澤漆水提物對香煙聯(lián)合LPS所致的COPD大鼠的改善作用

王玲玲， 陳蘭英*， 馬惠苗， 謝欣序， 劉榮華

(1.江西中醫(yī)藥大學中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學藥學院，江西 南昌 330004)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以肺功能障礙和持續(xù)的氣流受限為特征的阻塞性肺疾病，通常與肺的慢性炎癥反應升高有關，其癥狀包括咳嗽、痰和呼吸困難。吸煙是COPD的主要觸發(fā)因素[1]，在煙草最為流行的發(fā)展中國家，被診斷為慢性阻塞性肺病的患者預計將持續(xù)增加，這就需要新的疾病治療方法。臨床上治療COPD的藥物主要是糖皮質激素或支氣管擴張劑等，這些藥物主要是通過聯(lián)合作用來控制患者癥狀，且取得的治療效果不佳，因此有必要研發(fā)一種對于治療COPD效果好且無副作用的新藥。

澤漆又名貓兒眼睛草、五朵云、一把傘等，屬大戟科二年生草本植物，《神農本草經》中記載其具有化痰止咳、利水消腫、散結殺蟲等作用。現(xiàn)代藥理研究表明，澤漆具有抑制支氣管腺體中酸性黏多糖合成和使痰量減少的雙重作用，并能促進支氣管黏膜上皮炎癥病理的修復[2]，還具有抗腫瘤、提高機體的免疫功能[3]的作用。有研究報道[4]，澤漆片能用于治療COPD急性加重期患者，因此本實驗旨在探索其水提物對COPD大鼠的治療作用及對相關因子的影響。

1 材料

1.1 藥物 澤漆購自浙江麗水，經江西中醫(yī)藥大學劉榮華教授鑒定為大戟科大戟屬草本植物澤漆EuphorbiahelioscopiaL.的干燥地上部分。醋酸地塞米松片(批號1711055)，購自天津力生制藥股份有限公司。香煙(焦油量11 mg，煙氣一氧化碳量12 mg)，購自江西中煙工業(yè)有限責任公司。

1.2 動物 SPF級雄性SD大鼠，體質量160～180 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK(湘)2016-0002，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22～26 ℃，相對濕度60%～70%。本實驗經江西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準，批準號為JZLLSC-20190171。

1.3 試劑 脂多糖(批號L2880)購自美國Sigma公司；C反應蛋白(CRP)和谷氨酰轉肽酶測定試劑盒(GGT)(批號分別為19021402和KR105)購自北京利德曼生化股份有限公司；蘇木精和伊紅染色液(批號分別為H8070和G1100)、 Masson三色染色試劑盒(批號G1340)購自北京索萊寶科技有限公司；TriZol裂解液(批號15596026)、逆轉錄試劑盒(貨號4368814)、SYBR Green PCR Master mix(批號00710493)購自美國Thermo Scientific公司；生理鹽水(批號1903210103)購自浙江都邦藥業(yè)股份有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)(批號KGB5001)購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；異丙醇(批號67-63-0)購自西隴化工股份有限公司；氯仿(批號865-49-6)購自上海麥克林生化科技有限公司；無核酸酶水(批號AM9937)購自美國Ambion公司；無水乙醇(批號64-17-5)購自西隴化工股份有限公司。

1.4 儀器 日立7100型全自動生化分析儀(上海日立高新技術國際貿易有限公司)；WPB PLT-UNR-RT-2型動物肺功能檢測系統(tǒng)(法國EMKA公司)；CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；RM2016型輪轉式切片機(德國Leica公司)；亞光YB-6LF型生物組織石蠟包埋機(孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司)；SpectraMax I3型多功能酶標儀(奧地利MD公司);Centrifuge5810R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；ABI750型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Luminex 200型多功能流式點陣儀(美國Luminex公司)。

2 方法

2.1 澤漆水提物制備 取干燥澤漆全草，按照1∶8料液比置于圓底燒瓶中加熱提取2次，每次2 h，紗布過濾，合并濾液，減壓回收溶劑濃縮，得稠浸膏(得率為20%)，真空條件下低溫干燥，即得。

2.2 分組、造模及給藥 將72只SD雄性大鼠按體質量隨機分為空白組(12只)和模型組(60只)，采用香煙煙霧暴露聯(lián)合氣管內滴入LPS方法來制備COPD大鼠模型[5]。在造模第1、15天，向模型組大鼠氣管內滴注0.2 mL 脂多糖(1 mg/mL)，空白組大鼠氣管內滴注0.2 mL生理鹽水；在第2～14、16～35天，每天將大鼠放在自制的密閉有機玻璃熏煙箱(30 cm×40 cm×60 cm)內給予被動吸煙，2次/d，30 min/次，每次12根香煙(焦油量11 mg，煙氣一氧化碳量12 mg)；空白組大鼠給予呼吸正?？諝猓掷m(xù)5周，在造模過程中有4只大鼠死亡。造模5周后，將模型大鼠隨機分為模型組，地塞米松組(0.81 mg/kg)，澤漆低、中、高劑量組(生藥1.25、2.5、5 g/kg)，每組12只，除空白組、模型組大鼠灌胃給予蒸餾水外，其余各組大鼠給予藥物治療，容量為10 mL/kg，1次/d，持續(xù)至第28天。

2.3 一般觀察 每天注意觀察各組大鼠的毛發(fā)、活動和精神狀態(tài)等情況。

2.4 大鼠血清指標檢測 大鼠每周進行1次眼眶采血，于4 ℃、3 000 r/min條件下離心15 min，分離血清并吸取適量(80 μL)置于全自動生化儀中，檢測GGT、CRP水平。

2.5 大鼠肺功能檢測 在給藥至第28 天，10%水合氯醛麻醉大鼠后，用肺功能儀及呼吸機連接氣管，待大鼠呼吸穩(wěn)定后測定并記錄肺功能相關參數(shù)，包括最大呼氣流量(Maximum expiratory flow,PEF)、肺動態(tài)順應性(Pulmonary dynamic compliance,Cdyn)、肺活量(Vital capacity,VC)、第0.1秒用力呼氣容積(Forced expiratory volume in 0.1 second,FEV0.1)、潮氣量(Tidal volume,TV)、呼氣量(Expiratory volume,EV)、每分通氣量(Minute ventilation,MV)、呼出50%潮氣量時呼氣流速(Expiratory flow rate at 50% tidal volume,EF50)。

2.6 大鼠肺泡灌洗液中炎性因子檢測 測完大鼠肺功能參數(shù)后，立即抽取肺泡灌洗液，預冷PBS沖洗，重復抽取3次，每次3 mL，使其回收率達到75%以上，灌洗經離心后置于-80 ℃冰箱中保存。采用高通量液相蛋白芯片技術，檢測大鼠肺泡灌洗液中白介素-1β(IL-1β)、白介素12(IL-12)、白介素17 A(IL-17A)、白介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素13(IL-13)水平。

2.7 大鼠肺組織及氣管組織病理學觀察

2.7.1 HE染色法檢測大鼠肺組織及氣管組織病理學變化 收集完 BALF 后，剪取大鼠右肺組織或氣管組織，在預冷PBS中稍作漂洗，吸水紙吸干，剪取大鼠右肺組織上葉或氣管組織，固定4%多聚甲醛溶液中24 h后，脫水處理并包埋于石蠟中，切片厚度為5 μm，經蘇木精及伊紅染色、脫水透明、中性樹膠封固等步驟后，在顯微鏡下觀察。

2.7.2 Masson染色法檢測大鼠肺組織病理學變化 剪取大鼠右肺組織，在預冷PBS中稍作漂洗后固定于4%多聚甲醛溶液中，經常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片、脫蠟等步驟后，根據(jù)試劑盒說明書進行Masson染色操作，最后用中性樹脂進行封片處理，切片晾干后在顯微鏡下觀察。

2.7.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)檢測大鼠肺組織mRNA表達 剪取大鼠右肺組織，Trizol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，擴增條件為活化50 ℃ 1 min，1個循環(huán)；預變性95 ℃ 3 s，1個循環(huán)；變性95 ℃ 3 s，退火60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)，以β-actin為內標，采用2-ΔΔCT法計算各組mRNA相對表達。所有引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

3 結果

3.1 一般觀察 造模開始第14天，大鼠出現(xiàn)咳嗽并逐漸加重；第20天后弓背蜷縮，喜歡扎堆，經常瞇眼，毛發(fā)灰黃無光澤并且有部分容易脫落；空白組大鼠不咳嗽，毛發(fā)光澤。給藥7 d后，地塞米松組、澤漆水提物組大鼠咳嗽癥狀減輕；10 d后，大鼠毛發(fā)逐漸變光亮；20 d后，大鼠毛色發(fā)白。與模型組比較，各組大鼠體質量呈緩慢增長趨勢，見圖1。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 澤漆水提物對大鼠血清中GGT、CRP水平的影響 在給藥期間(第6～9周)，與空白組比較，模型組大鼠(第7、9周)血清中GGT、CRP水平升高(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，第7周澤漆水提物高劑量組大鼠血清中GGT水平降低(P<0.05)，在第7、9周中澤漆水提物組其水平都有不同程度的降低(P<0.01)，見圖2～3。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

3.3 澤漆水提物對大鼠肺功能參數(shù)的影響 與空白組比較，模型組大鼠PEF、VC、FEV0.1、MV、EF50、Cdyn、TV、EV、EIP降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組大鼠PEF、FEV0.1、Cdyn升高(P<0.05)，澤漆水提物高劑量組大鼠PEF、 VC、 FEV 、Cdyn升高(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 澤漆水提物對大鼠肺功能參數(shù)的影響

3.4 澤漆水提物對大鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-12、IL-17A、TNF-α水平升高(P<0.01)，IL-10、IL-13水平降低(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-12、 IL-17A、TNF-α水平降低(P<0.01)，IL-10、IL-13水平升高(P<0.01)；澤漆水提物各給藥組對大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-12、IL-17A、TNF-α水平都有不同程度的降低作用，以高劑量組最明顯，見表3。

表3 澤漆水提物對大鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平的影響

3.5 澤漆水提物對大鼠肺及氣管組織病理損傷的影響 空白組大鼠肺泡結構完整，肺泡大小形態(tài)正常；模型組大鼠肺泡之間的間隔斷裂，存在皺縮融合現(xiàn)象，肺泡結構完整性被破壞；與模型組比較，澤漆水提物各給藥組均有不同程度的改善作用，其中地塞米松組和澤漆水提物高劑量組大鼠肺泡結構較為完整，見圖4。

圖4 澤漆水提物對COPD大鼠肺組織中肺泡病理學變化的影響(HE，×100)

空白組大鼠肺支氣管結構完整，四周少量炎性細胞浸潤；模型組大鼠的肺支氣管管腔狹窄、皺縮，四周有大量炎性細胞浸潤，肺支氣管形狀發(fā)生改變；與模型組比較，澤漆水提物各給藥組均有不同程度的改善作用，其中地塞米松組和澤漆水提物高劑量組大鼠肺支氣管組織炎性細胞浸潤程度顯著降低，肺支氣管結構較為完整，見圖5。

圖5 澤漆水提物對COPD大鼠肺組織中肺支氣管病理學變化的影響(HE，×100)

空白組大鼠肺氣管結構完整，黏膜上皮假復層柱狀纖毛上皮細胞排列整齊，杯狀細胞大小形態(tài)完整；與空白組大鼠比較，模型組大鼠的肺氣管無顯著性差異；與模型組比較，澤漆水提物各給藥組的肺氣管也無顯著差異，表明COPD大鼠的病理損傷主要在小氣道，見圖6。

圖6 澤漆水提物對COPD大鼠肺氣管組織病理學變化的影響(HE，×200)

3.6 澤漆水提物對大鼠肺組織膠原的影響 隨機選取6個區(qū)域，在100倍鏡下觀察大鼠肺組織Masson染色圖，利用Image J軟件對各組大鼠膠原纖維的面積進行半定量分析，發(fā)現(xiàn)空白組大鼠肺支氣管結構完整，四周僅有少量呈絲狀沉積；與空白組比較，模型組大鼠的肺支氣管管腔狹窄，肺支氣管四周有較多膠原沉積(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組及澤漆水提物低、高劑量組上述膠原沉積得到不同程度的改善(P<0.05，P<0.01)，見表4、圖7。

表4 澤漆水提物對大鼠肺組織膠原纖維化面積百分比的影響

圖7 澤漆水提物對COPD大鼠肺組織Masson染色的影響(×100)

3.7 澤漆水提物對大鼠肺組織中基質金屬蛋白酶系統(tǒng)相關mRNA表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺組織中MMP-2、MMP-12 mRNA表達升高(P<0.05，P<0.01)，而TIMP-2 mRNA表達降低(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松、澤漆水提物各給藥組MMP-2、MMP-12 mRNA表達降低(P<0.01)，表明澤漆水提物各給藥組能降低MMP-2/TIMP-2值(P<0.01)。與空白組比較，模型組大鼠肺組織中MMP-9 mRNA表達降低(P<0.01)，而TIMP-1 mRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組MMP-9、TIMP-1 mRNA表達降低(P<0.01)，澤漆水提物中劑量組中MMP-9 mRNA表達升高(P<0.01)，澤漆水提物各給藥組TIMP-1 mRNA表達降低(P<0.05，P<0.01)，表明澤漆水提物各給藥組能升高MMP-9/TIMP-1值 (P<0.01)，見圖8。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

與空白組比較，模型組大鼠肺組織中IL-6、TGF-β1 mRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組IL-6、TGF-β1 mRNA表達降低(P<0.01)，澤漆水提物各給藥組IL-6、TGF-β1 mRNA表達降低(P<0.01)，見圖9。

注：與空白組比較， ##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

3.8 澤漆水提物對大鼠肺組織Th1的IL-12/STAT4信號通路中相關mRNA表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺組織中T-bet、IL-12、STAT4 mRNA表達升高(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組T-bet、IL-12、STAT4 mRNA表達降低(P<0.01)，澤漆水提物低、中劑量組T-betmRNA表達降低(P<0.01)，澤漆水提物各給藥組中IL-12、STAT4 mRNA表達降低(P<0.05，P<0.01)，見圖10。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.9 澤漆水提物對大鼠肺組織Th2的IL-4/STAT6信號通路中相關mRNA表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺組織中GATA-3、IL-4、STAT6 mRNA表達降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組GATA-3、STAT6 mRNA表達升高(P<0.01)，澤漆水提物各給藥組GATA-3 mRNA表達升高(P<0.01)，澤漆水提物低劑量組IL-4、STAT6 mRNA表達升高(P<0.01)，高劑量組IL-4 mRNA表達升高(P<0.01)，見圖11。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

根據(jù)大鼠肺組織Th1的關鍵轉錄因子T-Bet和Th2的關鍵轉錄因子GATA-3的數(shù)據(jù)，并統(tǒng)計T-Bet與Th2、IL-4與IL-12、STAT4與STAT6之間的比值，發(fā)現(xiàn)澤漆水提物低、中劑量組可通過調節(jié)COPD大鼠Th1/Th2之間的平衡關系來達到抗炎作用，見圖12。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以氣流受限為特征的一種不可逆疾病，通常與肺部慢性炎癥反應升高有關[6]。慢性炎癥會導致氣道壁增厚、肺泡分離、氣道-實質相互依賴減少進而導致管腔狹窄[7]。本實驗采用香煙煙霧暴露聯(lián)合模擬細菌感染產生的內毒素來制備COPD大鼠模型，研究結果顯示，模型組大鼠肺功能參數(shù)下降、氣道狹窄、肺組織炎性細胞浸潤、肺支氣管膠原沉積等這些病理組織學變化都證實COPD大鼠模型制備成功。給藥組大鼠肺功能參數(shù)及組織病理學變化都得到明顯改善，這表明澤漆對COPD大鼠具有一定的藥效。

血清成分含有多種判斷肺損傷的標志物，肺損傷時血清GGT活性和CRP水平均明顯升高[8-9]。此外，CRP和GGT也與炎癥反應密切相關[8,10]。本研究結果顯示地塞米松組及澤漆給藥組能明顯降低大鼠血清中CRP水平，對GGT有一定的降低作用，提示澤漆減輕COPD大鼠的炎癥反應。

TGF-β1是一種重要的致纖維化細胞因子，上皮細胞和巨噬細胞能釋放TGF-β1，從而觸發(fā)纖維母細胞增生導致組織重構[11]。有研究表明TGF-β1能通過促進基質金屬蛋白酶抑制劑的作用從而抑制基質金屬蛋白酶(MMPS)的活性，從而刺激成纖維細胞和巨噬細胞合成并釋放促炎和致纖維化細胞因子，進而參與肺纖維化的形成，減少膠原的降解[12]，當機體出現(xiàn)肺組織纖維化時，肺組織間質有大量的細胞外基質(ECM)堆積，會導致MMP/TIMP系統(tǒng)發(fā)生紊亂。本研究結果顯示，模型組中TIMP-1 mRNA表達升高，而MMP-9 mRNA表達降低，這表明模型組大鼠的MMP-9/TIMP-1系統(tǒng)功能出現(xiàn)異常，進而導致ECM增多。澤漆降低大鼠肺組織中TGF-β1、TIMP-1 mRNA表達而升高MMP-9的mRNA表達，這表明澤漆能通過降低TGF-β1、調節(jié)MMP-9/TIMP-1平衡系統(tǒng)，減少肺組織中膠原的沉積，進而改善COPD大鼠肺組織纖維化。

MMPs可被吸煙或氧化應激激活[13]，最終導致MMPs表達上調如MMP-2和MMP-12等[14]。TIMPs是MMPs的抑制劑，能阻止MMPs裂解ECM組分[15]。促蛋白水解因子和抗蛋白水解因子及其特異性抑制劑的平衡表達維持了細胞外基質周轉的平衡。本研究結果顯示地塞米松及澤漆能降低MMP-2、MMP-12和MMP-2/TIMP-2值，這表明澤漆能通過調節(jié)MMP-2/TIMP-2之間平衡關系從而減輕大鼠肺纖維化的進程。

COPD是一種與異常免疫反應有關的炎癥反應，淋巴細胞參與慢性阻塞性肺病的先天和適應性免疫反應[16]。在不同的細胞因子刺激下，CD4+T細胞向Th1和Th2細胞分化。在其分化和功能上Th1/Th2是一對互相制約的平衡系統(tǒng)，對維持機體內免疫平衡發(fā)揮著重要作用，一旦這種平衡被打破，就會導致機體的免疫功能紊亂，進而導致疾病的發(fā)生發(fā)展[8]，Thl/Th2反應失調與多種慢性氣道炎癥有關。本研究結果顯示地塞米松和澤漆能明顯降低大鼠肺泡灌洗液中由Th1細胞中分泌的IL-12、TNF-α、IL-1β的水平，這表明澤漆能通過降低Th1細胞的促炎免疫反應從而調節(jié)Th1/Th2之間的平衡關系進而起抗炎作用。

轉錄蛋白(STAT)是由一系列胞質轉錄因子組成的信號轉導子和激活子，通過調節(jié)多種生物過程發(fā)揮重要作用[17]。STAT4在IL-12與受體結合后被激活，誘導CD4+T細胞分化為Th1細胞。IL-4能激活STAT6誘導CD4+T細胞分化為Th2細胞。有研究表明，STAT4參與了吸煙誘導的小鼠肺小氣道重塑的發(fā)展，并指出STAT4的異常表達調控了基質生成和氣道成纖維細胞表型[18]。此外，Th1細胞從CD4+T細胞的分化與IL-12/STAT4通路的激活有關，Th2細胞從CD4+T細胞的分化與IL-4/STAT6通路的激活有關。

本研究結果顯示地塞米松和澤漆能降低IL-12、T-bet及STAT4的mRNA的表達從而抑制Th1的免疫亢進，起抗炎免疫調節(jié)作用。地塞米松組降低了IL-4 mRNA表達，而升高GATA-3及STAT6的mRNA表達，這說明在取材的這個時間點，地塞米松組大鼠已經比澤漆提前進入了轉錄翻譯過程，這可能是地塞米松和澤漆的作用時間點不一致所致。澤漆能升高IL-4、GATA-3及STAT6的mRNA表達及從而增強Th2的免疫功能。根據(jù)大鼠肺組織Th1的關鍵轉錄因子T-Bet和Th2的關鍵轉錄因子GATA-3兩者間的比值， IL-4和IL-12兩者的比值及STAT4、STAT6兩者的比值關系得出，澤漆可通過降低T-bet/GATA-3、IL-12/IL-4和STAT4/STAT6的比值從而調節(jié)COPD大鼠Th1/Th2之間的平衡關系而起抗炎免疫調節(jié)作用。

上述結果表明，澤漆可能通過抑制Th1中IL-12/STAT4通路的激活并促進Th2中IL-4/STAT6通路的激活來調節(jié)Th1/Th2之間的平衡關系，從而對COPD大鼠起抗炎作用。當機體的炎癥介質和抗炎介質保持平衡時，身體保持健康狀態(tài)。當這種平衡轉向炎癥介質時，器官、組織或細胞將觸發(fā)炎癥反應。因此，糾正炎癥與抗炎癥的不平衡是治療慢性阻塞性肺病的策略之一。本實驗結果為澤漆在治療COPD的臨床應用提供了實驗依據(jù)，為開發(fā)抗COPD的藥物奠定了基礎。