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    下調(diào)NLRP3在2型糖尿病中表達(dá)對胰島素抵抗模型脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)及自噬的影響*

    2021-10-28 07:37:08沙依拉海米提阿地拉阿里木阿不拉江玉孫王新玲張穗鄉(xiāng)
    西部醫(yī)學(xué) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:檢測模型

    沙依拉·海米提 阿地拉·阿里木 阿不拉江·玉孫 王新玲 張穗鄉(xiāng)

    (1.新疆自治區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,新疆 烏魯木齊 830000;2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830000)

    寡聚化結(jié)構(gòu)域樣蛋白受體3(NOD family,pyrin domain containing-3,NLRP3)是NOD家族中研究最為成熟的成員之一,同時(shí)也是生物體內(nèi)表達(dá)最為廣泛、生物作用作為多樣的一類炎性小體[1-2]。近年來大量研究證實(shí)NLRP3在2型糖尿病(type-2 diabetes mellitus disease,T2DM)的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[3-6]。T2DM是以胰島素抵抗(insulin resistance,IR)與慢性炎癥為主要特征的代謝紊亂性疾病[7]。其中,機(jī)體的脂肪組織作為體內(nèi)最大的能量儲備系統(tǒng),其不僅在血糖控制及脂類代謝過程中發(fā)揮著重要的作用,還能通過內(nèi)分泌功能參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫代謝過程[8-11]。但關(guān)于NLRP3對T2DM中發(fā)生IR的脂肪細(xì)胞的作用尚不明確。本文研究了NLRP3在脂肪細(xì)胞發(fā)生IR條件下的作用,有望為靶向NLRP3的T2DM治療提供新的啟迪。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象 選取2018年3月~2019年5月在新疆自治區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科初診為T2DM的患者60例,設(shè)為T2DM組。另選取同期本院體檢中心的健康正常體檢者60例作為正常對照組(Normal組)。T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會糖尿病分會制定的《中國2型糖尿病防治指南(2017年)》[12]。T2DM組納入標(biāo)準(zhǔn):①符合上述糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。②無合并心腦血管、肝腎、呼吸系統(tǒng)及胃腸等其他系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤。③非妊娠期或哺乳期婦女。④3月內(nèi)未發(fā)生酮癥酸中毒或高滲性昏迷。⑤6月內(nèi)未服用任何降糖藥物治療。本研究對象均簽署知情同意書,并經(jīng)新疆自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審核、批準(zhǔn)。

    1.2 細(xì)胞系及主要試劑 前脂肪細(xì)胞3T3-L1株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;地塞米松,胰島素(insulin)、異丁基甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine,IBMX)(美國Sigma公司);Trizol、BCA試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo 公司);實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(廣州瑞博生物公司);轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine3000 (美國Invitrogen公司);靶向下調(diào)NLRP3表達(dá)的小干擾RNA(si-NLRP3)及其陰性對照序列(si-negative control,si-NC)(上海吉瑪生物公司);油紅O染色試劑盒(武漢博士德生物公司);葡萄糖氧化酶試劑盒(江蘇碧云天生物公司);大鼠抗Beclin1、GAPDH單克隆抗體(美國Santa Cruz公司);大鼠抗LC3B多克隆抗體、大鼠抗p62單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司);辣根過氧化酶標(biāo)記(HRP)的兔抗大鼠IgG(武漢博士德生物科技公司);PCR引物(上海生工);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。電泳槽、電泳儀及化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)(美國Bio-Bad公司)。

    1.3 檢測方法

    1.3.1 生化指標(biāo)檢測 所有研究對象均隔夜禁食8~10 h后采集肘靜脈血進(jìn)行檢測各項(xiàng)生化指標(biāo)。采用全自動生化分析儀檢測所有患者的血糖指標(biāo):空腹血糖值(FPG)、餐后2 h血糖(2 h PG),糖化血紅蛋白(HbA1c);。采用放射免疫法測定空腹胰島素水平(FINS)。根據(jù)FPG與FINS計(jì)算IR指數(shù)(HOMA-IR),計(jì)算公式:HOMA-IR =[(FPG×FINS)/22.5];根據(jù)受試者身高體重計(jì)算體質(zhì)量(BMI),BMI=體重(kg)/身高2(m2)。

    1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 參考NLRP3、白介素1β(interlukin-1β,IL-1β)、白介素18(interlukin-18,IL-18)的ELISA檢測試劑盒使用說明方法檢測相應(yīng)樣本中的上述細(xì)胞因子表達(dá)。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)進(jìn)行3次。

    1.3.3 細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 參照文獻(xiàn)[13]培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞3T3-L1并誘導(dǎo)其分化為成熟脂肪細(xì)胞,方法如下:常規(guī)復(fù)蘇3T3-L1前脂肪細(xì)胞,使用含有10%FBS的DMEM/HG培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長融合至90%以上時(shí),在上述培養(yǎng)基中加入0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、10 μg/mL Insulin進(jìn)行誘導(dǎo)分化,同上條件培養(yǎng)48 h,更換為10 μg/mL Insulin與10% FBS的DMEM/HG培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,再將培養(yǎng)基更換為10% FBS的DMEM/HG培養(yǎng)基進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng),48 h更換培養(yǎng)基1次。選擇誘導(dǎo)分化8 d至12 d的3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行成熟脂肪細(xì)胞的鑒定。

    1.3.4 油紅O染色 收集生長狀態(tài)良好的經(jīng)誘導(dǎo)分化后的3T3-L1細(xì)胞,PBS離心洗滌細(xì)胞后,在室溫下將其固定于1 mL 10%的甲醛溶液中2 h,PBS再次洗滌細(xì)胞后,室溫下晾干細(xì)胞,加入0.3%油紅染色溶液250 μl于室溫下避光染色1 h,60%異丙醇充分漂洗后置于顯微鏡下觀察,拍照。

    1.3.5 IR模型的建立 將方法1.3.3中誘導(dǎo)分化的成熟脂肪細(xì)胞3T3-L1分為正常對照組(記為A組)與IR模型組(記為B組),A組使用含10% FBS DMEM/HG的常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),B組使用含1 μmol/L地塞米松與10% FBS的DMEM/HG培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)IR,兩組細(xì)胞按上述條件培養(yǎng)48 h后,收集兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清液。使用含100 nmol/L Insulin的常規(guī)培養(yǎng)基處理上述不同條件培養(yǎng)48 h后的A、B組細(xì)胞30 min,收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液。參考葡萄糖氧化酶試劑盒使用方法檢測所收集的上清液中葡萄糖含量,以未接種細(xì)胞的空白培養(yǎng)基作為葡萄糖含量的基礎(chǔ)值,所測結(jié)果減去每組基礎(chǔ)值即為每組葡萄糖消耗量。

    1.3.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 分別取生長狀態(tài)良好的3T3-L1脂肪細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后,按2×105個(gè)/mL接種于24孔板中進(jìn)行IR模型誘導(dǎo)后,加入100 μl Opti-MEM溶液,并根據(jù)LipofectamineTM3000說明書方法將si-NLRP3、si-NC轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)8 h后即可進(jìn)行檢測轉(zhuǎn)染效率及后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染后的3T3-L1脂肪細(xì)胞分為四組,分別為si-NC組,即轉(zhuǎn)染si-NC的3T3-L1細(xì)胞;si-NLRP3組,即轉(zhuǎn)染si-NLRP3的3T3-L1細(xì)胞;IR-si-NC組,即在IR模型中轉(zhuǎn)染si-NC的3T3-L1細(xì)胞;IR-si-NLRP3組,即在IR模型中轉(zhuǎn)染si-NLRP3的3T3-L1細(xì)胞。

    1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR) 取方法1.3.6不同處理的各組3T3-L1細(xì)胞,TRIzol法提取細(xì)胞中總RNA,分光光度計(jì)檢測濃度與純度后,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再按照RT-PCR試劑說明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的反應(yīng)時(shí)間與溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)定量,RT-PCR反應(yīng)條件為:95 ℃(30 s)預(yù)變性后,變性95 ℃(7 s)→退火60 ℃(30 s)→72 ℃(15 s),40個(gè)循環(huán)周期。RT-PCR引物序列為:NLRP3-上游:5′-AGAAGAGACCACGGCAGAAG-3′,NLRP3-下游:5′-CCTTGGACCAGGTTCAGTGT-3′;GAPDH-上游:5′-GCATTGTGGAAGGGCTCATG-3′,GAPDH-下游:5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt方法分析NLRP3 mRNA的表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

    1.3.8 Western blot實(shí)驗(yàn) 取方法1.3.6不同處理的各組3T3-L1細(xì)胞,RIPA細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑進(jìn)行提取細(xì)胞中的總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量后,將蛋白樣品進(jìn)行加熱變性。取30 μg的蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳進(jìn)行蛋白分離,采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后,分別加入LC3B(1∶300)、Beclin1(1∶300)、p62(1∶300)、GAPDH (1∶1000)一抗,4 ℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次,5 min/次,以辣根酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)室溫孵育1 h,以TBST溶液清洗3次,5 min/次。最后均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值,以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值作為其相對含量。以上實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組受試者一般資料比較 T2DM組與Normal組在性別、年齡及BMI方面相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而FPG、2 h PG、HbA1c、FINS及HOMA-IR相比,T2DM組較Normal組均明顯增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05),見表1。

    表1 兩組受試者的一般臨床資料比較Table 1 General clinical data of the two groups

    2.2 NLRP3在T2DM患者血清中的表達(dá) 與Normal組相比,NLRP3在T2DM組血清中的表達(dá)顯著增加 (P<0.01),見圖1。

    圖1 NLRP3在兩組患者血清中的表達(dá)Figure 1 The expression level of NLRP3 in serum of T2DM patients increased significantly注:與Normal組相比,①P<0.01

    2.3 成熟脂肪細(xì)胞分化的鑒定 油紅O染色進(jìn)行鑒定誘導(dǎo)后3T3-L1細(xì)胞,觀察顯示前脂肪細(xì)胞3T3-L1呈長梭形貼壁生成,而誘導(dǎo)后細(xì)胞形狀變圓,體積增大,經(jīng)油紅O染色觀察可見細(xì)胞核周圍有大量脂滴環(huán)繞,呈“戒環(huán)狀”。見圖2。

    圖2 油紅O染色觀察3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化Figure 2 Induced differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes was observed by oil red O staining注:黑色箭頭指示3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂滴呈“戒環(huán)狀”

    2.4 脂肪細(xì)胞IR模型的鑒定 應(yīng)用葡萄糖氧化酶法鑒定3T3-L1細(xì)胞的IR模型,結(jié)果顯示3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)DEX培養(yǎng)48 h后與Normal組相比,IR模型組細(xì)胞的上清液中葡萄糖消耗量顯著降低 (P<0.05),再經(jīng)胰島素刺激后與Normal組相比,IR模型組細(xì)胞的上清液中葡萄糖消耗量亦明顯降低 (P<0.05)。提示成功建立了3T3-L1脂肪細(xì)胞的IR模型,見圖3。

    圖3 3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型的鑒定Figure 3 Identification of insulin resistance model of 3T3-L1 adipocytes注:A.Normal組;B.IR模型組。與Normal組相比,①P<0.01

    2.5 轉(zhuǎn)染si-NLRP3后IR模型中脂肪細(xì)胞對NLRP3的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示,與si-NC組相比,si-NLRP3組與IR-si-NLRP3組的3T3-L1細(xì)胞中NLRP3 mRNA的表達(dá)均顯著降低 (P<0.05),而IR-si-NC組細(xì)胞中NLRP3 mRNA的表達(dá)明顯升高 (P<0.05),提示IR能夠促進(jìn)NLRP3 mRNA的表達(dá),而轉(zhuǎn)染si-NLRP3后能夠顯著降低其表達(dá),見圖4。

    圖4 RT-PCR檢測各組細(xì)胞中NLRP3 mRNA的表達(dá)Figure 4 The expression level of NLRP3 mRNA in each group was detected by RT-PCR注:與si-NC組細(xì)胞相比,①P<0.05

    2.6 下調(diào)NLRP3表達(dá)對IR模型中脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 ELISA檢測各組3T3-L1細(xì)胞種炎癥因子IL-1β、IL-18的表達(dá)水平,結(jié)果顯示與si-NC組相比,IR-si-NC組與IR-si-NLRP3組中IL-1β、IL-18表達(dá)均顯著增加 (P<0.05),而si-NLRP3組無顯著變化(P>0.05);與IR-si-NC組相比,IR-si-NLRP3組中IL-1β、IL-18表達(dá)均明顯降低 (P<0.05),見表2。

    表2 各組脂肪細(xì)胞對炎癥因子IL-1β、IL-18的表達(dá)Table 2 The expression of IL-1β and IL-18 in adipocytes of each group

    2.7 下調(diào)NLRP3表達(dá)對IR模型中脂肪細(xì)胞對葡糖糖攝取的影響 葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測結(jié)果顯示,與si-NC組細(xì)胞相比,IR-si-NC組與IR-si-NLRP3組中葡萄糖消耗量顯著降低 (P<0.05),而si-NLRP3組無顯著變化(P>0.05);但與IR-si -NC組相比,IR-si-NLRP3組中脂肪細(xì)胞對葡萄糖消耗量顯著增加 (P<0.05),見圖5。

    圖5 各組脂肪細(xì)胞對葡萄糖消耗量的檢測Figure 5 The detection of glucose consumption in adipocytes注:與si-NC組相比,①P<0.05;與IR-si-NC組相比,②P<0.05

    2.8 下調(diào)NLRP3表達(dá)對IR模型中脂肪細(xì)胞自噬的影響 Western blot檢測各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B與Beclin1和p62的表達(dá),結(jié)果表明在si-NC組與si-NLRP3組3T3-L1細(xì)胞中自噬標(biāo)志性分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白較IR-si-NC組與IR-si-NLRP3組顯著增加 (P<0.05),而p62蛋白明顯降低 (P<0.05);但與IR-si-NC組相比,IR-si-NLRP3組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白明顯增加 (P<0.05),p62蛋白顯著降低 (P<0.05),見圖6。

    圖6 Western blot檢測各組脂肪細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 6 The expression of autophagy related proteins in adipocytes was detected by Western blot注:與si-NC組細(xì)胞相比,①P<0.05;與IR-si-NC組細(xì)胞相比,②P<0.05

    3 討論

    T2DM作為一種能量代謝障礙相關(guān)的代謝綜合征,其同樣也是一種由慢性炎癥引起的炎癥性疾病,胰島β功能損害及IR是引起T2DM的兩大重要病理特征[14]。目前T2DM在全世界范圍內(nèi)呈流行現(xiàn)象,尤其在我國,有數(shù)據(jù)報(bào)道每10個(gè)成年人中就有1個(gè)糖尿病患者,嚴(yán)重危害人們的健康及社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[15]。而NLRP3作為能夠在細(xì)胞內(nèi)與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白(caspase recruitment domain,ASC)和半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)相互結(jié)合形成具有生物活性炎性小體,并激活下游促炎因子IL-1β與IL-18等的分泌,從而參與T2DM的發(fā)生發(fā)展。同時(shí),Oslowski團(tuán)隊(duì)與Lenner團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)由代謝紊亂而引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞中硫氧還原蛋白相互作用蛋白的表達(dá),而后者又能通過抑制NLRP3炎癥小體的活化及下游IL-1β的分泌,從而促進(jìn)胰島β細(xì)胞的存活[16-17]。此外,大量學(xué)者在NLRP3炎性小體活化的信號通路上利用基因敲除小鼠研究證實(shí),飲食誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化是引起IR及糖耐量受損的主要“幕后推手”[18-19]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察對比T2DM患者與正常對照組血清NLRP3的表達(dá),結(jié)果表明NLRP3在T2DM患者血清中的表達(dá)異常增加,這與上述文獻(xiàn)的結(jié)果一致,提示NLRP3可能與T2DM的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。

    機(jī)體脂肪細(xì)胞主要通過調(diào)控葡萄糖的運(yùn)輸能力來影響脂質(zhì)的存儲及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌,而脂肪細(xì)胞的功能障礙會造成其對胰島素的敏感性降低[20]。大量研究證實(shí)在T2DM中脂肪細(xì)胞發(fā)生了IR[9]。同時(shí),脂肪細(xì)胞的IR將顯著降低其對葡萄糖的吸收及利用,進(jìn)一步促進(jìn)脂肪組織在其他組織或器官的異常累積,降低其對胰島素的敏感性,最終形成系統(tǒng)性的IR[21]。有學(xué)者報(bào)道在肥胖及高脂血癥患者的脂肪組織中NLRP3的表達(dá)較健康人群明顯增加,通過降低NLRP3炎性小體的表達(dá)能夠下調(diào)脂肪細(xì)胞對促炎因子IL-1β及IL-18表達(dá)[10-11],而IL-1β與IL-18是T2DM中重要的促炎因子[5]。本研究通過誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化為成熟脂肪細(xì)胞,并利用地塞米松誘導(dǎo)其形成IR模型以模擬T2DM中脂肪細(xì)胞的狀態(tài),并應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)NLRP3在脂肪細(xì)胞中的表達(dá),ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)下調(diào)脂肪細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)能顯著降低IR模型中的脂肪細(xì)胞對IL-1β、IL-18的分泌,并促進(jìn)其對葡萄糖的攝取,這與其他學(xué)者的研究報(bào)道相似,均表明下調(diào)脂肪細(xì)胞中NLRP3表達(dá)能抑制其對下游IL-1β、IL-18的分泌水平,并促進(jìn)其對葡萄糖的利用。

    自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種具有自我保護(hù)作用的生理現(xiàn)象,其基本的功能是保證細(xì)胞的活力,負(fù)責(zé)細(xì)胞器的更新。Zhang Y等[22]學(xué)者最近提出NLRP3可以通過其特殊的分子結(jié)構(gòu)域與自噬啟動蛋白Beclin1相互作用,負(fù)向調(diào)控細(xì)胞的自噬水平。在本研究中我們檢測IR模型的脂肪細(xì)胞的自噬水平,結(jié)果表明下調(diào)細(xì)胞中NLRP3表達(dá)能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的自噬水平,同時(shí)自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)顯著增加。LC3-Ⅰ脂質(zhì)化并形成膜結(jié)合的LC3-Ⅱ是自噬體形成的關(guān)鍵步驟,同時(shí)也被用來作為自噬發(fā)生的檢測標(biāo)準(zhǔn),而LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值能夠有效反應(yīng)兩者之間的動態(tài)轉(zhuǎn)換過程。p62是細(xì)胞內(nèi)自噬過程中特異性底物及調(diào)節(jié)蛋白,同時(shí)也被用來作為衡量自噬的完成情況[23]。下調(diào)IR模型中脂肪細(xì)胞的NLRP3表達(dá)能顯著促進(jìn)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的增加及降低p62蛋白水平,這提示下調(diào)NLRP3能夠促進(jìn)IR模型中脂肪細(xì)胞的自噬水平。

    4 結(jié)論

    NLRP3在T2DM中的表達(dá)顯著增加,通過下調(diào)胰島素抵抗模型中脂肪細(xì)胞NLRP3表達(dá)能夠有效降低其對炎癥因子IL-1β、IL-18的分泌,促進(jìn)其對葡萄糖的攝取,并增加細(xì)胞的自噬水平。

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