超聲波提取辣蓼草中黃酮及抗氧化性研究

夏秋霞，李 超，呂舒情，李宛蓉，張東京

辣蓼草（Polygonum hydropiper Linn.），別名水胡椒、柳葉蓼，生長在我國南北地區(qū)，野生資源豐富［1］.辣蓼草全株皆可入藥，能夠治療風寒、痢疾和面目浮腫等疾病，具有明目、暖胃、除濕、止痛等功效［2?4］.研究證實，辣蓼草中含有黃酮、烴類等多種活性物質(zhì)［5?6］，其主要物質(zhì)黃酮能夠消除疲勞和抗氧化［7］.實驗探究超聲波優(yōu)化提取辣蓼草中黃酮［8］及對DPPH和·OH的清除率效果［9］，為辣蓼草后續(xù)更好地發(fā)揮其潛在藥用價值提供理論基礎(chǔ)，并為我國辣蓼草資源的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗材料

新鮮整株辣蓼草（購于廣西欽州），55℃干燥粉碎，過篩備用.DPPH、VC、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純.

1.1.2 實驗儀器

UV?5100H型分光光度計（上海元析儀器有限公司）；XM?250UVF型超聲儀（小美超聲儀器有限公司）；600Y高速粉碎機（永康泊歐儀器有限公司）等.

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的測定

參照杜麗娟等人［10］的硝酸鋁顯色方法.

1.2.2 辣蓼草總黃酮得率的測定

取辣蓼草提取液按1.2.1方法，采用50%乙醇溶液為參比溶液，根據(jù)式（1）計算總黃酮得率.

式中：F—總黃酮得率，%；C—總黃酮濃度，mg/mL；V—樣品溶液體積，mL；X—稀釋倍數(shù)；M—粉末質(zhì)量，mg.

1.2.3 單因素實驗

（1）乙醇濃度對超聲波提取辣蓼草中黃酮的影響.取5支25 mL比色管，每支均加入0.500 0 g（精準到0.000 1 g）的辣蓼草粉末，加入25 mL（1∶50）的濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，在160 W、50℃下超聲波提取50 min，分析不同乙醇濃度對超聲波提取辣蓼草中黃酮提取率所造成的影響.

（2）料液比對超聲波提取辣蓼草中黃酮的影響.取5支25 mL比色管，每支均加入0.500 0 g（精準到0.000 1 g）的辣蓼草粉末，加入60%的乙醇溶液，料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，在160 W、50℃條件下超聲波提取50 min，分析不同料液比對超聲波提取辣蓼草中黃酮提取率所造成的影響.

（3）提取時間對超聲波提取辣蓼草中黃酮的影響.取5支25 mL比色管，每支均加入0.500 0 g（精準到0.000 1 g）的辣蓼草粉末，加入25 mL（1∶50）的60%乙醇溶液，分別在160 W、50℃條件下超聲波提取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，分析不同提取時間對超聲波提取辣蓼草中黃酮提取率所造成的影響.

（4）提取功率對超聲波提取辣蓼草中黃酮的影響.取5支25 mL比色管，每支均加入0.500 0 g（精準到0.000 1 g）的辣蓼草粉末，加入25 mL（1∶50）濃度為60%乙醇溶液，提取溫度50℃，分別在128 W、160 W、192 W、224 W、256 W條件下超聲波提取50 min，分析不同提取功率對超聲波提取辣蓼草中黃酮提取率所造成的影響.

（5）提取溫度對超聲波提取辣蓼草中黃酮的影響.取5支25 mL比色管，每支均加入0.500 0 g（精準到0.000 1 g）的辣蓼草粉末，加入25 mL（1∶50）的濃度為60%乙醇溶液，提取功率160 W，分別在25℃、35℃、45℃、55℃和65℃條件下超聲波提取50 min，分析不同提取溫度對超聲波提取辣蓼草中黃酮提取率所造成的影響.

1.2.4 響應(yīng)面分析

優(yōu)化因素水平如表1所示［11］.

表1 因素水平表

1.2.5 抗氧化分析

（1）對DPPH的清除能力.參考王潤坤等［12］方法，取5支試管，將2 mL 0.1 mmol/L DPPH和2 mL 5種濃度黃酮樣液（1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL），混勻后25℃避光30 min.在517 nm波長處測定吸光度為A1；取2 mL無水乙醇分別與DPPH、樣液測定結(jié)果為A0和A2；用同濃度的VC重復上述實驗.重復3次，求其平均值.計算如下：DPPH自由基清除率

（2）對·OH的清除能力.取2 mL 5種濃度黃酮樣液，分別加入1 mL 10 mmol/L FeSO4溶液和1 mL 10 mmol/L水楊酸溶液，搖勻后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液啟動反應(yīng)，在37℃保溫60 min，在527 nm處測得吸光值A(chǔ)1；用蒸餾水取代黃酮測得A0；用蒸餾水取代水楊酸溶液測得A2；用同濃度的VC重復上述實驗.計算如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標準曲線

根據(jù)圖1可知，蘆丁的濃度和吸光度值A(chǔ)的趨勢方程為y=3.197 1x?0.016 9，且R2=0.999 9，說明該實驗?zāi)Ｐ洼^為顯著，精確度高，能夠用于黃酮類化合物含量的測定.

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 乙醇濃度對超聲波提取辣蓼草中黃酮的影響

由圖2可知，在乙醇濃度為40%～50%時，辣蓼草中黃酮提取率增長最快，由3.25%增加到4.23%，乙醇濃度為60%時達到了最大值5.05%，乙醇濃度在60%～70%的區(qū)間內(nèi)，辣蓼草的黃酮提取率逐漸降低至4.08%.可能是由于乙醇可以促進辣蓼草細胞的膨脹，前期隨著乙醇濃度的增加，辣蓼草細胞膨脹程度逐漸增大，從而提高了黃酮溶解的速度，使反應(yīng)更加充分［13］.隨著乙醇濃度過大，辣蓼草細胞中其他可以溶于乙醇的非黃酮類雜質(zhì)溶出的量逐漸增加.此時，隨著乙醇濃度繼續(xù)增大，辣蓼草細胞中其他可以溶于乙醇的非黃酮類雜質(zhì)溶出的量逐漸增加，進而減少了黃酮類活性有機大分子的析出，導致黃酮提取率逐漸下降.綜上所述，將使用60%的乙醇溶液作進一步的分析.

圖2 乙醇濃度對辣蓼草黃酮得率的影響

2.3 料液比對超聲波提取辣蓼草中黃酮的影響

由圖3得出，在1∶30～1∶70的料液比區(qū)間內(nèi)，辣蓼草中的黃酮提取率先由2.51%增長到5.10%，然后又開始下降至4.42%，并且在1∶30～1∶40范圍內(nèi)，辣蓼草黃酮提取率增長最快，由2.51%增加到4.23%.當料液比為1∶50時黃酮提取率達到了最大值5.10%.在1∶30～1∶50區(qū)間內(nèi)，辣蓼草的黃酮提取率隨著乙醇含量的上升而逐漸增高.在1∶50～1∶70區(qū)間內(nèi)，伴隨著乙醇溶液體積的增加，辣蓼草的黃酮提取率開始降低且逐漸趨于穩(wěn)定.考慮到成本問題，選取料液比1∶50為超聲波提取的最優(yōu)條件.

圖3 料液比對辣蓼草黃酮得率的影響

2.4 提取時間對超聲波提取辣蓼草中黃酮的影響

由圖4可得，辣蓼草中黃酮提取率在超聲時長為20～60 min時出現(xiàn)先升高而后逐漸降低的趨勢，其中在20～30 min時，辣蓼草黃酮提取率增長最快，增長率達到了69.1%.超聲時間長達50 min時取得了黃酮提取率最大值5.23%.在20～50 min的區(qū)間里，辣蓼草的黃酮提取率由2.44%增長到5.23%；但在50～60 min區(qū)間內(nèi)，提取率又開始降低至4.21%.可能是由于在50 min以內(nèi)，伴隨著超聲波提取時間的延長，辣蓼草中黃酮類物質(zhì)的提取更加充分，但當提取過久，部分黃酮類化合物的成分會隨著時間增加而逐漸遭到破損，同時辣蓼草中其他可以溶于乙醇的非黃酮類雜質(zhì)溶出的量逐漸增加，進而影響提取結(jié)果［14］.綜上所述，將超聲波提取時長定為50 min，以作進一步的分析.

圖4 提取時間對辣蓼草黃酮得率的影響

2.5 提取功率對超聲波提取辣蓼草中黃酮的影響

由圖5可知，在提取功率為128～160 W時，辣蓼草黃酮提取率增長最快，由3.55%增加到5.01%，在提取功率為192 W時達到最大值5.65%，但在192～256 W的功率區(qū)間內(nèi)，黃酮提取率隨提取功率的升高而降低.由此可知，在192 W以內(nèi)，伴隨著超聲波提取功率的增加，辣蓼草中黃酮類物質(zhì)的提取更加充分，可能是提取功率越大，破壞辣蓼草細胞的細胞壁的能力就越強，因此辣蓼草黃酮類化合物的析出就越多；但當提取功率超過192 W時，部分黃酮分解［15?16］，因此辣蓼草中黃酮類化合物的析出減少.綜上所述，將使用192 W的提取功率進行提取，以作進一步的分析.

圖5 提取功率對辣蓼草黃酮得率的影響

2.6 提取溫度對超聲波提取辣蓼草中黃酮的影響

由圖6可得，辣蓼草中黃酮提取率在溫度為25～65℃范圍內(nèi)呈現(xiàn)先升高而后急劇降低的趨向，在35～45℃范圍內(nèi)，辣蓼草黃酮提取率增長最快，增長率達到了41.1%，在溫度為45℃時達到了最高點5.62%.但在45～65℃區(qū)間內(nèi)，提取率開始迅速下降至4.08%，降低2.74%，可能是因為適宜的溫度能促使溶劑分子加快運動，有利于辣蓼草中黃酮類物質(zhì)的溶解；但高溫會導致乙醇的揮發(fā)量增加，并且會促使一些不穩(wěn)固的黃酮類物質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生異變，使得辣蓼草的黃酮提取率下降.因此，選擇提取溫度45℃作下一步分析.

圖6 提取溫度對辣蓼草黃酮得率的影響

2.7 響應(yīng)面實驗優(yōu)化結(jié)果

2.7.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果

實驗優(yōu)化結(jié)果如表2、表3、圖7所示.

表2 設(shè)計結(jié)果表

表3 方差分析表

圖7 響應(yīng)面結(jié)果圖

2.7.2 響應(yīng)面分析

將數(shù)據(jù)結(jié)果進行方差分析，用黃酮得率作為判斷指標，經(jīng)過綜合分析，最終方程：黃酮提取率（%）=5.69?0.076A+0.079B+（6.500E?003）C+0.037D+0.015AB+0.068AC+（7.500E?004）AD?0.012BC+0.077BD?0.0056CD?0.35A2?0.47B2?0.21C2?0.46D2.

根據(jù)表3可知，模型P<0.000 1，極顯著性差異；失擬項P值0.079 6>0.05，相關(guān)系數(shù)R2=0.987 3，R2adj=0.974 6，變異系數(shù)（C.V.）1.01%<5.00%，模型可靠且重現(xiàn)性好.因素影響大小依次為：B>A>D>C.優(yōu)化條件為：A為58.92%、B為194.77 W、C為49.89 min和D為45.49℃，黃酮得率預測值為5.83%.結(jié)合實際確定工藝為：A為59%、B為195 W、C為50 min和D為45℃經(jīng)驗證性實驗黃酮得率為5.82%.

2.8 抗氧化性分析

2.8.1 辣蓼草黃酮提取物對DPPH自由基的清除能力

圖8顯示，樣液在0.1～0.3 mg/mL范圍內(nèi)，對DPPH清除效果增速較快，由23.12%增至68.74%，在0.3～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，增加緩慢，達到最高值80.35%，IC50約為0.23 mg/mL，但清除能力略小于VC［17］.

圖8 辣蓼草黃酮提取物對DPPH清除效果

2.8.2 辣蓼草黃酮提取物對·OH自由基的清除能力

圖9顯示，樣液在0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，對·OH清除效果增加幅度較為明顯，由22.33%增加至最高值78.87%，IC50約為0.25 mg/mL.在濃度為0.5 mg/mL時與VC的清除能力相當.

圖9 辣蓼草黃酮提取物對·OH清除效果

3 結(jié)論

辣蓼草中黃酮提取優(yōu)化參數(shù)為：乙醇濃度59%、料液比1∶50、提取時間50 min、提取功率195 W、提取溫度45℃，經(jīng)驗證性實驗得到黃酮得率為（5.82±0.14）%.在對辣蓼草中黃酮提取液做抗氧化性分析后得到，其清除·OH和DPPH自由基的IC50分別為0.25 mg/mL和0.23 mg/mL，本研究為辣蓼草后續(xù)更好地發(fā)揮其潛在價值提供參考.