骨龍膠囊對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝及骨量的影響

胡繼兵， 鄧馨悅， 張英馳， 李文凱*

(1.湖北省紅安縣人民醫(yī)院，湖北 黃岡 438400；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430030)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是一種退變性疾患，以骨量丟失、骨代謝加快和易發(fā)生骨折為特點(diǎn)[1-2]。PMOP及其相關(guān)骨折逐漸成為一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題和沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)。2015 年中國(guó)大陸地區(qū)40歲以上人群骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率為24.62%，約1.4億患病人群[3]。按骨質(zhì)疏松癥的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)中相近的病癥有“骨痿”、“骨痹”等，以補(bǔ)腎益精、健脾益氣、活血祛瘀為主要治療方法[4-5]。骨龍膠囊含狗腿骨及穿山龍，主用于骨與關(guān)節(jié)風(fēng)寒痹阻、肝腎不足者，有散寒鎮(zhèn)痛、活血祛風(fēng)及強(qiáng)筋壯骨作用[6]，但尚未見(jiàn)骨龍膠囊治療PMOP的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)建立去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型，評(píng)價(jià)骨龍膠囊對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝及骨量的影響，為指導(dǎo)臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 骨龍膠囊(山東東阿阿膠股份有限公司，批號(hào)1911004)，生理鹽水制成0.1 g/mL灌胃液；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，生產(chǎn)批號(hào)499A)。骨鈣素(BGP)檢測(cè)試劑盒(北京奇松生物科技有限公司)；堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒及血鈣、磷檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；肝素、4%多聚甲醛、2%戊巴比妥鈉(武漢博士德生物工程有限公司)。MicroCT(vivaCT 40，瑞士Scanco公司)。

1.2 分組、造模及給藥 48只清潔級(jí)2月齡雌性SD大鼠，體質(zhì)量(170±21)g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供及飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(鄂)2008-0005，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組，卵巢切除(Ovariectomize, OVX，卵巢切除后大鼠體內(nèi)雌激素模擬人絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松)組，陽(yáng)性對(duì)照組(OVX+戊酸雌二醇)，低、中、高劑量骨龍膠囊組(OVX+骨龍膠囊)，每組8只，骨質(zhì)疏松造模方法同文獻(xiàn)[7]，假手術(shù)組不切除卵巢，僅切除少量腹腔內(nèi)脂肪后關(guān)腹。手術(shù)后2周大鼠開(kāi)始灌胃給藥，持續(xù)8周，其中陽(yáng)性對(duì)照組按每天灌服0.09 mg/kg戊酸雌二醇，低、中、高劑量骨龍膠囊組分別每天灌服0.54、0.81、1.08 g/kg骨龍膠囊[骨龍膠囊用于人的最低臨床用量為每天6 g，按照人與大鼠的體表面積換算法(6 g×0.018×5=0.54 g/kg)作為低劑量，取低劑量的2倍作為高劑量，高、低劑量的中間值作為中劑量]，假手術(shù)組、OVX組每天灌服等體積生理鹽水，灌胃滿8周后禁食12 h，稱定質(zhì)量，處死全部大鼠，取心臟動(dòng)脈血，并留取右側(cè)完整股骨標(biāo)本，4%多聚甲醛固定。

1.3 血清Ca、P、BGP、ALP水平檢測(cè) 大鼠心臟取動(dòng)脈血5 mL，置于含有肝素的抗凝管中，4 ℃、2 000 r/min 離心10 min，取上清液，放置在-80 ℃冰箱中備用，檢測(cè)血清Ca、P、BGP、ALP水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 MicroCT檢測(cè) 使用Scanco vivaCT 40掃描及分析所有大鼠右側(cè)股骨標(biāo)本，具體方法同文獻(xiàn)[8]，在70 kV、113 mA下使用10.5 μm層厚連續(xù)掃描股骨全長(zhǎng)。在區(qū)分骨質(zhì)和軟組織時(shí)，骨小梁和骨皮質(zhì)的閾值分別設(shè)定為180、220。骨小梁的感興趣區(qū)域(ROI)選取從股骨遠(yuǎn)端生長(zhǎng)板最低點(diǎn)以上10個(gè)層面開(kāi)始，向上連續(xù)選擇10個(gè)層面(105 μm)的范圍，骨皮質(zhì)的感興趣區(qū)域(ROI)選取從股骨干中點(diǎn)向下50個(gè)層面(525 μm)的范圍，前者測(cè)量參數(shù)包括骨小梁相對(duì)體積(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(TB.N)、骨小梁厚度(TB.Th)、骨小梁分離指數(shù)(TB.Sp)，后者測(cè)量參數(shù)包括骨皮質(zhì)厚度(Ct. Th)、骨皮質(zhì)相對(duì)面積(Ct.Ar/Tt.Ar)。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量 48只大鼠術(shù)后切口均在1周后愈合，實(shí)驗(yàn)期間無(wú)死亡。與假手術(shù)組比較，OVX組和低、中、高劑量骨龍膠囊組大鼠體質(zhì)量均升高(P<0.05)；與OVX組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)，低、中、高劑量骨龍膠囊組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較

2.2 骨龍膠囊對(duì)卵巢切除大鼠血清中Ca、P、ALP及BGP水平的影響 與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠血清Ca、P增加(P<0.05)、ALP、BGP減少(P<0.05)；與OVX組比較，低、中、高劑量骨龍膠囊組大鼠血清Ca、P減少(P<0.05)、ALP、BGP增加(P<0.05)，但低、中、高劑量組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中Ca、P、ALP、BGP水平

2.3 骨龍膠囊對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁骨量的影響 與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠骨小梁骨量降低(P<0.05)；與OVX組比較，低、中、高劑量骨龍膠囊組骨小梁骨量升高(P<0.05)，但低、中、高劑量骨龍膠囊組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

注：A為假手術(shù)組，B為OVX組，C為陽(yáng)性對(duì)照組，D為低劑量骨龍膠囊組，E為中劑量骨龍膠囊組，F(xiàn)為高劑量骨龍膠囊組，G為BV/TV(骨小梁相對(duì)體積)，H為T(mén)b.Th(骨小梁厚度)，I為T(mén)h.N(骨小梁數(shù)目)，J為T(mén)b.Sp(骨小梁分離指數(shù))。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05。

2.4 骨龍膠囊對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨皮質(zhì)骨量的影響 與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠骨皮質(zhì)骨量降低(P<0.05)；與OVX組比較，低、中、高劑量骨龍膠囊組大鼠之間骨皮質(zhì)骨量無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

注：A為假手術(shù)組，B為OVX組，C為陽(yáng)性對(duì)照組，D為低劑量骨龍膠囊組，E為中劑量骨龍膠囊組，F(xiàn)為高劑量骨龍膠囊組，G為Ct.Th(骨皮質(zhì)厚度)，H為Ct.Ar/Tt.Ar(骨皮質(zhì)相對(duì)面積)。與假手術(shù)組比較，*P<0.05。

3 討論

近年來(lái)許多研究者從分子生物學(xué)水平研究中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥并取得了顯著的進(jìn)展，大量的基礎(chǔ)及臨床研究證實(shí)中醫(yī)藥在治療骨質(zhì)疏松方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[9]。骨龍膠囊主用于骨與關(guān)節(jié)風(fēng)寒痹阻、肝腎不足者，有散寒鎮(zhèn)痛、活血祛風(fēng)及強(qiáng)筋壯骨作用。唐曉頗等[10]研究發(fā)現(xiàn)骨龍膠囊在改善膝骨性關(guān)節(jié)炎的疼痛及功能評(píng)分方面療效優(yōu)于維固力膠囊，是一種治療膝骨關(guān)節(jié)炎有效、安全的治療藥物。賈玉民等[11]研究發(fā)現(xiàn)骨龍膠囊能有效抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β和TNF-α炎性細(xì)胞因子的活性，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有良好的治療作用。劉海等[12]研究發(fā)現(xiàn)骨龍膠囊聯(lián)合甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎并發(fā)骨質(zhì)疏松能夠有效促進(jìn)骨形成及抑制骨吸收，增加骨密度，療效顯著優(yōu)于單純西藥治療。本研究發(fā)現(xiàn)骨龍膠囊可以降低骨質(zhì)疏松大鼠血清中Ca和P的水平、增加血清中ALP和BGP的水平、增加股骨骨小梁的骨量，說(shuō)明骨龍膠囊有良好的抗骨質(zhì)疏松作用，這為進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

骨骼的完整性由不斷重復(fù)、時(shí)空偶聯(lián)的骨吸收和骨形成過(guò)程維持，此過(guò)程稱為“骨重建”。骨吸收過(guò)程與破骨細(xì)胞聯(lián)系緊密，若破骨細(xì)胞骨吸收增強(qiáng)，可引起骨中Ca、P的流失，表現(xiàn)為骨量減少，血清Ca、P水平的升高[4]。而骨形成過(guò)程與成骨細(xì)胞的功能狀態(tài)較密切， BGP和ALP是常用的成骨細(xì)胞功能檢測(cè)指標(biāo)。BGP是由成骨細(xì)胞分泌的一種特異性非膠原骨基質(zhì)蛋白，ALP是成骨細(xì)胞的一種胞外酶，主要為骨的鈣化提供磷酸，骨型占50%[7-13]。本研究結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠血清Ca和P增加，血清BGP、ALP及股骨骨小梁骨量明顯減少，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠造模成功。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)與OVX組比較，低、中、高劑量骨龍膠囊組血清Ca和P減少、血清ALP、BGP及股骨骨小梁骨量增加，這說(shuō)明骨龍膠囊可以有效地促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠的骨形成、減少破骨細(xì)胞引起的骨吸收。但同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)立的3個(gè)不同劑量骨龍膠囊組間的骨代謝指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明骨龍膠囊治療骨質(zhì)疏松不存在劑量依賴性。

此外，本實(shí)驗(yàn)中，低、中、高劑量骨龍膠囊組雖能使骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝和骨量得到一定恢復(fù)和改善，但與假手術(shù)組比較仍有差異。本研究還發(fā)現(xiàn)OVX組與低、中、高劑量骨龍膠囊組間的股骨骨皮質(zhì)參數(shù)沒(méi)有明顯差異，以上結(jié)果表明單獨(dú)使用骨龍膠囊不足以治療卵巢切除引起骨質(zhì)疏松癥。研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥如同其他慢性疾病一樣，不僅要長(zhǎng)期、個(gè)體化治療，也需藥物聯(lián)合或序貫治療[14]。因此，不建議單獨(dú)使用骨龍膠囊治療PMOP，而是聯(lián)合鈣劑、維生素D及其他骨吸收抑制劑或骨形成促進(jìn)劑聯(lián)合使用[2, 15-16]。

本研究仍有一些局限性：首先，本研究中實(shí)驗(yàn)對(duì)象是大鼠，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)論可能并不完全適用于人類。在確定藥物安全的基礎(chǔ)上，下一步還需要進(jìn)行多中心、隨機(jī)、對(duì)照、前瞻性臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)確定骨龍膠囊對(duì)人類骨質(zhì)疏松的治療效果。其次，骨龍膠囊作為一種復(fù)方中藥制劑，單味藥可能僅作用于機(jī)體某些環(huán)節(jié)而中藥復(fù)方對(duì)機(jī)體具有全身性調(diào)節(jié)、作用于多環(huán)節(jié)和多通路，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。