FIV靜置對(duì)FIV沉淀分離及人血白蛋白質(zhì)量影響的研究

李 劍 金 川 李 銳 楊建東 于 李

（成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，四川 成都 610000）

人血白蛋白因具有維持血管內(nèi)膠體滲透壓，結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)各種脂肪酸、激素、離子以及多種藥物的重要生物學(xué)功能，被廣泛應(yīng)用于各種低白蛋白癥或創(chuàng)傷性休克[1]及肝硬化或腎病引起的水腫或腹水等疾病。近年來(lái)，隨著人血白蛋白臨床需求的不斷增加，人血白蛋白的進(jìn)口量不斷增大[2]，2020年進(jìn)口白蛋白已占國(guó)內(nèi)批簽發(fā)總量63.96%，而隨著監(jiān)管日趨嚴(yán)格和血漿資源緊缺，國(guó)內(nèi)血液制品廠(chǎng)家將面臨更大挑戰(zhàn)，所以不斷優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高血漿綜合利用率和產(chǎn)品質(zhì)量是當(dāng)前各大本土廠(chǎng)家面臨的迫切課題。目前市場(chǎng)上大多數(shù)血液制品企業(yè)采用的是改良后的低溫乙醇工藝 Cohn6/9 法或 N-K（Nitschmann-Kistler）法[3]，該法在低溫乙醇條件下通過(guò)在各個(gè)分離階段改變（pH、溫度、蛋白濃度、離子強(qiáng)度、乙醇濃度）五變參數(shù)等措施，經(jīng)多步沉淀和壓濾分離，使中間制品固液相分離，使目標(biāo)蛋白不斷純化。在FIV分離階段各個(gè)廠(chǎng)家根據(jù)自身工藝條件、分離步驟及工藝參數(shù)都有所不同，針對(duì)FIV制作反應(yīng)結(jié)束后有無(wú)靜置及靜置時(shí)間也并不一致，長(zhǎng)時(shí)間靜置對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量及安全性方面影響文獻(xiàn)報(bào)道較少。該實(shí)驗(yàn)采用低溫乙醇工藝制備人血白蛋白時(shí)，在FIV階段制作完成后通過(guò)有無(wú)靜置的不同工藝，來(lái)比較2種不同工藝對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

主要材料與設(shè)備包括95%醫(yī)用乙醇 、助濾劑、注射用水、健康人血漿、緩沖液、壓濾機(jī)（EUROFILTEC FC.800. AC）、全自動(dòng)電泳儀（MICROTECH648ISO）、高效液相色譜儀（Agilent1200）、動(dòng)態(tài)試管儀。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)采用低溫乙醇工藝制備人血白蛋白時(shí)，在工藝穩(wěn)定的情況下，確保各項(xiàng)工藝參數(shù)的一致性，在FIV制作反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)2組各16個(gè)投漿批次分別采取無(wú)靜置直接壓濾分離和靜置（48h）后壓濾分離的不同參數(shù)控制工藝，將其合并為相對(duì)應(yīng)的8個(gè)FV沉淀精制，對(duì)批次后續(xù)制劑階段產(chǎn)品的多聚體含量、純度等關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)及其原液內(nèi)毒素含量進(jìn)行分析。工藝流程如圖1所示。

圖1 工藝流程圖

1.2.1 過(guò)濾壓力

取FIV 過(guò)濾整個(gè)過(guò)程最大壓力作為過(guò)濾壓力，記錄2種不同參數(shù)控制工藝所達(dá)到的壓力 （MPa）。

1.2.2 多聚體含量

使用 HPLC檢測(cè)人血白蛋白成品的多聚體含量，對(duì)比2種不同的FIV參數(shù)工藝下所得的產(chǎn)品中多聚體含量的情況。

1.2.3 純度

使用醋酸纖維素薄膜電泳法檢測(cè)人血白蛋白成品純度，對(duì)比2種不同的FIV參數(shù)工藝下所得的產(chǎn)品純度情況。

1.2.4 原液內(nèi)毒素含量

使用動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定人血白蛋白原液的內(nèi)毒素含量，對(duì)比2種不同的FIV參數(shù)工藝下所得的原液內(nèi)毒素含量情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Microsoft Office Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） ”表示，采用獨(dú)立樣本 T 檢驗(yàn)用于數(shù)據(jù)的比較，以P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)濾壓力

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)IV階段靜置（48h）后過(guò)濾16批人血白蛋白制品過(guò)濾壓力為（0.22±0.01）MPa，而無(wú)靜置直接過(guò)濾16批人血白蛋白制品過(guò)濾壓力為（0.29±0.01）MPa，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-16.56，P=1.2258E-16，P<0.000），表明采用靜置后過(guò)濾在過(guò)濾過(guò)程中能明顯降低過(guò)濾壓力，見(jiàn)圖2。

圖2 FIV反應(yīng)結(jié)束16批次有無(wú)靜置過(guò)濾壓力變化

2.2 主要質(zhì)量指標(biāo)比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)IV階段靜置（48h）后過(guò)濾8批人血白蛋白產(chǎn)品純度為（98.29±0.11）%，多聚體為（2.80±0.18）%，而無(wú)靜置直接過(guò)濾8批人血白蛋白產(chǎn)品純度為（98.20±0.11）%，多聚體為（2.80±0.17）%，2組數(shù)據(jù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為1.594和0.000），P分別為0.133和1.000），表明2種不同的FIV參數(shù)工藝在多聚體及純度指標(biāo)上并未表現(xiàn)出明顯變化。見(jiàn)圖3、圖4和表1。

圖3 FIV反應(yīng)結(jié)束有無(wú)靜置改變?nèi)搜椎鞍壮善范嗑垠w變化

圖4 FIV反應(yīng)結(jié)束有無(wú)靜置改變?nèi)搜椎鞍壮善芳兌茸兓?/p>

表1 FIV反應(yīng)結(jié)束有無(wú)靜置過(guò)濾主要質(zhì)量指標(biāo)的比較

2.3 原液內(nèi)毒素指標(biāo)

由于中國(guó)藥典2020版人血白蛋白原液檢定無(wú)內(nèi)毒素限值要求，參考半成品熱原檢查細(xì)菌內(nèi)毒素限值蛋白濃度20%應(yīng)小于1.67EU/ml[4]，將16批FV沉淀合并為相對(duì)應(yīng)的8批次FV沉淀精制（每2投漿批次合并為1批FV沉淀精制），經(jīng)超濾后制成原液分別檢測(cè)原液內(nèi)毒素含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，原液內(nèi)毒素含量均處于極低水平。見(jiàn)表2。

表2 FIV反應(yīng)結(jié)束有無(wú)靜置原液內(nèi)毒素變化

3 討論

低溫乙醇工藝生產(chǎn)人血白蛋白時(shí)當(dāng)血漿蛋白經(jīng)FI+II+III壓濾分離獲得上清液后，進(jìn)入FIV分離階段，F(xiàn)IV分離純化效果對(duì)最終產(chǎn)品的收率和質(zhì)量影響尤為關(guān)鍵。FIV分離純化主要通過(guò)制作和壓濾2個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)，在制作過(guò)程結(jié)束后通常采用老化和適當(dāng)靜置的方法，延長(zhǎng)制品反應(yīng)時(shí)間，促使溶液中等電點(diǎn)蛋白更完全充分沉淀，以期望達(dá)到更好的分離效果。在進(jìn)入過(guò)濾階段通過(guò)壓濾分離能夠有效去除熱原和各種雜質(zhì)（α-球蛋白、β-球蛋白、凝血酶原、PKA、變性蛋白等），實(shí)現(xiàn)廢棄沉淀和上清液分離，所以為了達(dá)到更佳的固液相分離效果，如何合理選用濾板和助濾劑種類(lèi)（硅藻土、珍珠巖）及用量，過(guò)濾過(guò)程溫度保證、過(guò)濾壓力、濾液澄清度、流速控制等，將直接影響過(guò)濾過(guò)程中過(guò)濾效果，從而影響壓濾分離質(zhì)量。

有研究表明，為了避免蛋白溶液在離心和泵送過(guò)程中，由于高剪切力對(duì)沉淀顆粒造成的破壞，在反應(yīng)條件終止后和離心或壓濾操作前，此時(shí)沉淀物已經(jīng)生成，在這種情況下已經(jīng)可以進(jìn)行下一步工藝如壓濾或離心等固液分離步驟，但也可使沉淀物與母液在一定條件下繼續(xù)靜置一段時(shí)間，進(jìn)行“批次老化”，以進(jìn)一步促進(jìn)沉淀形成，使沉淀物的性質(zhì)隨時(shí)間發(fā)生不可逆的結(jié)構(gòu)變化，能夠改善分離質(zhì)量[5]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)告相符，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果更進(jìn)一步表明在FIV階段采取靜置（48h）后壓濾分離，與無(wú)靜置直接壓濾相比，過(guò)濾壓力降低24.14%，分析原因可能是由于在老化和靜置期間，在沉淀的形成過(guò)程中沉淀蛋白顆粒強(qiáng)度增加、直徑增大[5]， 晶型完善與晶形轉(zhuǎn)變等密切相關(guān)，制品在低頻條件和靜態(tài)混合過(guò)程中，沉淀蛋白的聚合發(fā)生結(jié)構(gòu)上變化，空間構(gòu)型更加穩(wěn)固，對(duì)剪切力有較強(qiáng)抵抗力，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，沉淀蛋白質(zhì)顆粒直徑增大，強(qiáng)度增加也有助于在壓濾過(guò)程中與助濾劑一起形成更加疏松的濾餅，有利于提高濾過(guò)液的流速，從而降低了過(guò)濾壓力。而楊宇等的研究表明，各種濾材均有其過(guò)濾面積和最大過(guò)濾壓力承受負(fù)荷，過(guò)濾壓力降低一方面能夠降低過(guò)濾過(guò)程中因過(guò)濾壓力過(guò)高帶來(lái)的安全隱患；另一方面，如果過(guò)濾壓力過(guò)高超過(guò)濾材最大承受壓力負(fù)荷，將會(huì)導(dǎo)致過(guò)濾效果下降，影響產(chǎn)品質(zhì)量[6]。而FIV階段在隨著制品不斷過(guò)濾，在過(guò)濾中后期濾餅厚度增加，過(guò)濾壓力出現(xiàn)明顯升高，過(guò)濾阻力增大，導(dǎo)致過(guò)濾流速緩慢，出現(xiàn)過(guò)濾時(shí)間延長(zhǎng)現(xiàn)象，而廢棄沉淀收集時(shí)濾餅中液體含量往往較多，所以過(guò)濾壓力改變，將直接影響過(guò)濾性能。

FIV階段有無(wú)靜置成品多聚體及純度指標(biāo)并未表現(xiàn)出明顯變化，可見(jiàn)低溫乙醇工藝由不同的生產(chǎn)工藝模塊構(gòu)成，作為在每個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)處于連續(xù)流動(dòng)式運(yùn)行的復(fù)雜生產(chǎn)系統(tǒng)，要在每個(gè)生產(chǎn)工藝步驟獲得最佳的分離純化效果， 須充分考慮五變參數(shù)調(diào)整，對(duì)降溫幅度、攪拌速度及緩沖液添加速度等關(guān)鍵影響因素進(jìn)行細(xì)致研究，單一改變某一非關(guān)鍵工藝過(guò)程并不會(huì)對(duì)最終產(chǎn)品質(zhì)量造成明顯影響。兩者原液內(nèi)毒素含量方面相比，均處于極低的水平，經(jīng)分析長(zhǎng)時(shí)間靜置的制品在低溫乙醇條件下儲(chǔ)存于密閉容器中，有效避免與生產(chǎn)環(huán)境空氣中微粒、微生物接觸，而且制品處于低溫乙醇狀態(tài)下也不利于微生物滋生。所以為了確保長(zhǎng)時(shí)間靜置過(guò)程中制品微生物安全，生產(chǎn)操作過(guò)程中人員操作、潔凈室環(huán)境、設(shè)備清潔效果、物料的投放方式等需要保證規(guī)范，并且對(duì)其進(jìn)行持續(xù)監(jiān)控，避免人員操作過(guò)程中無(wú)意識(shí)情況下將潔凈室微粒、微生物等異物混入制品中，反應(yīng)液在整個(gè)生產(chǎn)周期應(yīng)盡量在密閉容器環(huán)境下生產(chǎn)，保證工藝流程穩(wěn)定和可控，才能保證人血白蛋白生產(chǎn)工藝生產(chǎn)出安全的產(chǎn)品。

4 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在FIV分離階段采取靜置（48h）后壓濾分離，能夠明顯降低過(guò)濾壓力以及單位面積內(nèi)濾板壓力負(fù)荷，防止過(guò)濾壓力過(guò)高造成濾板構(gòu)造改變乃至破損，從而導(dǎo)致過(guò)濾性能下降或失效風(fēng)險(xiǎn)（濾液濁度偏高、濾液渾濁），靜置（48h）后壓濾分離有利于沉淀物的收集，確保固液分離的質(zhì)量。而在產(chǎn)品質(zhì)量方面，2種不同的FIV參數(shù)工藝在多聚體及純度指標(biāo)上并未表現(xiàn)出明顯變化，其最終產(chǎn)品質(zhì)量均符合《中國(guó)藥典》要求，在原液內(nèi)毒素含量方面均處于檢測(cè)下限，表明FIV階段長(zhǎng)時(shí)間靜置能夠確保微生物安全，所以在FIV分離階段適當(dāng)設(shè)定靜置時(shí)間，能夠有效改善制品的分離質(zhì)量，保障產(chǎn)品安全性。