人凝血因子Ⅷ的研究進(jìn)展

黃錦程

【摘要】凝血因子Ⅷ是治療血友病的常見類型，具有良好的耐藥性、安全性和療效。由于凝血因子Ⅷ的半衰期相對(duì)較短，通常需要大劑量預(yù)防和治療出血，以及頻繁輸血，本文綜述了延長(zhǎng)凝血因子Ⅷ半衰期的研究進(jìn)展和最重要的技術(shù)方法。人凝血因子是人血漿中一種重要的蛋白，用于降低出血的風(fēng)險(xiǎn)。是人體凝血的激活途徑的重要蛋白組分之一。低凝血因子Ⅷ水平可導(dǎo)致不同程度的凝血障礙。目前，血漿冷沉淀在我國(guó)主要用作血漿凝血因子Ⅷ儲(chǔ)存的原料，也可以用離子交換法進(jìn)行凈化。采用血漿收集、熔化、離心冷卻。研究了離子交換層析、病毒滅活和冷凍干燥，主要針對(duì)這些方面展開研究。

【關(guān)鍵詞】人類;凝血因子Ⅷ;研究;進(jìn)展

【中圖分類號(hào)】R973 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2021.12.209

前言

凝集素是人體血漿中最重要的蛋白質(zhì)之一，也是靜脈血液循環(huán)的重要組成部分。目前，血液中凝血因子Ⅷ水平較低是甲型血友病的指標(biāo)，根據(jù)世衛(wèi)組織預(yù)防血友病的數(shù)據(jù)可能會(huì)有不同的水平，它是凝血因子Ⅷ編碼基因突變導(dǎo)致該凝血因子功能缺陷所致的一種凝血功能障礙性遺傳病全世界每10000人中有1人發(fā)病。隨著檢測(cè)手段的普及，更多的患者被發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)顯示，盡管凝血因子Ⅷ供應(yīng)量有所上升，但國(guó)內(nèi)仍存在供不應(yīng)求的問題。中國(guó)一直在進(jìn)口凝血因子Ⅷ很多年了。造成我國(guó)凝血因子短缺的主要原因是生產(chǎn)技術(shù)，比如上海生物制品研究所有限公司的FVIII產(chǎn)品就可以生產(chǎn)。考慮到國(guó)家政策的影響，有必要開發(fā)一條新的血漿生產(chǎn)線。在開發(fā)的同時(shí)生產(chǎn)研制凝血因子Ⅷ， 應(yīng)加快產(chǎn)品的市場(chǎng)推廣，對(duì)冷藏和溶出的制備進(jìn)行了研究。

1 ?FⅧ的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

1.1結(jié)構(gòu)

FⅧ主要由肝細(xì)胞組成。前體含有2351個(gè)氨基酸，這些氨基酸從內(nèi)網(wǎng)中去除，形成硫鍵和N-糖基化。一個(gè)B場(chǎng)和兩個(gè)C場(chǎng)在A1、A2和A3之后有較短的酸性區(qū)，而f場(chǎng)在A1、A2和A3之后有較短的酸性區(qū)Ⅷ序列域是一個(gè)高水平的N-糖基化區(qū)，與F無關(guān)Ⅷ 活動(dòng)，但只能通過身體的加工和分泌;在A2和A3地區(qū)，硫化酪蛋白被用作FⅧ的附加因子。大多數(shù)FⅧ在b-a3或b區(qū)被分成兩條獨(dú)立的鏈，輕鏈由a3-c1-c2組成;重鏈由a1-a2和B區(qū)組成。B區(qū)的長(zhǎng)度隨B區(qū)的長(zhǎng)度而變化。同時(shí)，一些金屬離子（如Ca′或Mn）可以通過改變蛋白質(zhì)含量進(jìn)行配位，F(xiàn)VI與vwF-a3（和C2）結(jié)合的關(guān)鍵在于，F(xiàn)VI與vWF的結(jié)合覆蓋了FVI、vWF-FⅧ和磷酸鹽的接觸點(diǎn)，以防止F的去除Ⅷ 磷脂，防止x-酶復(fù)合物的形成，保護(hù)fⅧ 從激活FXa和活性蛋白C，延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期。

1.2活化與失活

FⅧ被激活為FⅧ通過己糖或FXa。凝集酶與重鏈中的a1-a2和a2-b結(jié)合，與輕鏈N端的Arg 1689結(jié)合，在這些區(qū)域，切斷FVI的作用。FXa與血栓形成的機(jī)制相同，但也有不同于血栓形成的跡象。FXa與C2的相互作用可能影響重鏈的分裂，而C2不影響血小板酶的分裂;活化后，F(xiàn)Ⅷ和vWF重組形成三個(gè)組合;活化后，F(xiàn)Ⅷ與磷脂固定劑和Ca2+相互作用形成酶因子X，兩組疏水基團(tuán)被用于磷酸雙層膜，當(dāng)一系列a-殘基相互作用形成鹽橋時(shí)，F(xiàn)Ⅷ a大大提高了FX的催化效率。FⅧA和FX由鹽橋通過靜電有源f來控制Ⅷ A是非常不穩(wěn)定的，A2區(qū)域可以很容易地從這三種組合中分離出來。一些新的重組FⅧ提高了穩(wěn)定性，一種防止A2解離的方法是在f的半衰期內(nèi)保留一個(gè)小片段Ⅷ 在輕鏈A3中，硫酸和A2之間的共價(jià)鍵可以通過基因突變而增加另一種可能的生命損失是活化蛋白A的水解。APC將A2分為arg562，將A1分為arg336。然而，arg336的分裂改變了A1和A2之間的相互作用，導(dǎo)致因子活性的喪失和高血栓含量Ⅷ 保持凝血和抗凝劑的平衡。

2 ?FVIII的制備

2.1概述

1965年美國(guó)開發(fā)了一種在封閉無菌系統(tǒng)中從單個(gè)血漿生產(chǎn)冷沉淀制劑的方法。但是，冷沉淀制劑的比活性尚不確定，其純度低，含有血型微粒和抗體，可引起過敏反應(yīng)。70年代以后，發(fā)展了以冷沉淀為原料制備分離純化的方法，90年代用單克隆抗體親和層析技術(shù)制備了兩種高純度的FⅧ制劑。單抗親和層析法具有收率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。FⅧ制劑的純度不斷提高，生產(chǎn)過程中進(jìn)行嚴(yán)格的病毒活化處理，目前在臨床上廣泛應(yīng)用。所有產(chǎn)品均來自人血漿，主要使用離子交換色譜法從人血漿冷凍沉淀液中分離純化。

2.2離子交換色譜法

以往的沉淀法如聚乙二醇沉淀法和甘氨酸沉淀法生產(chǎn)的FⅧ純度較低。纖維蛋白原（FG）、纖維連接蛋白（FN）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）含量較高，F(xiàn)Ⅷ含量不到總蛋白的1%。先驅(qū)采用凝膠色譜法生產(chǎn)高純度FⅧ制劑，冷凍沉淀液溶解后用氫氧化鋁吸附去除維生素K依賴性凝血因子，殘?jiān)皆谥稀Ｓ捎谄浯罂讖胶腿跏杷?，樹脂?duì)FⅧ有很強(qiáng)的結(jié)合力。該方法可使傳統(tǒng)FⅧ制劑的純度提高200倍，產(chǎn)品穩(wěn)定性高。國(guó)內(nèi)幾家廠商經(jīng)常采用這種生產(chǎn)工藝或在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化和進(jìn)一步改進(jìn)。

2.3基因工程法

重組凝血因子FⅧ是第一個(gè)利用DNA人工重組技術(shù)生產(chǎn)和銷售的重組凝血因子。類似天然FⅧ的生化特性已成為許多發(fā)達(dá)國(guó)家最重要的藥物。FVIII位于X染色體長(zhǎng)臂的末端，重組長(zhǎng)度FⅧ代表機(jī)體的重組，它是將整個(gè)人類DNA序列的表達(dá)包含在向量機(jī)中產(chǎn)生的。以微粒子為表達(dá)載體，對(duì)克隆進(jìn)行了高度檢測(cè)。在沒有血清培養(yǎng)的情況下，加入牛胰島素、人蛋白和蛋白酶抑制劑。細(xì)胞分批培養(yǎng)，經(jīng)親和層壓和二級(jí)離子交換純化。由于FⅧ的結(jié)構(gòu)域不影響其活性，而結(jié)構(gòu)域B的缺失導(dǎo)致其表達(dá)量增加了20倍，因此FⅧ該結(jié)構(gòu)域中缺失的產(chǎn)物被開發(fā)出來。培養(yǎng)基中還含有人血清蛋白和重組胰島素500升培養(yǎng)液。培養(yǎng)是一種連續(xù)注射法。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到上限時(shí)，溫度轉(zhuǎn)化為溶解氧，油酸酯進(jìn)入生產(chǎn)階段，殘?jiān)粩喾e累。殘?jiān)?jīng)S/D破壞后，通過各種色譜程序進(jìn)行純化，然后冷凍干燥得到。

3 ?過程

3.1血漿采集保存

生物血漿是一種通過一次提取獲得的健康人體血漿，用于生產(chǎn)血漿蛋白原代血漿是血漿蛋白公司的生命線低溫儲(chǔ)存在血漿采集過程中影響原血漿中FⅧ的活性，影響FⅧ活性的因素很多，包括貯藏溫度、pH值、血漿中無機(jī)鹽離子、微球等蛋白質(zhì)參與制造過程，影響FⅧ的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，檸檬酸鹽含量對(duì)FⅧ的穩(wěn)定性有影響，檸檬酸鹽能與Ca2+血漿結(jié)合。Ca2+的減少導(dǎo)致了FⅧ層的不穩(wěn)定性。冷凍原始血漿是一個(gè)非常重要的步驟。影響血漿冷凍的因素包括冷凍時(shí)間、冷凍速度、血漿收集容器的形狀、體積和厚度。通過時(shí)間和溫度的結(jié)合，不穩(wěn)定成分如FⅧ的損失可以最小化?？焖倮鋮s或一次提取血漿可防止或減少血漿中FⅧ的丟失，血漿的緩慢凍結(jié)表明大部分FⅧ已丟失;冷凍血漿的最佳儲(chǔ)存溫度不高于-30，冷凍血漿的最佳儲(chǔ)存溫度為-2。血漿快速冷凍需要2小時(shí)，核溫度不低于-20，對(duì)凝血活性有很大影響。血漿損耗因子很快，因此需要冷鏈加料系統(tǒng)來控制原血漿傳輸過程的質(zhì)量。

3.2冷沉積

冷沉淀是以新鮮冰凍血漿經(jīng)低溫解凍制成的白色片狀制劑，含有纖維蛋白、纖維化連接物、FX等;目前，國(guó)內(nèi)血管中心水浴虹吸式熔融控制、CPC熔融離心、FFP室溫凝固5分鐘，然后用雙袋軟化管，將血漿溶解于水浴中，從血袋中取出60ml冰，離心，在冷沉淀中沉淀約25ml下層。熔點(diǎn)數(shù)字控制是指在室溫下軟化管后，F(xiàn)FP設(shè)定5分鐘，但血漿在水浴中形成一定的滴高;多余的血漿堆積在空袋中，剩余的40-50毫升冷凍血漿堆積在冷血沉積物中。與虹吸法相比，離心法對(duì)FⅧ、纖維蛋白原和VWF的提取率較高。離心水浴用于控制初始溫度和熔化時(shí)間。在解凍過程中，采用圓形槽進(jìn)行解凍，以保證血漿包的溫度均勻性。

4 ?半衰期延長(zhǎng)的方法

4.1緩釋

持續(xù)釋放是為了延緩凝血因子Ⅷ的釋放速率，并通過一定的處理降低藥物進(jìn)入血液的速率，以進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的生物利用度和穩(wěn)定性。脂質(zhì)體用于將蛋白質(zhì)包裹在磷脂囊泡中，并將其與外部載體結(jié)合。重組FⅧ已被納入長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體中。因子Ⅷ的半衰期可延長(zhǎng)1.5～1.6倍。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以長(zhǎng)時(shí)間釋放活性和未修飾的蛋白質(zhì)。

4.2.化學(xué)改性

該方法的目的是通過化學(xué)改性延長(zhǎng)F-Ⅷ的半衰期，防止和消除壽命損失。在這種方法中，與親水性聚合物相關(guān)的特定蛋白質(zhì)分子通常被聚乙二醇和有機(jī)硅修飾，也稱為PEG修飾。聚乙二醇（PEG）是一種由環(huán)氧乙烷形成的可與蛋白質(zhì)分子中活性物質(zhì)基團(tuán)結(jié)合的重復(fù)鏈。偶數(shù)連接后，與2-3個(gè)水分子結(jié)合;這不僅提高了蛋白質(zhì)在水中的溶解度，而且增加了其分子量。腎臟根據(jù)物質(zhì)的大小進(jìn)行過濾，這樣加入分子量的聚乙二醇后，蛋白質(zhì)的脫落實(shí)際上會(huì)減慢;球形結(jié)構(gòu)，作為保護(hù)肽，防止蛋白質(zhì)分解;同時(shí)，針對(duì)不同的治療方法可以優(yōu)化蛋白質(zhì)免疫、藥代動(dòng)力學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)，利用PEG與不同蛋白質(zhì)間的共價(jià)化合物在臨床研究中，聚乙二醇化可以顯著延長(zhǎng)半衰期和凝血效果。雖然這一成熟的技術(shù)已在原則上證明了蛋白質(zhì)復(fù)合物的可行性，但仍存在一些局限性。PSA線性和均勻的聚苯乙烯是一種連接唾液的獨(dú)特碳水化合物;它具有很高的親水性、生物相容性和生物相容性。為了提高藥物的穩(wěn)定性和藥理作用，藥物的蛋白質(zhì)或肽表面以化合物的形式與唾液相關(guān)值相連，根據(jù)報(bào)道，聚氨酯改性是防止蛋白質(zhì)制劑降解的最佳方法，結(jié)果表明，SOD不僅能保持天然酶的高活性，而且能維持天然酶的高活性，而且在倫敦酸堿穩(wěn)定性方面具有優(yōu)于天然酶的優(yōu)勢(shì)，一個(gè)在格雷戈瑞大學(xué)的團(tuán)隊(duì)使用聚氨酯作為糖鏈的來源。結(jié)果表明：改性蛋白在血液中的半衰期明顯延長(zhǎng)，免疫原性和抗體降低，抗蛋白酶活性增強(qiáng)。干擾素的聚氨酯半衰期長(zhǎng)。

4.3遺傳突變

隨著人類三級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)領(lǐng)域的公布，隨著基因工程的迅速發(fā)展，F(xiàn)Ⅷ得到了迅速的發(fā)展?；蚬こ痰哪繕?biāo)是減少蛋白質(zhì)代謝。常用的技術(shù)包括轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化、基因和蛋白質(zhì)去除。FⅧ通過限制腦酶的消化和活化而導(dǎo)致異源三聚體的不穩(wěn)定性，A2亞類可迅速降解，從而限制其活性延長(zhǎng)FⅧ半衰期的可能性之一是FⅧ在體外比野生FⅧ具有更強(qiáng)的活性和穩(wěn)定性。FⅧ蛋白至少有三種LRP類型，分別位于A2、A3和C端。這些節(jié)點(diǎn)的突變會(huì)影響FⅧ與磷酸鹽、固定液和vWF的相互作用，從而延長(zhǎng)FⅧ的半衰期。

4.4蛋白融合

FⅧ融合蛋白技術(shù)越來越受到人們的重視，該技術(shù)利用重組DNA從FⅧ或N端合成載體蛋白。最常見的蛋白質(zhì)載體是血清白蛋白和免疫球蛋白（IgG）Fc片段，人血清蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，其分子量為-67kDa。廣泛分布于血管和血管外腔。它的半衰期長(zhǎng)達(dá)19天，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，作為血液和藥物中重要的物質(zhì)載體，已成為藥物設(shè)計(jì)的理想蛋白質(zhì)載體，以提高半衰期，減緩藥物的清除，增加藥物的作用，白蛋白已被證明是蛋白質(zhì)整合的載體，它能有效地延長(zhǎng)各種蛋白質(zhì)的半衰期，包括胰島素、氨基酶等生物體的半衰期約為20天，其穩(wěn)定性是由于IgG的Fc片段能與新的Fc受體結(jié)合，阻止IgG在溶酶體中的分解。用Fc片段IgG與活性蛋白結(jié)合形成整合素，增加活性蛋白在體內(nèi)的半衰期，達(dá)到長(zhǎng)期的目的。

5 ?結(jié)束語(yǔ)

既要重視藥物的有效性和安全性，又要提高患者的生活質(zhì)量。通過開發(fā)具有長(zhǎng)半衰期的新蛋白質(zhì)來治療血友病。開發(fā)長(zhǎng)期物理因子FⅧ具有很大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)優(yōu)勢(shì)，近年來的研究表明，一些方法取得了滿意的效果，但也存在一定的局限性，如何降低療效指標(biāo)，減少免疫原材料，減少與其他蛋白質(zhì)的相互作用。進(jìn)一步的研究將為新技術(shù)的發(fā)展提供更多的機(jī)會(huì)。深入了解FⅧ的結(jié)構(gòu)和功能，一方面有助于從基因水平了解血友病患者的特點(diǎn)，另一方面本文介紹了FⅧ高純度產(chǎn)品的研制，為血友病A的診斷和治療提供了更有效的方法。隨著新技術(shù)的引進(jìn)和各種色譜技術(shù)的應(yīng)用，利用載體和色譜法，F(xiàn)VIII具有高純度和高利用率，基因工程在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用，具有良好的應(yīng)用前景和顯著的經(jīng)濟(jì)效益。

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