益心泰對心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響

孫 濤， 郭志華， 李 雅， 龍 云， 曾 英， 王 月

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208)

心力衰竭(heart failure，HF)是一類以體循環(huán)灌注不足、肺循環(huán)瘀血為主要表現的臨床綜合征，根據心臟彩超結果，臨床上分為射血分數保留的心力衰竭和射血分數減低的心力衰竭[1]，但無論是哪一種都會引起心輸出量下降，當心率相當時，即表現為每搏量下降。細胞水平研究顯示，心力衰竭發(fā)生發(fā)展的每個階段中，都與心肌細胞凋亡有著明確相關性[2]?，F階段已證實β-抑制蛋白(β-arrestin)介導的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路的激活可以抑制心肌細胞凋亡[3]，B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)及其相關蛋白(Bcl-2-associated-X-protein，Bax)的蛋白表達是細胞凋亡中至關重要的一環(huán)[4]，報道指出Bcl-2/Bax可以被磷酸化的Akt激活表達[5]。基于以上研究，本課題組提出合理假設，β-arrestin通過募集激活Akt進而調控下游Bcl-2/Bax蛋白表達，最終激活心肌保護機制，從而抑制心肌細胞凋亡。中藥復方益心泰在臨床治療心力衰已有20年之久，安全性良好，而且療效已得到充分肯定[6-9]，課題組前期證明，該方能通過抑制G蛋白偶聯受體，延緩心力衰竭[10]，但是否能調控β-arrestin-Akt-Bcl-2/Bax信號通路尚不清楚。本研究擬通過觀察益心泰對心衰大鼠心肌細胞凋亡情況及β-arrestin-Akt-Bcl-2/Bax信號通路相關蛋白表達的影響，揭示與闡釋益心泰治療心力衰竭的多維作用機制，為今后研究提供充分的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠60只，雄性，體質量200～230 g，由湖南省人民醫(yī)院動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(湘)2016-0002，動物飼養(yǎng)及實驗方案遵循國家《實驗動物管理條例》和湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物福利與倫理委員會規(guī)范。

1.2 藥物、試劑與儀器 益心泰由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中成藥制劑中心提供(批號20180727)，組方藥材黃芪15 g、丹參15 g、紅花10 g、豬苓10 g、澤瀉10 g、葶藶子6 g，每1 g成藥含生藥3.3 g?？ňS地洛(金絡)10 mg/片(山東齊魯制藥有限公司，國藥準字H20000100)。TUNEL檢測試劑(上海羅氏制藥有限公司，批號11684817910)；β-arrestin(批號K001487M)、p-Akt(貨號4060P)、β-actin(貨號3869)、Bcl-2(貨號3869)和、Bax(貨號14796)均購自湖南秉玉堂生物科技有限公司。Vivid 7.0 彩色超聲儀(美國GE公司)；電子顯微鏡(日本Olympus公司)；UV-365型紫外分光光度計(日本島津公司)。

1.3 造模與分組 將60只大鼠隨機分為正常對照組10只、造模組50只，參照文獻[11]報道采用腹腔注射鹽酸阿霉素法造模，第1、3、9、11天劑量為1.0 mg/kg，第5、7、13、15天劑量為2.0 mg/kg，累積12 mg/kg，觀察大鼠表征及行為學改變，第16天清晨進行心臟超聲檢測，指標包括左室射血分數(LVEF)，以指標低于標準值40%為心力衰竭模型成功。稱定大鼠體質量，對大鼠一般狀態(tài)進行監(jiān)測和評估，若出現體質量減輕、活動量減少、精神不振、毛色黯淡無光，則將其入選為觀察對象，從中隨機選取30只，再隨機分為益心泰組(4.2 g/kg)、卡維地洛組(10 mg/kg)、模型組(等量生理鹽水)，每組按照1次/d的頻率給藥，8周后觀察一般情況，對其心臟功能指標、心肌細胞凋亡情況、β-arrestin-Akt-Bcl-2/Bax通路蛋白表達進行檢測。

1.4 指標檢測

1.4.1 心臟功能指標 取大鼠胸骨旁左室長軸切面，Vivid 7.0 彩色超聲儀檢測左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic dimension，LVEDD)、左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。分別取心尖兩腔心切面和心尖五腔心切面，M超檢測每搏量(stroke volume，SV)，連續(xù)3個心動周期數值，再取各組平均值。

1.4.2 心肌細胞染色、凋亡情況 從福爾馬林固定液中取出大鼠心臟，沖洗干凈后取部分心肌組織，經脫水、包埋、切片(厚度4 μm)、脫蠟后0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)沖洗2次，在37 ℃下20 μg/mL蛋白酶K消化20 min，0.1 mol/L PBS沖洗2次，在4 ℃下孵育4 min，3%H2O2孵育10 min，0.1 mol/L PBS沖洗2次，新鮮配制TUNEL反應液37 ℃下孵育70 min，0.1 mol/L PBS沖洗2次，每次5 min，自來水沖洗5 min，蘇木素復染3 min，乙醇浸泡1～2 s，自來水沖洗5 min，晾干后中性樹脂封片，顯色結果發(fā)現凋亡心肌細胞呈現深棕黃色。心肌細胞凋亡指數(AI)檢測方法為在光鏡(×400)下計算細胞凋亡指數，公式為細胞凋亡指數=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%，每組大鼠5張片，每張片均取5個高倍視野計數凋亡細胞數，計算平均值。

1.4.3 相關蛋白表達 取米粒大小的大鼠心室組織，經研磨、裂解、濃度檢測后SDS-PAGE分離，再采用電移法將蛋白質轉至PVDF膜，麗春紅S染色，含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，加入p-Akt、Bax、Bcl-2、β-arrestin、β-actin抗體，在4 ℃下孵育過夜，室溫下TBST洗膜后加入二抗孵育2 h，TBST洗膜后與ECL試劑反應，膠片曝光、掃描，并用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件對結果進行分析。

2 結果

2.1 心臟功能指標變化情況 如表1所示，與正常對照組比較，模型組大鼠左心室舒張末期內徑增加(P<0.01)，左室射血分數、左室短軸縮短率降低(P<0.01)，每搏量下降(P<0.01)，提示心力衰竭發(fā)生時心臟功能受損嚴重；與模型組比較，益心泰組、卡維地洛組大鼠左室舒張末期內徑減小(P<0.05)，左室射血分數、左室短軸縮短率升高(P<0.05)，每搏量增加(P<0.05)；與卡維地洛組比較，益心泰組大鼠各指標無明顯變化(P>0.05)。

表1 各組大鼠心臟功能指標

2.2 心肌細胞凋亡染色情況及凋亡指數變化情況 如表2所示，與正常對照組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡指數增加(P<0.01)，提示存在心肌細胞凋亡；與模型組比較，益心泰組、卡維地洛組大鼠心肌細胞凋亡指數降低(P<0.05)；與卡維地洛組比較，益心泰組大鼠凋亡指數無明顯變化(P>0.05)。心肌細胞凋亡染色見圖1。

表2 各組大鼠心肌細胞凋亡指數

注：1為正常對照組，2為模型組，3為益心泰組，4為卡維地洛組。

2.3 β-arrestin、p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白表達 如圖2所示，與正常對照組比較，模型組大鼠β-arrestin、p-Akt、Bcl-2蛋白表達下降(P<0.01)，Bax蛋白表達增加(P<0.01)；與模型組比較，益心泰組、卡維地洛組大鼠β-arrestin、p-Akt、Bcl-2蛋白表達增加(P<0.05)，Bax蛋白表達減少(P<0.05)；與卡維地洛組比較，益心泰組大鼠各指標無明顯變化(P>0.05)。

注：1為模型組，2為正常對照組，3為益心泰組，4為卡維地洛組。與正常對照組比較，▲P<0.01；與模型組比較，△P<0.05； 與卡維地洛組比較，◆P<0.05。

3 討論

益心泰是湖南中醫(yī)藥大學郭志華教授多年臨床經驗總結而成的中藥復方，由黃芪、紅花、豬苓、澤瀉、葶藶子等藥物組成，該復方主要針對的病機是氣虛血瘀水停。方中黃芪用量最重，為君藥，是補虛之品，常用于體衰日久、言語低弱、脈細無力者；紅花為臣藥，活血通經、祛瘀止痛，入心經，《金匱要略》中記載，紅藍花酒方具活血行瘀，利氣止痛之功，可見紅花為活血之要藥；豬苓味甘、淡、平，歸心、脾、胃、肺、腎經，為佐藥，有利水滲濕消腫之效。配合諸藥，共奏益氣活血利水之效。

本研究采用鹽酸阿霉素腹腔注射制備心力衰竭大鼠模型，這更接近于一種擴張型心肌病模型[12]，其主要表現為心室容量型擴張和收縮功能下降。擴張型心肌病發(fā)病率高，2002年抽樣調查顯示其發(fā)病率為19/10萬人，且呈逐年上升趨勢。擴張型心肌病是誘發(fā)心力衰竭的主要原發(fā)疾病，但因其病因尚未明確，暫時沒有特效藥物，致使擴張性心肌病的死亡率居高不下，成為威脅生命健康的大敵[13]。尋找臨床療效確切，作用機制明確的新藥迫在眉睫。本研究結果已經證明益心泰對心力衰竭大鼠心臟功能有明確改善作用，不僅使左心室舒張末期內徑減小，同時還提高了射血分數和每搏量。

心肌細胞凋亡是心力衰竭的重要病理基礎及發(fā)病機制之一，這已經成為現階段的共識。細胞凋亡在機體內無時無刻不在進行，它是一系列極其復雜變化的集合，為維持內環(huán)境的穩(wěn)定，在相關基因的調控作用下，部分細胞發(fā)生皺縮，染色質開始聚集，直至細胞分解、吞噬，且此過程具有主動性[14-15]。心肌細胞凋亡現象存在于大多數心血管疾病中，在疾病進展的各個環(huán)節(jié)中都扮演者極其重要的角色。與大多數組織細胞不同，心肌細胞是不具有再生能力的終末分化細胞，隨著心肌細胞凋亡的發(fā)生，存活的心肌細胞的數量也不斷減少，這個過程中，心力衰竭其實已經在發(fā)展之中，雖然大部分患者在此時沒有癥狀，而當由代償期進入失代償期時，我們所熟知的終末期心臟疾病——心力衰竭就進入了臨床癥狀期。本研究表明模型組大鼠凋亡細胞占總心肌細胞比例高于正常對照組，而益心泰干預后，凋亡細胞比例降低，證明益心泰改善心臟功能與其有效抑制細胞凋亡有關。

細胞凋亡過程有諸多凋亡激活、抑制因子參與其中，Bcl-2蛋白家族中就有許多這類功能的蛋白成員，如Bcl-2 抗凋亡因子和Bax促凋亡因子[16]。研究報道，p-Akt為Bcl-2/Bax蛋白的上游調控因子，Bcl-2/Bax可以被磷酸化的Akt調控表達[5]。亦有研究證明β-arrestin介導的Akt信號通路的激活可以抑制心肌細胞凋亡[3]。在此基礎上，本課題組提出合理假設，β-arrestin通過募集激活Akt進而調控下游Bcl-2/Bax蛋白表達，從而抑制心肌細胞凋亡，保護心臟。本研究表明模型組大鼠心肌組織中β-arrestin、p-Akt及Bcl-2蛋白表達減少，Bax蛋白表達增加，益心泰干預后，β-arrestin、p-Akt及Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達下降，證實益心泰對β-arrestin-Akt-Bcl-2/Bax信號通路可能存在整體調控作用，進一步證實了益心泰對心肌細胞凋亡的抑制作用。

綜上所述，本研究已證明益心泰能有效改善心臟功能，在一定程度上抑制心肌細胞凋亡，其機制可能是通過調控β-arrestin-Akt-Bcl-2/Bax信號通路而實現的，但益心泰的抗心肌細胞凋亡作用是否僅通過調控β-arrestin-Akt-Bcl-2/Bax信號通路實現，仍不十分清楚。后續(xù)課題組將采用基因敲除方法，并結合細胞實驗進一步驗證益心泰抑制心肌細胞凋亡的機制。