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    老鴉糊乙酸乙酯部位化學(xué)成分及其抗炎活性

    2021-10-26 12:06:20吳中含易僑祺張?zhí)依?/span>王紅剛
    中成藥 2021年10期
    關(guān)鍵詞:老鴉二氯甲烷乙酸乙酯

    徐 凡, 吳中含, 易僑祺, 張?zhí)依颍?趙 璐, 王紅剛

    (廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東 廣州 510000)

    老鴉糊CallicarpagiraldiiHesse ex Rehd.,又名紫珠、小米團(tuán)花、魚膽等,為馬鞭草科紫珠屬的一種小灌木,多生長于海拔200~3 400 m的疏林和灌木叢中,在陜西、甘肅(南部)以及南方大部分地區(qū)都有較為廣泛的分布,是我國所特有的一種紫珠屬植物[1],老鴉糊資源豐富,應(yīng)用歷史悠久,常用于跌打損傷及各種炎癥和出血證的治療,療效顯著,多部地方典籍亦有收錄闡述?!陡=耖g草藥》言其味苦、性辛溫,功能驅(qū)風(fēng)除濕、殺蟲解毒、散結(jié)化瘀,治療跌打損傷、關(guān)節(jié)炎、凍瘡、蛇傷、皮下出血等效果甚佳?!墩憬耖g常用草藥》記載其性涼、味澀,功能收斂止血、祛風(fēng)除濕,常用于治療內(nèi)外傷出血、尿血等各種出血癥。《貴州民間草藥》有老鴉糊性微寒、味辛,功能祛風(fēng)除濕、散瘀解毒的記載,常用于治療小米丹(褲帶瘡)、血崩等癥。楊勇等[2]對老鴉糊進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)研究,初步發(fā)現(xiàn)老鴉糊根、莖、葉的化學(xué)成分基本相同,可能含有有機(jī)酸、糖類、酚類、鞣質(zhì)等化學(xué)成分。蔣惠娣等[3]在對包括老鴉糊在內(nèi)的6種紫珠屬植物做大鼠臟器體外孵育時(shí)自動(dòng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化的抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)老鴉糊幾乎無抑制作用,表明老鴉糊在此實(shí)驗(yàn)條件下不具備體外抗氧化作用。本課題組前期從老鴉糊中分離得到21個(gè)化合物[4],均為首次從該植物中分離得到,其中生物堿及酰胺類化合物為首次從紫珠屬植物中分離得到。

    當(dāng)前有關(guān)老鴉糊的研究主要集中在生藥學(xué)方面,整體仍處于一個(gè)較為初級和淺顯的階段,在研究廣度和深度方面都存在明顯不足。本課題對老鴉糊甲醇提取物的乙酸乙酯部位進(jìn)行化學(xué)成分研究并對部分單體化合物進(jìn)行抗炎活性篩選,以期對明晰老鴉糊化學(xué)成分組成和相關(guān)藥效物質(zhì)基礎(chǔ),以及進(jìn)一步開發(fā)老鴉糊藥用資源提供參考。

    1 材料

    AVANCEIII 500 MHz核磁共振儀(瑞士布魯克拜厄斯賓公司);半制備高效液相色譜儀(北京賽譜銳思科技有限公司);maXis impact質(zhì)譜儀(德國Bruker公司);二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、低溫離心機(jī)、高壓滅菌鍋(廣州飛迪生物有限公司);-80 ℃冰箱(中美科菱低溫科技股份有限公司);超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)搖床(天津市歐諾儀器儀表有限公司);分析天平(十萬分之一,上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)。硅膠(100~200、200~300目,青島海洋化工有限公司);MCI(三菱化學(xué)公司);ODS(日本YMC公司);Sephadex LH-20(北京賽譜銳思科技有限公司)。石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠);硫酸(廣州化學(xué)試劑廠);無水乙醇、氯仿(分析純;天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,瑞典歐普森試劑公司);蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司);磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(美國HyClone公司);二甲基亞砜(德國Biofroxx公司);磺胺、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);布洛芬、脂多糖(LPS)(美國Sigma公司);濃磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);亞硝酸鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

    老鴉糊(28 kg)采自云南省臨滄市永德縣亞練鄉(xiāng),經(jīng)中國科學(xué)院華南植物園葉華谷教授鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物老鴉糊CallicarpagiraldiiHesse ex Rehd.的枝葉,憑證標(biāo)本存放于廣東藥科大學(xué)中藥標(biāo)本館。

    2 提取與分離

    28 kg老鴉糊陰干后粉碎為粗粉,甲醇冷浸提取5次(前2次48 h,后3次72 h),每次30 L,合并提取液,減壓回收溶劑得到浸膏840 g。浸膏加水(約1∶1)分散均勻,用乙酸乙酯(5×1.2 L)萃取,合并萃取液并減壓濃縮,得到乙酸乙酯部位浸膏102 g。

    以適量甲醇溶解乙酸乙酯部位(102 g),加入等量硅膠攪拌均勻,揮干溶劑后干法上樣。以硅膠為固定相,以二氯甲烷-甲醇(100∶1、100∶2、100∶3、100∶5、100∶7、100∶9、9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1)梯度洗脫,經(jīng)薄層色譜檢測合并相同餾分得到E1~E12共12個(gè)組分。E3組分以凝膠為固定相,以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫,經(jīng)薄層色譜合并相同餾分得到10個(gè)組分,后經(jīng)硅膠柱、凝膠柱、ODS柱、MCI柱及半制備HPLC分離純化后得化合物1(11.3 mg)、2(5.4 mg)、3(6.1 mg)、4(9.3 mg)、5(9.6 mg);E5組分先后經(jīng)硅膠柱、凝膠柱、MCI柱洗脫分離得化合物6(6.3 mg)、7(7.5 mg);E8組分經(jīng)凝膠柱以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫后,經(jīng)半制備HPLC純化得化合物8(10.4 mg);E9組分經(jīng)凝膠柱以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫后,經(jīng)半制備HPLC純化得化合物9(13.5 mg)、10(7.1 mg);E11組分經(jīng)凝膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫后經(jīng)薄、層色譜合并相同餾分得到5個(gè)組分,后經(jīng)硅膠柱、凝膠柱、MCI柱及半制備HPLC分離純化后得化合物11(8.9 mg)、12(6.3 mg);E12組分經(jīng)凝膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫后重結(jié)晶得化合物13(9.6 mg)。

    3 結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物1:白色針狀結(jié)晶,C30H49O,ESI-MSm/z:425.9[M+H]+。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ:4.69(1H,s,H-29a),4.57(1H,s,H-29b),1.68(3H,s,H-30),1.07(6H,s,H-24,26),1.02(3H,s,H-23),0.95(3H,s,H-27),0.93(3H,s,H-25),0.79(3H,s,H-28);13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ:218.3(C-3),151.0(C-20),109.5(C-29),55.1(C-5),49.9(C-9),48.4(C-18),48.1(C-19),47.5(C-4),43.1(C-14),43.1(C-17),40.9(C-8),40.1(C-22),39.8(C-2),38.3(C-13),37.0(C-10),35.7(C-16),34.3(C-1),33.7(C-7),30.0(C-21),27.6(C-15),26.8(C-23),25.3(C-12),21.6(C-11),21.2(C-24),19.8(C-6),19.5(C-30),18.2(C-28),16.1(C-25),15.9(C-26),14.6(C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]基本一致,故鑒定為羽扇豆酮。

    化合物2:白色無定形粉末,C30H48O4,ESI-MSm/z:471.8[M+H]+。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:5.17(1H,s,H-12),3.34(1H,s,H-3),2.74(1H,d,J=1.9 Hz,H-18),1.09(3H,s,H-27),0.92(6H,s,H-23,24),0.88(6H,s,H-25,26),0.70(3H,s,H-29,30);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:178.6(C-28),143.9(C-13),121.4(C-12),82.2(C-3),67.1(C-2),54.7(C-5),47.1(C-9),46.8(C-1),45.7(C-19),45.4(C-17),41.7(C-14),41.3(C-18),40.1(C-8),38.9(C-4),37.6(C-10),33.3(C-21),32.8(C-7),32.3(C-29),32.1(C-22),30.4(C-23),29.8(C-20),27.1(C-15),25.6(C-27),23.4(C-16),23.3(C-30),22.4(C-11),18.0(C-6),17.1(C-24),16.9(C-26),16.3(C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致,故鑒定為2α-羥基齊墩果酸。

    化合物3:白色無定形粉末,C30H48O4,ESI-MSm/z:471.8[M+H]+。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:12.00(1H,s,-COOH),5.14(1H,s,H-12),4.02(1H,d,J=4.2 Hz,H-2),3.90(1H,d,J=6.5 Hz,H-3),3.42(1H,s,H-2),2.74(1H,dd,J=12.6,1.9 Hz,H-3),2.11(1H,d,J=10.1 Hz,H-18),1.04(3H,s,H-24),0.90(3H,s,H-26),0.82(3H,s,H-29),0.74(3H,s,H-25),0.71(3H,s,H-30);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:178.3(C-28),138.2(C-13),124.5(C-12),82.2(C-3),67.1(C-2),54.7(C-5),52.4(C-18),47.1(C-9),47.0(C-1),46.8(C-17),41.1(C-14),40.8(C-8),38.9(C-4),38.5(C-19),38.4(C-20),37.6(C-10),36.3(C-22),32.6(C-7),31.3(C-21),29.0(C-23),27.5(C-15),23.8(C-16),22.9(C-11),22.9(C-27),22.1(C-30),18.0(C-6),17.2(C-24),17.0(C-26),16.9(C-29),16.4(C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]基本一致,故鑒定為2α-羥基烏蘇酸。

    化合物4:白色粉末狀固體,C30H50O,ESI-MSm/z:426.3[M+H]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.26(1H,t,J=3.7 Hz,H-12),3.16(1H,dd,J=11.4,4.8 Hz,H-3),1.18(3H,s,H-23),0.99(3H,s,H-24),0.96(3H,s,H-25,26,27),0.92(3H,s,H-28),0.84(3H,s,H-29),0.79(3H,s,H-30);13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:145.3(C-13),123.8(C-12),79.7(C-3),56.8(C-5),47.7(C-9),47.3(C-19),47.3(C-17),42.9(C-14),42.8(C-18),40.6(C-8),39.8(C-1),39.8(C-4),38.2(C-10),34.9(C-21),34.0(C-29),33.9(C-7),33.6(C-22),31.6(C-20),31.6(C-28),28.9(C-23),28.7(C-15),27.9(C-2),26.4(C-27),24.5(C-30),24.1(C-16),24.0(C-11),19.5(C-6),16.3(C-24),15.9(C-25),17.8(C-26)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致,故鑒定為3β-hydroxy-olean-12-en。

    化合物5:無色固體,C24H38O4,ESI-MSm/z:391.8[M+H]+。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.74(2H,dd,J=5.8,3.4 Hz, H-3, 6),7.55(2H,dd,J=5.8,3.3 Hz,H-4,5),4.34(4H,m,H-1′,1″),1.74(2H,m,H-2′,2″),1.47(16H,m,8×CH2),0.99(6H,m,H-b′,b″),0.90(6H,t,J=7.2 Hz,H-7′,7″);13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ:167.9(C=O),132.5(C-1,2),131.1(C-3,6),129.0(C-4,5),65.7(C-1′,1″),32.1(C-2′,2″),30.7(C-3′,3″), 29.9(C-4′,4″),29.5(C-5′,5″),22.9(C-6′,6″),19.3(C-a′,a″),14.3(C-7′,7″),13.9(C-b′,b″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致,故鑒定為鄰苯二甲酸二-(2-乙基)己酯。

    化合物6:白色粉末狀結(jié)晶,C30H48O3,ESI-MSm/z:455.4[M-H]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.22(1H,t,J=7.4 Hz,H-12),3.13(1H,dd,J=11.1,3.7 Hz,H-3),2.84(1H,dd,J=14.3,4.6 Hz,H-18),1.15、0.95、0.94、0.93、0.83、0.80、0.76(each 3H×7,s,H-23,24,25,26,27,29,30);13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:181.9(C-28),145.2(C-13),123.6(C-12),79.7(C-3),56.8(C-5),49.1(C-9),47.7(C-17),47.3(C-19),42.9(C-14),42.8(C-18),40.6(C-8),40.4(C-4),40.0(C-1),38.2(C-10),34.9(C-21),34.0(C-7),33.8(C-22),33.6(C-29),31.6(C-20),28.9(C-15),28.8(C-23),27.9(C-2),26.4(C-27),24.5(C-16),24.1(C-11),24.0(C-30),19.5(C-6),17.7(C-26),16.3(C-24),16.0(C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致,故鑒定為齊墩果酸。

    化合物7:白色針狀或粉末狀固體,C10H10O3,ESI-MSm/z:178.3[M+H]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.60(1H,d,J=16.0 Hz,H-3),7.52(2H,d,J=8.7 Hz,H-2′,6′),6.93(2H,d,J=8.8 Hz,H-3′,5′),6.30(1H,d,J=15.9 Hz,H-2),3.81(3H,m,-OCH3);13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:146.3(C-4′),146.3(C-3),130.9(C-2′,6′),128.4(C-1′),116.6(C-2),115.4(C-3′, 5′),55.9(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致,故鑒定為4′ -methoxy cinnamic acid。

    化合物8:黃色油狀液體,C20H26O4,ESI-MSm/z:331.9[M-H]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:8.07(1H,d,J=2.2 Hz,H-14),7.73(1H,dd,J=8.3,2.3 Hz,H-12),7.43(1H,d,J=8.4 Hz,H-11),2.80(1H,dd,J=17.7,14.2 Hz,H-6a),2.65(1H,dd,J=14.2,3.2 Hz,H-5),2.37(1H,dd,J=17.7,3.2 Hz,H-6b),1.92~1.72(4H,m,H-1,2),1.58(2H,m,H-3),1.52(6H,d,J=0.9 Hz,H-16,17),1.34(3H,s,H-19),1.28(3H,s,H-20);13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:200.8(C-7),181.2(C-18),155.6(C-9),149.3(C-13),132.3(C-12),131.3(C-8),124.9(C-11),124.1(C-14),72.6(C-15),47.5(C-4),45.5(C-3),38.9(C-6),38.6(C-10),38.5(C-1),37.9(C-5),31.7(C-16),31.7(C-17),23.8(C-20),19.2(C-2),16.8(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致,故鑒定為7-oxo-15-hydroxydehydroabietic acid。

    化合物9:淡黃棕色油狀物,C16H22O4,ESI-MSm/z:279.7[M+H]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.74(2H,dd,J=5.7,3.3 Hz,H-2,5),7.63(2H,dd,J=5.7,3.3 Hz,H-3,4),4.08(4H,d,J=6.6 Hz,H-1′,1″),2.04(2H,m,H-2′,2″),1.01(12H,d,J=6.7 Hz,H-3′,3″,4′,4″);13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:169.3(C-7,8),133.6(C-1,6),132.4(C-3,4),129.9(C-2,5),72.9(C-1′,1″),29.0(C-2′,2″),19.5(C-3′,3″,4′,4″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致,故鑒定為鄰苯二甲酸異二丁酯。

    化合物10:黃色油狀物,C19H36O2,ESI-MSm/z:295.9[M+H]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.35(2H,t,J=4.9 Hz,H-9,10),3.65(3H,s,H-1′),2.31(2H,t,J=7.5 Hz,H-2),2.04(4H,m,H-8,11),1.33(20H,m),0.90(3H,t,J=7.0 Hz,H-18);13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:176.0(C-1),130.8(C-9),130.8(C-10),51.9(C-1′),34.8(C-2),33.1(C-16),30.8(C-7),30.8(C-15),30.7(C-6),30.7(C-14),30.6(C-13),30.5(C-5),30.4(C-12),30.2(C-4),28.1(C-8),28.1(C-11),26.0(C-3),23.7(C-17),14.4(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致,故鑒定為(Z)-9-十八碳烯酸甲酯。

    化合物11:白色粉末狀固體,C30H47O6,ESI-MSm/z:503.3[M-H]-。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.32(1H,t,J=3.7 Hz,H-12),3.69(1H,ddd,J=11.1,9.5,4.4 Hz,H-2),3.50(1H,d,J=11.1 Hz,H-23a),3.36(1H,d,J=9.5 Hz,H-3),3.27(1H,d,J=11.1 Hz,H-23b),3.25(1H,d,J=4.7 Hz,H-19),3.06(1H,s,H-18),1.31(3H,s,H-27),1.02(3H,s,H-25),0.96(3H,s,H-30),0.94(3H,s,H-29),0.77(3H,s,H-26),0.70(3H,s,H-24);13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:182.5(C-28),144.8(C-13),124.7(C-12),82.5(C-19),78.3(C-3),69.7(C-2),66.5(C-23),49.1(C-9),48.4(C-5),47.7(C-1),46.7(C-17),45.2(C-18),44.1(C-4),42.7(C-14),40.7(C-8),39.2(C-10),36.0(C-20),34.0(C-7),33.4(C-22),29.5(C-15),29.4(C-21),28.7(C-29),28.6(C-16),25.2(C-27),25.1(C-30),24.9(C-11),19.3(C-6),17.8(C-26),17.4(C-25),13.8(C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致,故鑒定為2α, 3β, 19α, 23-四羥基-齊墩果酸。

    化合物12:白色針狀結(jié)晶或無定型粉末,C6H5NO2,ESI-MSm/z:123.0[M+H]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:9.03(1H,s,H-6),8.70(1H,d,J=4.9 Hz,H-2),8.30(1H,ddd,J=8.0,2.2,1.6 Hz,H-4),7.56(1H,ddd,J=7.9,4.9,0.8 Hz,H-3);13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:169.8(-C=O),152.9(C-2),149.5(C-6),137.3(C-4),131.5(C-5),125.1(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致,故鑒定為煙酸。

    化合物13:白色方晶,C20H30O3,ESI-MSm/z:317.9[M-H]-。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.88(1H,dd,J=17.6,10.9 Hz,H-15),5.68(1H,dd,J=4.7,2.1 Hz,H-7),5.14(1H,dd,J=10.9,1.2 Hz,H-16a),5.10(1H,dd,J=17.6,1.2 Hz,H-16b),3.68(1H,s,H-14),1.25、0.88、0.87(each 3H,s,-CH3);13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ:184.0(C-18),146.5(C-15),137.1(C-8),127.4(C-7),113.9(C-16),79.5(C-14),47.1(C-9),46.3(C-4),44.6(C-5),41.1(C-13),38.8(C-1),36.9(C-3),34.8(C-10),27.4(C-12),25.3(C-6),22.2(C-17),19.3(C-11),18.1(C-2),17.3(C-19),15.2(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致,故鑒定為calliphyllin。

    4 抗炎活性篩選

    本實(shí)驗(yàn)采用MTT法測定RAW264.7細(xì)胞在不同濃度化合物環(huán)境下的存活率,來判斷對應(yīng)化合物的細(xì)胞毒性作用。采用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7生成NO模型,來評價(jià)化合物6~8的抗炎活性,以地塞米松為陽性藥,將處于對數(shù)生長期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7稀釋并接種于96孔板,每孔100 μL,密度4×104/mL,孔板邊緣加入100 μL PBS,培養(yǎng)24 h,將不做處理的完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白組,僅加入100 ng/mL LPS的細(xì)胞作為模型組,0.5 μmol/mL地塞米松+100 ng/mL LPS作為陽性組,不同濃度化合物+100 ng/mL LPS作為實(shí)驗(yàn)組,加入藥物后培養(yǎng)18 h,取各組細(xì)胞上清液,以Griess法檢測NO釋放量,設(shè)置復(fù)孔5個(gè),重復(fù)3次。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1,化合物6~8對RAW 264.7細(xì)胞NO釋放量的影響見圖2。

    注:與空白組比較,**P<0.01。

    注:與空白組比較,**P<0.01。

    圖1表明,與空白組比較,化合物7、8在給藥濃度小于100 μmol/L時(shí)均不具有顯著的細(xì)胞毒性,化合物6在給藥濃度小于50 μmol/L時(shí)亦然。

    圖2表明,化合物7在設(shè)定給藥濃度下均不具有抗炎活性;化合物6、8分別在25、50 μmol/L,50、100 μmol/L給藥濃度下,均具有一定的抗炎活性。

    5 結(jié)論

    本研究從老鴉糊乙酸乙酯部位分離得到13個(gè)化合物,均為首次從該植物中分離得到,再對化合物6~8進(jìn)行抗炎活性篩選,發(fā)現(xiàn)6、8具有較強(qiáng)的作用。本實(shí)驗(yàn)為了解老鴉糊抗炎活性和明晰老鴉糊抗炎活性的物質(zhì)基礎(chǔ)提供更加有益的支撐,同時(shí)對該藥材資源的合理利用具有十分重要的意義。

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