丹參酚酸B對間歇性高糖乳鼠雪旺細胞損傷的改善*

王蒙 王倩倩 孫連慶

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，陜西 西安 710061)

高血糖引起的血管病變是導(dǎo)致糖尿病患者出現(xiàn)各種慢性并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)[1-2]。糖尿病患者體內(nèi)主要存在穩(wěn)定性高血糖及間歇性高血糖這兩種狀態(tài)，近年研究表明間歇性高血糖較穩(wěn)定性高血糖更容易對靶器官造成損傷[3-5]。雪旺細胞是糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN)的主要靶細胞，作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，對雪旺細胞的保護無疑是治療DPN的重要手段。我們通過前期研究發(fā)現(xiàn)丹參酚酸 B(salvianolic acid B,Sal B)可以抑制高糖誘導(dǎo)的雪旺細胞凋亡[6-7]。在此基礎(chǔ)上，本研究以體外培養(yǎng)的乳鼠雪旺細胞為模型，進一步探討丹參酚酸B對間歇性高糖狀態(tài)下雪旺細胞的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取出生3～5 d清潔級Wistar乳鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2009-0007]。實驗過程符合動物倫理要求，并嚴格按照西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會批準的實驗方案進行。

1.1.2 主要試劑與儀器 流式細胞儀(美國BD公司)；丹參酚酸B(天津馬克生物有限公司)；MTT(美國Sigma公司)；兔抗鼠S-100抗體、HRP標記二抗(北京中杉金橋公司)；雙氫-乙酰乙酸二氯熒光黃(DCFH-DA,美國Molecular Probes公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1,北京嘉美生物)；丙二醛(MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶 (SOD)測定測試盒(南京建成生物有限公司)；TUNEL凋亡檢測試劑盒(美國Roche公司)；兔抗鼠anti-bcl-2、anti-bax、anti-AIF(美國Santa Cruz公司)，兔抗鼠anti-caspase-9、anti-caspase-3(美國CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 雪旺細胞的培養(yǎng)、純化及鑒定 脫頸處死后的乳鼠經(jīng)75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下分離坐骨神經(jīng)，組織貼塊法及差速貼壁法進行培養(yǎng)并去除混雜的成纖維細胞，G-418純化后S-100抗體鑒定。選擇生長良好的第3代雪旺細胞進行實驗。

1.2.2 Sal B藥物濃度篩選 待對數(shù)生長期細胞均勻鋪滿96孔板底面后，以不同濃度Sal B(6.25、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L)處理細胞，空白對照組為不加Sal B的細胞，每組5～6 個復(fù)孔。MTT法計算不同濃度Sal B對雪旺細胞的抑制率。選擇細胞生長形態(tài)最好，活力最佳且抑制率最低的3個Sal B濃度(25、50及100 μmol/L)進行后續(xù)實驗。

1.2.3 實驗分組與處理 根據(jù)前期工作基礎(chǔ)選擇50 mM葡萄糖及48 h作為高糖濃度及干預(yù)時間[7]。無血清培養(yǎng)基同步化處理細胞后進行分組：①正常葡萄糖對照組(con組)：5.6 mmol/L葡萄糖。②穩(wěn)定性高糖組(HG組)：50 mmol/L葡萄糖。③間歇性高糖組(IHG組)：5.6 mmol/L葡萄糖與50mmol/L葡萄糖交替培養(yǎng)，每8 h換液1次。④間歇性高糖加不同濃度的Sal B處理組，使Sal B濃度分別為25、50及100 μmol/L。

1.2.4 MDA含量、SOD活性測定 收集各組細胞培養(yǎng)液，離心取上清，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.2.5 細胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)檢測 各組細胞懸浮于熒光探針DCFH-DA(10 μmol/L)中，每3～5 min顛倒混勻。以流式細胞儀測定的各組細胞平均熒光強度代表ROS水平。

1.2.6 線粒體膜電位(MMP)檢測 JC-1熒光探針進行檢測，流式細胞儀以激發(fā)波490 nm,發(fā)射波530 nm及激發(fā)波525 nm,發(fā)射波590 nm檢測細胞的紅綠熒光強度，通常以紅綠熒光的相對比例來衡量MMP高低。

1.2.7 細胞凋亡檢測 多聚賴氨酸包被蓋玻片上培養(yǎng)的各組細胞，多聚甲醛固定，TritonX-100打孔，加入TUNEL反應(yīng)液避光孵育。DAB顯色，鏡下觀察，出現(xiàn)棕黃色顆粒即終止反應(yīng)。雪旺細胞核呈深棕黃色圓形或橢圓形顆粒者為陽性，每組隨機選5個視野，通過凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)計算凋亡率。

1.2.8 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白 裂解各組細胞得到蛋白,定量并調(diào)整濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉后，分別加入不同濃度兔抗鼠Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶200)、AIF(1∶200)，Cleaved-caspase-9(1∶800)、Cleaved-caspase-3(1∶800)抗體4 ℃過夜，HRP標記，ECL顯色、曝光、顯影。測定雜交條帶光密度值進行分析。

2 結(jié)果

2.1 雪旺細胞形態(tài)、鑒定及純度 純化后的雪旺細胞呈梭型，核呈卵圓形，胞體較小且飽滿，周圍有細長突起，呈現(xiàn)“端對端”、“極對極”的網(wǎng)狀或旋渦狀聚集生長。經(jīng)鑒定雪旺細胞的純度達95%以上。

2.2 各組培養(yǎng)液中MDA含量及SOD活性變化 與Con組及HG組相比，IHG組細胞培養(yǎng)液中MDA含量明顯增高 (P<0.01)，SOD活性明顯降低 (P<0.01)。與IHG組相比，不同濃度Sal B干預(yù)后，各組細胞培養(yǎng)液中MDA含量明顯下降(P<0.01,P<0.05)，而SOD活性明顯增高(P<0.01,P<0.05)。見表1。

2.3 各組細胞內(nèi)ROS水平變化 IHG組ROS水平明顯高于HG組及Con組 (P<0.01)。與IHG組相比，不同濃度Sal B可以降低雪旺細胞內(nèi)ROS水平 (P<0.01)。見表1。

2.4 各組細胞凋亡率比較 IHG組細胞凋亡率明顯高于HG組及Con組 (P<0.01)。與IHG組相比，不同濃度Sal B組雪旺細胞凋亡率明顯下降 (P<0.05,P<0.01)。見表1。

2.5 各組細胞MMP變化 IHG組細胞MMP明顯低于Con組及HG組(P<0.01,P<0.05)。與IHG組相比，不同濃度Sal B干預(yù)后，各組雪旺細胞MMP明顯增高 (P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 各組細胞凋亡率、MMP、活性氧、MDA及SOD水平變化Table 1 Comparison of apoptosis rate,mitochondrial transmembrane potential,levels of ROS,MDA and SOD in each group

2.6 各組細胞Bcl-2/Bax、Caspase-9及Caspase-3變化 與Con組相比，HG組和IHG組Bcl-2水平明顯下降 (P<0.01)，Bax、Cleaved-caspase-9及Cleaved-caspase-3水平明顯增高 (P<0.01)，間歇性高糖的作用比穩(wěn)定性高糖更為明顯 (P<0.01)。與IHG組相比，經(jīng)不同濃度Sal B干預(yù)后，雪旺細胞內(nèi)Bcl-2水平明顯增高(P<0.01,P<0.05)，Bax、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3水平顯著降低(均P<0.01)。見圖1。

圖1 Western blot 檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白情況Figure 1 Detection of apoptosis related protein in each group注：與Con組比較，①P<0.01；與HG組比較，②P<0.01；與IHG組比較，③P<0.05，④P<0.01

2.7 Sal B對IHG組雪旺細胞AIF表達的影響 從線粒體到細胞核的轉(zhuǎn)位是AIF的活化標志，與Con組和HG組比較，IHG組雪旺細胞線粒體AIF表達水平降低，而細胞核中AIF表達水平相應(yīng)增高 (P<0.01)。與IHG組比較，不同濃度Sal B組雪旺細胞線粒體AIF表達水平增高，細胞核中AIF表達水平降低 (P<0.05,P<0.01)。見圖2。

圖2 Western blot 檢測AIF核轉(zhuǎn)位情況Figure 2 Nuclear translocation of AIF in each group 注：與Con組比較，①P<0.01；與HG組比較，②P<0.01；與IHG組比較，③P<0.05,④P<0.01

3 討論

絕大多數(shù)糖尿病患者都存在一定幅度的血糖波動，既往人們只重點關(guān)注慢性穩(wěn)定性高血糖，而相對忽略了間歇性高血糖對人體的損害。Monnier等[8-9]發(fā)現(xiàn)間歇性高糖更容易誘發(fā)并加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，間歇性高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)嚴重的功能障礙。分析其原因可能是由于間歇性高糖通過激活內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進一步啟動了內(nèi)皮細胞凋亡程序并加速其損傷。因此，目前普遍認為相對于慢性穩(wěn)定性高血糖，間歇性高血糖更能影響并促進糖尿病各種慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展[10-11]。

雪旺細胞作為髓鞘形成細胞，對于周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)功能的維持及損傷修復(fù)起著非常重要的作用[12-14]。雪旺細胞內(nèi)富含豐富的線粒體，而負責(zé)轉(zhuǎn)運葡萄糖的受體是非胰島素依賴性的，這就使雪旺細胞更容易受到高血糖的刺激，進而直接或間接出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷[15-16]。氧化應(yīng)激反應(yīng)會降低線粒體膜電位，Cyto c、AIF等因子通過從線粒體膜間腔轉(zhuǎn)位到細胞漿及細胞核中，從而啟動了細胞凋亡過程[17-18]。Cyto c在胞漿內(nèi)結(jié)合Caspase-9后激活下游的Caspase-3,通過caspase依賴性途徑導(dǎo)致細胞凋亡。而AIF的核轉(zhuǎn)位則可以通過非Caspase途徑啟動凋亡。

本研究建立間歇性高糖誘導(dǎo)的雪旺細胞損傷模型，檢測細胞氧化應(yīng)激水平及凋亡的變化，結(jié)果顯示穩(wěn)定性高糖和間歇性高糖可以明顯加劇雪旺細胞氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)為ROS水平及MDA含量的增加，SOD活性的下降。同時穩(wěn)定性高糖和間歇性高糖可以降低線粒體膜電位，下調(diào)Bcl-2表達，上調(diào)Bax表達，促進AIF的核轉(zhuǎn)位及Caspase-9、Caspase-3 的活化，增加了雪旺細胞凋亡。與穩(wěn)定性高糖相比，間歇性高糖的作用更為明顯。

目前間歇性高糖導(dǎo)致細胞損傷的具體機制尚未完全明確，大部分學(xué)者認為長期高濃度葡萄糖環(huán)境下，細胞代謝為了適應(yīng)高糖的損傷效應(yīng)會發(fā)生代償性改變。而不斷變化的葡萄糖濃度則會導(dǎo)致細胞無法及時建立有效的適應(yīng)性改變，從而引發(fā)了更為嚴重的細胞功能損傷[11,19-20]。

丹參酚酸B是丹參主要的水溶性單體,既往研究表明其具有抗氧化應(yīng)激及神經(jīng)保護作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)丹參酚酸B可以改善間歇性高糖誘導(dǎo)的雪旺細胞氧化應(yīng)激損傷及凋亡，表現(xiàn)為降低雪旺細胞內(nèi)ROS水平及MDA含量，提高SOD活性。同時上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)Bax表達，抑制AIF的核轉(zhuǎn)位及Caspase-9、Caspase-3 的活化。這表明丹參酚酸B對間歇性高糖導(dǎo)致的雪旺細胞損傷具有一定的保護作用。

4 結(jié)論與啟示

間歇性高糖較持續(xù)穩(wěn)定性高糖對于雪旺細胞具有更顯著的損傷作用，丹參酚酸B能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕間歇性高糖誘導(dǎo)的乳鼠雪旺細胞凋亡。因此，嚴格控制血糖，減少血糖波動對控制糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。但本實驗為體外實驗，在動物及人體內(nèi)丹參酚酸B是否同樣有效，尚需在今后的研究中進一步證實。