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    富硒靈芝對妊娠期糖尿病大鼠脂代謝的調(diào)節(jié)作用*

    2021-10-27 09:01:58黃晶柏青華蕾張思成何飛敏徐小瓊
    西部醫(yī)學(xué) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:明顯降低靈芝肝功能

    黃晶 柏青 華蕾 張思成 何飛敏 徐小瓊

    (云南省第三人民醫(yī)院產(chǎn)科,云南 昆明 650100)

    妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)是孕婦常見的并發(fā)癥之一,發(fā)生率約為3%~5%,可給孕婦及胎兒帶來一定損害,因此需積極關(guān)注[1-3]。靈芝是我國古典用藥的上品藥物,其性溫,味淡適合于多種疾病的輔助治療[4]。研究發(fā)現(xiàn),孕婦也可以安全服用靈芝,其藥理作用主要為松弛子宮肌肉,避免肌肉的過度收縮,進而起到安胎的效果,此外其還可以補充多種微量元素,促進胎兒的生長和發(fā)育[5-6]。富硒靈芝是人工培育的靈芝品種,其有機硒含量明顯高于普通靈芝,武俊紫等[7]研究報道,富硒靈芝對非酒精性脂肪肝病具有明顯的效果,其作用機理與富硒靈芝可以改善脂代謝相關(guān)基因表達有關(guān)。本研究推測其可能對GDM脂代謝水平也有一定的作用。為此本研究擬構(gòu)建GDM大鼠模型,采用富硒靈芝治療,觀察脂代謝調(diào)節(jié)相關(guān)基因固醇原件調(diào)節(jié)蛋白-1c(sterol regulatory binding proteins-1c,SREBP-1c)、乙酰輔酶A羧化酶α (acetyl coenzyme A carboxylase α,ACCα)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptorα,PPARα)的表達變化特點,為富硒靈芝可以安全用于孕婦提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠100只,其中20只雄性,80只雌性,購于昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,動物合格證號:SYXK(滇)K2015-0002。購買后分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)于標準動物飼養(yǎng)間,溫度22~26 ℃,濕度40%~60%,日常采用光照采光,光照周期為12 h。本實驗對動物的處理符合動物倫理要求,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核、批準。

    1.2 試驗藥物和試劑 富硒靈芝(沈陽康硒生物科技有限公司,含硒量3.162 mg/kg);鹽酸二甲雙胍緩釋片(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司,國藥準字H20031104);戊巴比妥鈉(上海信裕生物科技有限公司);鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)購于美國sigma公司;大鼠天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、總膽固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(High density liptein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(Low density liptein cholesterol,LDL-C)購于南京建成生物工程研究所;SREBP-1c、ACCα、SCD1和PPARα、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體和DAB顯色試劑盒購于美國Santa Cruz公司;二抗購于北京中杉金橋生物公司;引物由上海生物生工設(shè)計并生產(chǎn)。

    1.3 主要儀器 V-5800紫外-可見光分光光度計(上海元析儀器有限公司);安穩(wěn)+型血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司);CKX53型熒光倒置顯微鏡 (Olympus中國有限公司);S-1-150S型臺式低溫高速離心機(鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司;Mini-PROTEAN Tetra Cell型蛋白電泳系統(tǒng)(美國伯樂公司);Gentier 48E 型QT-PCR儀(西安天隆科技有限公司)。

    1.4 GDM大鼠模型的制備及分組 本研究模型的制備參照楊麗等[8]文獻報道方法。所有雄鼠全程只給予普通飼料,雌性大鼠購買后先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周(普通飼料+日常自來水飲用),后隨機選取12只作為正常組(普通飼料+日常自來水飲用),其余68只則給予高脂飼料喂養(yǎng)8周(高脂飼料喂養(yǎng)+日常自來水飲用,高脂飼料配方為:83.25%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、5%蔗糖、1.5%膽固醇和0.25%膽酸鈉)。高脂飼料喂養(yǎng)8周后,將雄性大鼠和雌性大鼠按照1∶4同籠過夜,次日通過鏡檢檢查是否懷孕,當陰道發(fā)現(xiàn)有精子存在的確定懷孕。確定懷孕后所有高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠給予腹腔一次性注射STZ 35mg/kg,注射3 d后檢測血糖,血糖值穩(wěn)定于13.0 mmol/L時確定GDM大鼠造模成功(連續(xù)三天空腹血糖值均超過13.0 mmol/L)。造模成功后,將大鼠按照隨機數(shù)字法分為模型組、鹽酸二甲雙胍組、富硒靈芝(低、中和高劑量)組,每組各12只。所有大鼠均給予藥物干預(yù)2周,其中正常組和模型組給予生理鹽水3 mL/d灌胃,鹽酸二甲雙胍組給予鹽酸二甲雙胍200 mg/kg·d灌胃,富硒靈芝低、中和高劑量組給予富硒靈芝水(1、2和4 g富硒靈芝用20 mL水煮沸30 min,最后蒸發(fā)濃縮為3 mL分別給予低、中和高劑量組大鼠)灌胃(給藥劑量根據(jù)大鼠和人體換算公式得到,沈陽康硒生物科技有限公司建議正常人一天可服用富硒靈芝25 g,根據(jù)換算公式,大鼠用藥劑量=人體用藥劑量/12×100%,得到大鼠劑量為2 g左右,所以設(shè)置中劑量組為2 g,低劑量組為中劑量組的一半,高劑量組為中劑量組的一倍),2周后進行后續(xù)實驗。

    1.5 空腹血糖水平檢測 分別于治療0、7 d和處死前采用尾靜脈取血法收集大鼠血糖,檢測血糖變化特點。

    1.6 血脂水平和肝功能檢測 所有大鼠分批次禁食不禁水12 h,次日采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,腹主動脈取血法收集血液,血液收集后離心,離心條件為3000 r/min 離心10 min,離心半徑6 cm,離心后收集上清,根據(jù)試劑盒提供的說明書,采用分光光度計檢測血脂TC、TG、LDL-C和HDL-C,肝功能AST和ALT 的含量。

    1.7 酶聯(lián)免疫印跡法(Elisa)檢測肝脂水平 取出肝臟組織,稱取1 g置入組織裂解液中,采用電動研磨器研磨后,低溫高速離心機3000 r/min 離心10 min,離心半徑6 cm,離心后取出上清,采用試劑盒提供的說明書檢測血脂TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量變化。

    1.8 蘇木精-伊紅(HE)染色法檢測肝臟組織病理學(xué) 獲得肝臟后,統(tǒng)一將肝左葉置入4%的中性福爾馬林溶液中浸泡24~72 h,后分批次取出,采用生理鹽水洗滌,石蠟包埋,切片,常規(guī)HE染色即完成,完成后采用中性樹脂封片,熒光倒置顯微鏡采集圖像。

    1.9 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測相關(guān)蛋白表達 稱取1 g肝臟組織,將其研磨后,低溫高速離心機3000 r/min 離心 10 min,離心半徑6 cm,完成后采用BCA法對其進行定量并調(diào)平,然后每組各取50 μg行SDS-PAGE 電泳,電泳完成后將目的蛋白裁剪后轉(zhuǎn)移到PVDF膜,45 min后取出,洗滌后將其采用牛血清蛋白封閉2 h,后加入一抗(SREBP-1c、ACCα、SCD1和PPARα)封閉過夜,次日取出后加入二抗封閉30 min后,暗室曝光洗片,掃描儀掃描后采用Image J計算各條帶灰度值,每組實驗重復(fù)3次。結(jié)果以對應(yīng)條帶的灰度值/GAPDH灰度值分析。

    2 結(jié)果

    2.1 肝臟切片的病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示,正常組肝細胞清晰可見,紋理清晰,沒有明顯病理學(xué)變化,而模型組則出現(xiàn)典型的脂肪顆粒浸潤,呈空泡樣改變。與模型組相比,各治療組均有一定的好轉(zhuǎn)。此外從切片中可簡單看出,富硒靈芝中、高劑量組明顯好于鹽酸二甲雙胍組。見圖1。

    圖1 各組大鼠肝臟組織HE染色圖(200×)Figure 1 HE staining of liver tissue of rats in each group注:圖中A、B、C、D、E和F分別為正常組、模型組、鹽酸二甲雙胍組、富硒靈芝低劑量組、富硒靈芝中劑量組和富硒靈芝高劑量組

    2.2 各組大鼠肝功能 AST 及 ALT比較 與正常組相比,模型組AST和ALT明顯升高 (P<0.05);與模型組相比,富硒靈芝組和鹽酸二甲雙胍組均明顯降低 (P<0.05),且富硒靈芝中、高劑量組明顯低于鹽酸二甲雙胍組 (P<0.05),見表1。

    表1 各組大鼠肝功能指標比較Table 1 The comparison of liver function indexes of rats in each group

    2.3 肝脂和血脂的變化特點 與正常組相比,模型組大鼠血清和肝臟組織中TC、TG和LDL-C含量均明顯升高 (P<0.05),HDL-C明顯降低 (P<0.05);與模型組比較,各治療組TC、TG和LDL-C含量均明顯降低 (P<0.05),而HDL-C則明顯升高 (P<0.05);與鹽酸二甲雙胍組比較,富硒靈芝中、高劑量組TC、TG和LDL-C 均明顯降低 (P<0.05),HDL-C明顯升高 (P<0.05),見表2、表3。

    表2 各組大鼠血脂指標比較Table 2 The comparison of blood lipid indexes of rats in each group

    表3 各組大鼠肝脂指標比較Table 3 The comparison of liver lipid indexes of rats in each group

    2.4 各組大鼠血糖變化比較 與正常組相比,模型組血糖在三個時間段均明顯升高 (P<0.05);與模型組相比,在治療1周和2周后,鹽酸二甲雙胍組血糖明顯降低 (P<0.05),但富硒靈芝三個組在第0天和7天均沒有明顯變化,治療第14天,富硒靈芝高劑量組低于模型組 (P<0.05),見表4。

    表4 各組大鼠血糖比較Table 4 The comparison of blood glucose of rats in each group

    2.5 脂代謝基因蛋白表達特點 與正常組相比,模型組大鼠肝臟組織中SREBF-1c及ACCα蛋白表達均明顯升高 (P<0.05),SCD1和PPARα均明顯降低 (P<0.05);與模型組相比,各治療組均有一定改善(P<0.05);與鹽酸二甲雙胍組相比,富硒靈芝三個劑量組SREBF-1c表達無明顯差異(P>0.05),PPARα表達明顯升高 (P<0.05),富硒靈芝中劑量和高劑量組ACCα蛋白表達明顯降低 (P<0.05),SCD1明顯升高 (P<0.05),見表5、圖2。

    圖2 各組大鼠肝臟組織SREBF-1c、ACCα、SCD1和PPARα蛋白表達Figure 2 The protein expression results of SREBF-1c,ACCα,SCD1 and PPARα in liver tissues of rats in each group注:圖中A、B、C、D、E和F分別為正常組、模型組、鹽酸二甲雙胍組、富硒靈芝低劑量組、富硒靈芝中劑量組和富硒靈芝高劑量組

    表5 各組大鼠肝臟組織SREBF-1c、ACCα、SCD1和PPARα的相對表達量Table 5 The protein relative expression of SREBF1,ACCα,SCD and PPARα in liver tissues of rats in each group

    3 討論

    現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,血脂代謝失調(diào)或高脂食物的過度攝入是孕婦發(fā)生糖尿病的原因之一,而血脂的有效調(diào)控對孕婦的預(yù)后較好[9-10]。血脂異常與肝臟脂代謝密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)[11]肝臟是調(diào)節(jié)脂代謝的核心器官,因此GDM患者應(yīng)重視肝功能和血脂的變化。但孕婦用藥過失可給患者自身和胎兒帶來一定的損害。目前臨床中對于GDM的治療主要以飲食調(diào)節(jié)+注射胰島素或口服降糖藥物為主[12-13],但其仍可產(chǎn)生一定副作用,且胰島素或口服降糖藥物對血脂調(diào)控較差。中醫(yī)藥在調(diào)控血脂方面也具有一定的優(yōu)勢,作為中醫(yī)藥瑰寶之一,靈芝在改善肝功能、降低血脂方面有較多文獻報道,而富硒靈芝相對于靈芝而言,藥理活性相對更高[14-15],其對GDM是否也有一定的作用還缺少研究證實,為此本研究開展了上述研究。

    AST和ALT是評價肝功能變化的核心指標。對于正常人,血清中AST和ALT含量較低,而GDM特別是肥胖型GDM患者,肝臟中堆積有大量脂肪顆粒,這些脂肪顆??蓴D壓肝臟細胞,進而造成肝臟中AST和ALT過量分泌,最終造成血清中AST和ALT的升高[16]。本研究顯示,與正常組相比,模型組大鼠血清中AST和ALT明顯升高,而富硒靈芝可明顯的降低二者含量,這提示富硒靈芝對GDM大鼠肝臟具有明顯的保護作用,與陳利明等[15]研究結(jié)果相似。富硒靈芝可有效改善肝功能。脂肪肝發(fā)生后,血脂四項可表現(xiàn)為TG、TC和LDL-C的升高和HDL-C的降低,這些指標如果長期異常,對于孕婦自身而言,可引起動脈硬化、心肌梗死等,而對于胎兒而言,可造成巨大兒的發(fā)生,甚至可提高胎兒成年后多種代謝性疾病的發(fā)生率[17-19],因此需積極關(guān)注孕婦血脂變化。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組TG、TC和LDL-C明顯升高,HDL-C明顯降低,富硒靈芝和鹽酸二甲雙胍均可以明顯降低TG、TC和LDL-C含量,升高HDL-C,且富硒靈芝中、高劑量組效果明顯好于鹽酸二甲雙胍組,表明富硒靈芝對妊娠期糖尿病大鼠血脂代謝具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

    脂代謝的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程,目前主要有兩種方式,一種為α氧化,另一種為β-氧化,其中α氧化主要是脂肪酸合成的關(guān)鍵信號通路,主要作用為將攝入的糖類合成脂肪,而β-氧化主要是脂肪酸分解的重要信號通路,主要作用為促進脂肪酸的分解代謝[20-22]。在脂肪酸α氧化過程中SREBP-1c是合成的起始酶,其表達的升高直接影響肝臟中脂肪酸合成量的高低[23]。而脂肪酸β-氧化的主要蛋白酶有三個,分別為ACCα、SCD1 和 PPARα,其中ACCα是脂肪酸β-氧化的限速酶,PPARα和SCD1是脂肪酸ββ氧化的促進酶,在脂肪酸β-氧化過程中,ACCα表達的升高和PPARα和SCD1表達的降低,可造成脂肪酸分解的降低,反之亦然[24]。為此本研究從脂肪酸氧化途徑觀察富硒靈芝對GDM大鼠血脂調(diào)控的作用,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組大鼠肝臟組織中SREBF-1c及 ACCα 蛋白表達明顯升高,SCD1和PPARα表達明顯降低,富硒靈芝和鹽酸二甲雙胍均可以有效的降低SREBF-1c及 ACCα表達,升高SCD1和PPARα,這提示富硒靈芝對調(diào)節(jié)脂代謝具有明顯的作用。同時結(jié)果也可以看出,富硒靈芝相較于鹽酸二甲雙胍,主要優(yōu)勢是在調(diào)控脂肪酸β-氧化方面,提示富硒靈芝改善脂肪酸代謝,特別是改善脂肪酸β-氧化方面具有較好的優(yōu)勢,其降低血脂也可能是通過調(diào)節(jié)脂肪酸β-氧化實現(xiàn)的。

    4 結(jié)論

    富硒靈芝對妊娠期糖尿病大鼠脂肪酸代謝具有明顯的調(diào)控作用,其可通過調(diào)節(jié)脂肪酸α氧化和β-氧化相關(guān)蛋白酶,特別是調(diào)節(jié)β-氧化相關(guān)蛋白酶,進而降低血脂,改善肝功能,最終保護肝臟。本研究結(jié)果對今后妊娠期糖尿病患者的輔助治療具有重要的啟迪意義。

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