組織病理變化觀察 將腎臟組織切片脫蠟至水化,過(guò)碘酸希夫(Periodic acid schiff,PAS)染色和天狼星紅(Sirius Red,SR)染色,脫水,透明,封片,鏡下觀察腎臟組織病理形態(tài)學(xué)變化。SR染色檢測(cè)腎間質(zhì)沉積物平均光密度,可反映腎間質(zhì)纖維化程度。
1.3.5 各組大鼠血清中炎性因子水平檢測(cè) 取血清,用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法分別檢測(cè)IL-1β、IL-6表達(dá)水平,具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。
1.3.6 各組大鼠腎臟組織α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、Smad3、Smad4、RUNX3蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 提取腎臟組織蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白濃度,調(diào)整上樣蛋白至50 μg,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,轉(zhuǎn)膜,加一抗(α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、Smad3、Smad4、RUNX3、GAPDH,1∶1000),4 ℃孵育過(guò)夜,次日,加二抗(1∶5000)室溫孵育2 h,洗膜,加ECL發(fā)光液,用Bio-Rad成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白灰度信號(hào),以GAPDH為內(nèi)參照,Image J軟件定量分析蛋白表達(dá)情況。
2.1 各組大鼠生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比,模型組大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白、血糖、血尿素氮、血肌酐濃度顯著升高 (P<0.05);與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐濃度顯著降低 (P<0.05)。見(jiàn)表1。
表1 各組大鼠生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較Table 1 Comparison of the detection results of the biochemical indexes of rats in each group
2.2 各組大鼠腎臟組織病理變化 PAS染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整無(wú)顯著病理變化;模型組大鼠腎小管及上皮結(jié)構(gòu)損傷、腎小管肥大增生,腎間質(zhì)有炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)現(xiàn)象;與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組腎小管肥大減輕,炎癥細(xì)胞減少。SR染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠腎組織無(wú)膠原纖維沉積;模型組較對(duì)照組大鼠腎組織有大量膠原纖維沉積 (P<0.05);實(shí)驗(yàn)組較模型組大鼠腎組織膠原纖維沉積顯著減少 (P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。
表2 各組大鼠腎組織膠原纖維沉積結(jié)果Table 2 Results of collagen fiber deposition in kidney tissue of rats in each group
圖1 各組大鼠腎組織PAS、SR染色(標(biāo)尺50 μm)Figure 1 PAS and SR staining diagrams of rat kidney tissues in each group
2.3 各組大鼠血清中炎性因子水平檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比,模型組大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6表達(dá)量顯著升高 (P<0.05);與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6表達(dá)量顯著降低 (P<0.05)。見(jiàn)表3。
表3 各組大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6表達(dá)量比較Table 3 Comparison of expression levels of inflammatory factors IL-1β and IL-6 in serum of rats in each group
2.4 各組大鼠腎臟組織α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組相比,模型組大鼠腎臟組織α-SMA蛋白表達(dá)量顯著升高 (P<0.05),E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低 (P<0.05);與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織α-SMA蛋白表達(dá)量顯著降低 (P<0.05),E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高P<0.05)。見(jiàn)圖2、表4。
表4 各組大鼠腎臟組織α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of the expression levels of α-SMA and E-cadherin proteins in the kidney tissues of rats in each group
圖2 各組大鼠腎臟組織α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)Figure 2 The expression of α-SMA and E-cadherin protein in kidney tissues of rats in each group
2.5 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4、RUNX3蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組相比,模型組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)量顯著升高 (P<0.05),RUNX3蛋白表達(dá)顯著降低 (P<0.05);與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)量顯著降低 (P<0.05),RUNX3蛋白表達(dá)顯著升高P<0.05)。見(jiàn)圖3、表5。
圖3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4、RUNX3蛋白表達(dá)Figure 3 The protein expression of TGF-β1,Smad3,Smad4,and RUNX3 in rat kidney tissues of each group
表5 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4、RUNX3蛋白表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of TGF-β1,Smad3,Smad4 and RUNX3 protein expression levels in rat kidney tissues of each group
DN是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因,其發(fā)病率和死亡率逐年增加,對(duì)人們的生命健康和生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重危害,DN主要病理變化是腎小球硬化增大、基底膜增厚、腎間質(zhì)纖維化等[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,模型組大鼠腎小管及上皮結(jié)構(gòu)損傷、腎小管肥大增生,腎間質(zhì)有炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和大量膠原纖維的沉積,大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白、血糖、血尿素氮、血肌酐濃度顯著升高,與吳建波等[10]研究結(jié)果一致,表明DN大鼠模型構(gòu)建成功,DN發(fā)生引起腎功能損傷。TGF-β是促纖維化因子,有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種亞型,其中TGF-β1主要在腎臟中表達(dá),其對(duì)腎臟功能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有重要作用,PFD是TGF-β抑制劑[11]。本研究發(fā)現(xiàn),與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠腎小管肥大減輕,炎癥細(xì)胞減少,腎組織膠原纖維沉積顯著減少、24 h尿量、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐濃度顯著降低,與謝菲菲等[12]研究結(jié)果一致,提示抑制TGF-β表達(dá)可以減少腎纖維化,改善DN大鼠腎功能。
大量研究表明,隨著DN進(jìn)程的發(fā)展,炎癥是影響腎功能衰退的重要因素[13-14]。IL-1β主要由被激活的單核巨噬細(xì)胞合成和分泌,IL-6是一種多功能的炎性因子。何春蘭等[15]研究顯示,DN大鼠體內(nèi)IL-1β、IL-6等炎性因子釋放增加,抑制其釋放對(duì)DN大鼠有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,模型組大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6表達(dá)量顯著升高,提示DN發(fā)生引起機(jī)體炎性因子分泌紊亂。Zhang等[16]研究顯示,抑制TGF-β1、TNF-α和IL-1β過(guò)表達(dá),可以減少炎癥,改善腎纖維化和腎臟的病理變化。本研究發(fā)現(xiàn),與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6表達(dá)量顯著降低,提示抑制TGF-β表達(dá)可以減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)。
EMT是腎小管上皮細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過(guò)程,主要發(fā)生在腎臟的近端區(qū),是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化、腎功能喪失的關(guān)鍵因素[17]。E-cadherin、α-SMA是EMT的標(biāo)志物,在維持腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,模型組大鼠腎臟組織α-SMA蛋白表達(dá)量顯著升高,E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低,與張亞等[18]研究結(jié)果一致,提示DN發(fā)生促進(jìn)EMT和腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。Wang等[19]研究顯示,TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT在DN的腎纖維化發(fā)生發(fā)展中起著主導(dǎo)作用,抑制TGF-β1可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和纖維生成。本研究發(fā)現(xiàn),與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠腎組織α-SMA蛋白表達(dá)量顯著降低,E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高,提示抑制TGF-β表達(dá)可影響DN中EMT和纖維生成。
Smads蛋白的作用主要是將信號(hào)從胞膜受體中轉(zhuǎn)移至核內(nèi),TGF-β及其受體和Smads蛋白構(gòu)成了TGF-β/Smad經(jīng)典的信號(hào)通路,TGF-β1與腎小管上皮細(xì)胞受體結(jié)合,使下游Smad3磷酸化后與Smad4形成復(fù)合物作用靶基因,參與EMT和腎纖維化進(jìn)程[20]。RUNX3通過(guò)調(diào)控EMT與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。鄭傳銘等[21]研究顯示,RUNX3可以抑制人腺樣囊性癌細(xì)胞的EMT,抑制腺樣囊性癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。Gou等[22]研究顯示,RUNX3通過(guò)靶向miR-186 /E-cadherin /EMT途徑抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲,為肝癌患者的有效預(yù)后指標(biāo)和治療靶標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn),與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)量顯著降低,RUNX3蛋白表達(dá)量顯著升高,提示DN大鼠中抑制TGF-β1表達(dá)可影響Smad3、Smad4、RUNX3蛋白表達(dá),推測(cè)TGF-β抑制劑可能通過(guò)抑制TGF-β/Smad通路激活,促進(jìn)RUNX3蛋白表達(dá),抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT和腎間質(zhì)纖維生成。
在DN大鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT過(guò)程中,TGF-β抑制劑可通過(guò)抑制TGF-β/Smad通路激活促進(jìn)RUNX3表達(dá),減少DN大鼠腎間質(zhì)纖維化、促炎因子分泌,抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT發(fā)展,改善DN病理癥狀,但TGF-β/Smad對(duì)RUNX3基因的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。