基于萘酸酐的水溶性熒光探針：合成以及在細(xì)胞成像中的應(yīng)用

黃存存， 晏琦帆

（華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237）

熒光成像技術(shù)已成為具有高空間分辨率以及實(shí)時(shí)非侵入式生物過(guò)程可視化功能的強(qiáng)大工具，可用于癌細(xì)胞的早期診斷和治療等[1-4]。優(yōu)異的熒光探針必須滿足以下條件：一定的波長(zhǎng)范圍、熒光發(fā)射強(qiáng)度高、生物穩(wěn)定性好、光穩(wěn)定性能高、水溶性好、靈敏度高?；诜肿幼R(shí)別和特定的有機(jī)反應(yīng)原理，研究開(kāi)發(fā)了多種多樣的熒光探針。目前，使用廣泛并具有代表性的熒光探針類別包括有機(jī)染料[5-6]、生物熒光團(tuán)[7]、量子dots[8]等，而常被用于構(gòu)建熒光探針的染料片段包括熒光素、羅丹明、花青、BODIPY、萘酰亞胺等[9]。其中BODIPY 是受歡迎的一類熒光團(tuán)[10]，在生物成像中獲得了空前的成功，但缺點(diǎn)是其在特定細(xì)胞器中的積累會(huì)引起聚集淬滅，并且該類分子的水溶性不高。酰亞胺類也是常見(jiàn)的功能性良好的熒光探針片段，尤其是萘酰亞胺，富含具有光物理性質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其吸收和熒光發(fā)射光譜位于紫外和熒光的可見(jiàn)光區(qū)域[11-12]。另外，萘酰亞胺易于修飾，可通過(guò)理性的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)輕松地微調(diào)各種光物理性質(zhì)，生物相容性高。

近幾年，在熒光探針?lè)肿釉O(shè)計(jì)方面，水溶性問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注。在生物化學(xué)的應(yīng)用研究中，特別是在細(xì)胞成像方面，由于有機(jī)溶劑會(huì)破壞生物分子的正常功能，因而探針?lè)肿恿己玫乃苄灾陵P(guān)重要。目前，水溶性差的小分子探針通常是通過(guò)包裹在水溶性基質(zhì)中進(jìn)行生物應(yīng)用，或者在分子設(shè)計(jì)中通過(guò)引入含離子鹽側(cè)鏈或與金屬離子配位來(lái)提高探針的水溶性，但這增加了制備和分離的難度。Peng 等[13]合成了DCF-MPYM 染料，該染料通過(guò)引入一個(gè)羧酸基團(tuán)來(lái)增加探針?lè)肿拥乃苄?，其在?xì)胞成像的應(yīng)用中依然被包裝在BSA 基質(zhì)中以隔絕氧氣，防止熒光淬滅。Zhang 等[14]合成了具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）功能的TCM 系列探針，為解決探針的親水性和親脂性問(wèn)題，以及防止探針在進(jìn)入細(xì)胞前聚集，他們添加了三苯基膦基團(tuán)以增加水溶性，使得探針在細(xì)胞應(yīng)用中有很好的效果。Yang 等[15]開(kāi)發(fā)了具有典型熱活化延遲熒光（TADF）和結(jié)晶誘導(dǎo)的室溫磷光（RTP）特征的新型供體-受體（D-A）熒光探針PXZT，通過(guò)PXZT 與鋅離子的配位，進(jìn)而得到水溶性的無(wú)熒光分子ZnPXZT1，分子進(jìn)入細(xì)胞后，ZnPXZT1會(huì)自動(dòng)解離釋放PXZT，由于PXZT 的疏水性會(huì)引發(fā)分子聚集進(jìn)而開(kāi)啟聚集誘導(dǎo)的TADF 發(fā)射，其熒光成像效果良好。

本文基于螺芴骨架，通過(guò)分子內(nèi)弱相互作用連接供體和受體，設(shè)計(jì)合成了D-π-A 體系，骨架采用9,9’-螺二芴這種經(jīng)典的螺形非共平面分子，中心碳原子通過(guò)sp3雜化使得兩個(gè)芴單元互相垂直，形成十字架結(jié)構(gòu)，提供有效的立體需求。這種剛性結(jié)構(gòu)不僅能夠阻止分子之間的團(tuán)聚，還能有效抑制熒光淬滅。另外探針?lè)肿拥氖荏w使用的是萘酰亞胺熒光團(tuán)，其易于修飾和發(fā)光性能好的優(yōu)點(diǎn)受到很多人的青睞，但純油性分子的水溶性差，應(yīng)用于細(xì)胞成像前需要將探針?lè)肿影谒苄粤己玫幕|(zhì)中，這增加了合成的難度。為了解決探針的水溶性問(wèn)題，通常的方法是在萘酰亞胺熒光團(tuán)上引入低聚乙二醇和含離子鹽的水溶性側(cè)鏈。本文提出將萘酰亞胺基團(tuán)直接水解得到萘酸酐，一方面萘酸酐基團(tuán)的引入可以使得探針?lè)肿釉谥行院蜕硭嵝匀芤褐蝎@得足夠的水溶性，另一方面該制備方法簡(jiǎn)單，制得的萘酸酐探針?lè)肿涌扇苡谟袡C(jī)相中，有利于探針的分離純化。細(xì)胞成像測(cè)試結(jié)果表明3 個(gè)探針?lè)肿尤旧Ч己?，水溶性和生物相容性良好，有望成為癌?xì)胞可視化的強(qiáng)大工具。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與試劑

4,4’-二甲氧基二苯胺、9,9-二己基-2,7-二溴芴，購(gòu)于上海麥克林生化科技公司；氯仿、二氯甲烷、乙酸酐、硝酸、二水合氯化亞錫、乙醚、鹽酸、亞硝酸鈉、碘化鉀、無(wú)水乙醇、石油醚、碳酸鉀、二氯化鈀、四氫呋喃（THF）、氯化鈉、甲苯、乙腈、乙酸乙酯、乙酸鉀、乙酸、硫酸鈉、氯化銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉、叔丁醇（t-BuOH）、叔丁醇鉀（t-BuOK）、甲醇、1,4-二氧六環(huán)、四氟硼酸三叔丁基膦（t-Bu3PHBF4）、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯、9,9’-螺二芴，均購(gòu)于上海泰坦科技股份有限公司；[1,1’-雙（二苯基膦）二茂鐵] 二氯化鈀（Pd(dppf)Cl2）、三（二亞芐基丙酮）二鈀（Pd2(dba)3）、4-溴-1,8-萘酐、2-乙基己胺，均購(gòu)于上海阿拉丁試劑股份有限公司；三苯基膦、二甲亞砜，購(gòu)于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。以上所有試劑均為分析純。

1.2 測(cè)試與表征

核磁共振氫譜（1H-NMR）與核磁共振碳譜（13CNMR）：分別采用瑞士布魯克公司的AVANCE Ш400 型超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振波譜儀(400 MHz)和Ascend 600 型 的 核 磁 共 振 波 譜 儀（600 MHz），在室溫下測(cè)量，以四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)，以氘代氯仿（CDCl3)、氘代二甲基亞砜（DMSO-d6）為溶劑。

質(zhì) 譜（MS ） 采 用 美 國(guó)Waters 公 司 生 產(chǎn)的GCTPremier 型電子轟擊(EI)-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，測(cè)試范圍10～1 500 Da，分辨率≥7 000；ESI-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，型號(hào)為Xevo G2 TOF MS，測(cè)試范圍50～4 000 Da，分辨率≥20 000；飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采用新加坡ABS 公司生產(chǎn)4800plus，測(cè)試范圍400～500 000 Da。檢測(cè)樣品質(zhì)量大約是5 mg。

紫外-可見(jiàn)光吸收光譜（UV-Vis）：采用日本SHIMADZU 公司生產(chǎn)的型號(hào)為Cary 60 的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，樣品分別溶于二甲基亞砜、去離子水、磷酸鹽緩沖液（PBS）、不同pH 緩沖溶液中并稀釋成濃度10 μmol/L，然后在比色皿中檢測(cè)，掃描范圍200～800 nm，室溫下測(cè)定。

熒光發(fā)射光譜：采用HORIBA 高靈敏一體式熒光光譜儀，型號(hào)FluoroMax-4，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為紫外-可見(jiàn)光吸收光譜的最大吸收波長(zhǎng)，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)為10 nm，電壓設(shè)定為530 V，樣品稀釋成濃度為10 μmol/L 后于二甲基亞砜中檢測(cè)，測(cè)定溫度室溫。熒光量子效率的測(cè)定采用參比法，標(biāo)準(zhǔn)化合物為羅丹明6G，室溫下測(cè)定。

共聚焦成像：采用德國(guó)卡爾蔡司生產(chǎn)的Laser Scanning Confocal Microscopy (Nikon A1R and TCS SP8)測(cè)試，配制探針濃度為10 μmol/L，孵育Hela 細(xì)胞30 min，進(jìn)行激光掃描測(cè)試。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 化 合 物2 和 化 合 物5 的 制 備 Buchwald-Harting（碳氮偶聯(lián)）的一般反應(yīng)條件，以化合物5 的制備為例。分別稱取化合物4[16]（200 mg, 0.27 mmol）和化合物1[16]（200 mg，0.28 mmol）、4,4'-二甲氧基二苯胺（91.8 mg，0.40 mmol）、三（二亞芐基丙酮）二鈀（19.8 mg，0.02 mmol）、四氟硼酸三叔丁基膦（23.5 mg，0.08 mmol）和 叔 丁 醇 鉀（49.9 mg，0.45 mmol）于Schlenk 管內(nèi)，抽真空充氮?dú)? 次，加入除氧重蒸過(guò)的甲苯10 mL，氮?dú)饷芊?，反?yīng)混合物在50 ℃加熱30 min，然后120 ℃回流過(guò)夜。冷卻至室溫后，將有機(jī)層分別用飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次、二氯甲烷萃取3 次，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥。真空除去溶劑后，將粗產(chǎn)物通過(guò)柱層析純化，用石油醚和二氯甲烷（體積比9∶1）洗脫，用二氯甲烷和甲醇進(jìn)行重結(jié)晶，得到黃 色 固 體5（120 mg，產(chǎn) 率52%）和 磚 紅 色 固體2（149.3 mg，產(chǎn)率63%）。

1.3.2 化合物8 的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[17]方法制備化合物8，所得產(chǎn)物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17] 一致。將4,4’-二甲氧基二苯胺（2.33 mg，10.16 mmol）、9,9-二己基-2,7 二溴芴（1.0 g，2.03 mmol）、叔丁醇鉀（360.1 mg，3.25 mmol）、四氟硼酸三叔丁基膦（120.5 mg，0.41 mmol）、三（二亞芐基丙酮）二鈀（99 mg，0.10 mmol）一起加入到烘干的Schlenk 管中，抽真空充氮?dú)? 次，加入重蒸過(guò)的甲苯50 mL，80 ℃下加熱攪拌22 h。然后冷卻至室溫，分別用乙酸乙酯萃取3 次、飽和氯化鈉溶液洗滌3 次，取有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥，減壓旋蒸除去溶劑得粗產(chǎn)物。通過(guò)柱層析進(jìn)一步純化，石油醚和乙酸乙酯（體積比9∶1）作為展開(kāi)劑，得到黃色固體7-溴-9,9-二己基-N,N-雙（4-甲氧基苯基）-9H 芴-2-胺（701.2 mg，產(chǎn)率54%）。

分別稱取7-溴-9,9-二己基-N,N-雙（4-甲氧基苯基）-9H 芴-2-胺（500 mg，0.78 mmol）、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯（297.4 mg，1.17 mmol）、[1,1’-雙（二苯基膦）二茂鐵]二氯化鈀（44 mg，0.114 mmol）和醋酸鉀（114.6 mg，1.17 mmol），加入到烘干的100 mL Schlenk 燒瓶中，抽真空充氮?dú)? 次，加入10 mL 重蒸的1,4-二氧六環(huán)，用氮?dú)饷芊?，將反?yīng)在70 ℃下攪拌回流12 h。冷卻至室溫后，用乙酸乙酯萃取3 次，用飽和氯化鈉溶液洗滌3 次，有機(jī)相用硫酸鈉干燥，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，留下黑色油狀物。將該油狀物通過(guò)柱層析純化，并使用乙酸乙酯與石油醚的體積比逐漸增加的展開(kāi)劑進(jìn)行淋洗，然后旋干得到黃色油狀物，乙醇重結(jié)晶，得到黃色的固體7（299.8 mg，產(chǎn)率56%）。

分別稱取化合物7（278.5 mg，0.41 mmol），化合物4（200 mg，0.27 mmol）、四（三苯基膦）鈀（5.8 mg，0.01 mmol） 、 碳 酸 鉀（ 91.2 mg， 0.66 mmol）于Schlenk 管中，抽真空充氮?dú)? 次，向反應(yīng)器中分別加入四氫呋喃10 mL 和去離子水1 mL，用氮?dú)饷芊?，將反?yīng)在65 ℃下回流過(guò)夜。冷卻至室溫后，將有機(jī)層用鹽水洗滌3 次、二氯甲烷萃取3 次，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥。真空除去溶劑后，將粗產(chǎn)物通過(guò)柱層析進(jìn)一步純化，并使用乙酸乙酯與石油醚的體積比逐漸增加的展開(kāi)劑進(jìn)行淋洗，得到黃色固體化合物8（147 mg，產(chǎn)率46%）。

1.3.3 探針?lè)肿拥暮铣?參考文獻(xiàn)[18]方法并進(jìn)一步改進(jìn)。水解反應(yīng)的一般步驟是：在叔丁醇（10 mL）中加入萘酰亞胺衍生物（0.80 mmol），室溫下攪拌20 min，再加入氫氧化鉀（817 mg，16.0 mmol），在氮?dú)夥諊禄亓骷訜? h，冷卻至室溫后，加入乙酸30 mL。室溫下再攪拌5 h，析出固體，過(guò)濾，柱層析純化，以石油醚和二氯甲烷（體積比2∶1）作為展開(kāi)劑得到固體，在二氯甲烷和甲醇中重結(jié)晶，得到相應(yīng)的3 個(gè)探針?lè)肿?、6、9。基于萘酸酐的這3 個(gè)探針?lè)肿右兹芙庥谟袡C(jī)溶劑，并可以在有機(jī)溶劑中分離純化，大大減少了普通水溶性熒光探針?lè)蛛x純化的難度，為設(shè)計(jì)合成水溶性熒光探針提供了新的思路。酸酐取代基由于對(duì)水溶液或生理?xiàng)l件下pH 的響應(yīng)，其在中性或弱堿性條件下可轉(zhuǎn)化為帶電荷的羧酸根基團(tuán)，從而使探針?lè)肿訌挠腿苄赞D(zhuǎn)化為水溶性，方便探針?lè)肿釉谏锍上穹矫娴膽?yīng)用。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針的結(jié)構(gòu)表征

通過(guò)Buchwald-Harting 反應(yīng)（碳氮偶聯(lián)）/Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)和水解反應(yīng)制備探針3、6、9（圖1），其結(jié)構(gòu)經(jīng)由核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、質(zhì)譜等譜學(xué)技術(shù)表征。

圖1 化合物3、6、9 的合成路線Fig. 1 Synthetic routes of compounds 3、6 and 9

化合物2（紅色固體，54%）：1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.54 (d, 1H,J= 7.2 Hz), 8.49 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 8.09 (d, 1H,J= 8.8 Hz), 7.85 (d, 1H,J= 7.6 Hz),7.73 (d, 2H,J= 7.2 Hz), 7.68 (d, 1H,J= 8.4 Hz),7.56～7.52 (m, 2H), 7.46 (dd, 1H,J= 7.8, 1.0 Hz), 7.33(t, 2H,J= 7.4 Hz), 7.16 (t, 2H,J= 7.4 Hz), 6.90 (d, 7H,J= 8.4 Hz), 6.75 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 6.69 (d, 4H,J= 8.8 Hz), 6.47 (d, 1H,J= 1.6 Hz), 4.15～4.05 (m, 2H), 3.74 (s,6H), 1.94～1.89 (m, 1H), 1.37～1.27 (m, 8H), 0.91 (t, 3H,J= 7.4 Hz), 0.85 (t, 3H,J= 6.8 Hz)；13C-NMR (151 MHz, CDCl3,δ) : 164.9, 164.7, 155.8, 150.5, 149.7,149.3, 148.8, 147.1, 142.4, 141.9, 141.0, 136.9, 134.0,132.8, 131.3, 130.9, 130.1, 129.9, 128.9, 127.94, 127.91,127.9, 126.8, 126.2, 125.5, 124.1, 123.0, 121.5, 121.2,121.0, 120.4, 119.2, 116.8, 114.7, 66.2, 55.6, 44.3, 38.1,31.0, 28.9, 24.3, 23.3, 14.3, 10.9；MS (EI) calcd. for C59H50N2O4: 850.4 (m/z), found 850.4 (m/z)。

化合物3（紅色固體，83%）：1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.56 (dd, 1H,J= 7.2, 0.4 Hz), 8.51 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 8.20 (dd, 1H,J= 8.6, 0.6 Hz), 7.86 (d, 1H,J= 8.0 Hz), 7.74 (d, 2H,J= 7.6 Hz), 7.69 (d, 1H,J= 8.4 Hz), 7.61～7.57 (m, 2H), 7.45 (dd, 1H,J= 8.0, 1.6 Hz),7.34 (td, 2H,J= 7.5, 0.7 Hz), 7.17 (td, 2H,J= 7.6, 0.8 Hz), 6.93～6.89 (m, 7H), 6.75 (d, 1H,J= 0.8 Hz),6.71～6.67 (m, 4H), 6.47 (d, 1H,J= 2.0 Hz), 3.74 (s,6H)；13C- NMR (151 MHz, CDCl3,δ)： 161.0, 160.8,155.9, 150.6, 149.9, 149.5, 148.8, 148.6, 142.9, 141.9,140.9, 136.0, 134.4, 133.7, 133.4, 133.1, 131.1, 130.4,129.8, 128.4, 128.01, 128.0, 127.2, 126.3, 125.4, 124.0,121.08, 121.06, 120.4, 119.4, 119.0, 117.3, 116.6, 114.7,66.1, 55.6；MS (EI) calcd. for C51H33NO5：739.2 (m/z),found 739.2 (m/z)。

化合物5（黃色固體，46%）：1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.59 (dd, 1H,J= 7.4, 0.6 Hz), 8.56 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 8.14 (dd, 1H,J= 8.4, 0.8 Hz), 7.92 (d, 1H,J= 8.0 Hz), 7.85 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.68 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.64 (t, 1H,J= 8.0 Hz), 7.59 (dd, 2H,J= 8.0, 1.6 Hz), 7.48 (dd, 1H,J= 8.0, 1.6 Hz), 7.39 (td, 1H,J= 7.5,0.9 Hz), 7.31 (td, 1H,J= 7.6, 0.8 Hz), 7.19 (td, 1H,J=7.5, 0.9 Hz), 7.04 (td, 1H,J= 7.6, 0.8 Hz), 7.93 (d, 1H,J= 1.2 Hz), 6.90～6.85 (m, 6H), 6.73 (d, 1H,J= 7.6 Hz),6.67 (dd, 4H,J= 6.8, 2.4 Hz), 6.54 (d, 1H,J= 2.0 Hz),4.18～4.08 (m, 2H), 3.73 (s, 6H), 1.98～1.92 (m, 1H),1.41～1.29 (m, 8H), 0.93 (t, 3H,J= 7.4 Hz), 0.87 (t, 3H,J= 7.0 Hz);13C-NMR (151 MHz, CDCl3,δ): 164.9,164.7, 155.8, 150.5, 149.7, 149.3, 148.8, 147.1, 142.4,141.9, 141.0, 136.9, 134.0, 132.8, 131.3, 130.9, 130.1,129.9, 128.9, 127.94, 127.91, 127.9, 126.8, 126.2, 125.5,124.0, 123.0, 121.5, 121.2, 121.0, 120.4, 119.2, 116.8,114.7, 66.2, 55.6, 44.3, 38.1, 31.0, 28.9, 24.3, 23.3, 14.3,10.9；MS (EI) calcd. for C59H50N2O4: 850.4 (m/z), found 850.4 (m/z)。

化合物6（亮 黃 色固體，73%）：1H-NMR (400 MHz, CDCl3,δ): 8.61 (dd, 1H,J= 7.6, 0.8 Hz), 8.58 (d,1H,J= 7.6 Hz), 8.25 (dd, 1H,J= 8.4, 0.8 Hz),7.94 (d,1H,J= 8.0 Hz), 7.85 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.69～7.58 (m,5H), 7.47 (dd, 1H,J= 8.0, 1.6 Hz),7.40 (td, 1H,J= 7.4,0.8 Hz),7.31 (td, 1H,J= 7.4, 0.6 Hz), 7.20 (td, 1H,J=7.6, 0.8 Hz), 7.05 (td, 1H,J= 7.4, 0.8 Hz), 6.94 (d, 1H,J= 1.6 Hz), 6.91～6.85 (m, 6H), 6.73 (d, 1H,J= 7.2 Hz),6.69～6.65 (m, 4H), 6.53 (d, 1H,J= 2.0 Hz), 3,73 (s,6H);13C- NMR (151 MHz, CDCl3,δ) ： 161.0, 160.7,155.7, 150.2, 149.6, 149.5, 148.8, 148.8, 148.2, 142.8,141.9, 141.2, 140.8, 137.4, 135.2, 134.2, 133.5, 133.13,131.10, 130.5, 129.7, 128.7, 128.4, 128.1, 127.4, 126.9,125.9, 125.4, 124.4, 123.9, 121.8, 120.8, 120.7, 120.5,119.5, 119.1, 117.6, 117.1, 114.7, 66.2, 55.7；MS (EI)calcd. for C51H33NO5: 739.2 (m/z), found 739.2 (m/z)。

化合物8（黃色固體，52%）：1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.52 (d, 2H,J= 6.8 Hz), 8.10 (d, 1H,J= 8.4 Hz), 8.04 (d, 1H,J= 6.4 Hz), 7.97 (d, 1H,J= 6.0 Hz),7.89 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.84 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.67(d, 1H,J= 8.4 Hz), 7.59 (d, 1H,J= 6.4 Hz), 7.56～7.51(m, 2H), 7.48～7.37 (m, 5H), 7.34～7.11(m, 4H),7.05～7.04 (m, 4H), 6.95～6.87(m, 4H), 6.86～6.80 (m,5H), 4.17～4.03 (m, 2H), 3.79 (s, 6H), 1.92～1.77 (m, 5H),1.37～1.26 (m, 8H), 1.10～1.00 (m, 12H), 0.92～0.85 (m,6H), 0.76～0.75 (m, 6H), 0.64～0.60 (m, 4H)；13C-NMR(101 MHz, CDCl3,δ): 164.8, 164.7, 155.6, 152.4, 151.3,149.9, 149.4, 149.1, 149.0, 148.4, 146.8, 142.4, 141.9,141.7, 141.3, 141.0, 140.8, 138.6, 138.4, 134.2, 132.6,131.3, 130.9, 130.1, 130.0, 128.9, 128.7, 128.2, 128.0,127.4, 126.9, 126.0, 124.6, 124.1, 123.0, 122.6, 121.8,121.2, 120.9, 120.6, 120.3, 119.0, 116.7, 114.8, 66.4,55.7, 55.2, 44.4, 40.4, 38.1, 31.6, 31.0, 29.8, 28.9, 24.3,23.9, 23.2, 22.7, 14.3, 14.2, 10.9；MS (ESI) calcd. for C84H82N2O4: 1 182.6 [M]+, found 1 183.6[M+H+]。

化合物9（黃色固體，79%）：1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.55 (d, 1H,J= 4.0 Hz), 8.53 (d, 1H,J= 4.8 Hz), 8.21 (d, 1H,J= 8.8 Hz), 8.05 (d, 1H,J= 8.0 Hz),7.97 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.89 (d, 1H,J= 8.0 Hz), 7.85(d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.69～7.64 (m, 2H), 7.58～7.53 (m,2H), 7.50～7.32 (m, 6H), 7.23 (t, 1H,J= 7.8 Hz), 7.15 (t,1H,J= 7.8 Hz), 7.11～7.03 (m, 5H), 6.95～6.88 (m, 4H),6.84～6.80 (m, 5H), 3.80 (s, 6H), 1.84～1.77 (m, 4H),1.10～1.00 (m, 12H), 0.77～0.73 (m, 6H), 0.65～0.60 (m,4H);13C- NMR (101 MHz, CDCl3,δ): 161.0, 160.7,155.7, 152.4, 151.4, 150.2, 149.4, 149.0, 148.8, 148.6,148.4, 142.9, 141.9, 141.7, 141.1, 141.0, 140.9, 138.5,137.6, 134.3, 134.1, 133.5, 133.1, 131.0, 130.4, 130.0,128.9, 128.5, 128.32, 128.3, 128.0, 127.4, 127.3, 126.1,125.8, 124.7, 124.1, 122.5, 121.2, 120.9, 120.71, 120.7,120.5, 120.4, 120.3, 119.0, 117.6, 116.7, 114.8, 66.4,55.7, 55.2, 40.4, 31.6, 29.8, 23.9, 22.7, 14.2；MS (Maldi Tof)calcd. for C76H65NO5: 1 071.5 (m/z), found 1 071.5 (m/z)。

2.2 光物理性能表征

2.2.1 紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光發(fā)射光譜 首先比較探針?lè)肿?、6、9 在二甲基亞砜中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，如圖2（a）所示?？梢?jiàn)探針?lè)肿? 在351 nm處的強(qiáng)譜帶歸因于其π-π 共軛骨架的吸收，400～500 nm 處較長(zhǎng)的寬吸收帶是由于電子給體的4,4'-二甲氧基二苯氨基單元和電子受體的萘酸酐單元之間的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）躍遷的結(jié)果?；诜肿觾?nèi)電荷轉(zhuǎn)移類型的躍遷，探針的熒光發(fā)射性質(zhì)對(duì)溶劑極性非常敏感[16]。因此對(duì)于探針?lè)肿?，采取本共軛（HOMO-conjugation）的方式將電子給體和電子受體進(jìn)行鍵連，其吸收峰值明顯藍(lán)移至356 nm，這一吸收帶應(yīng)該是由4,4'-二甲氧基二苯氨基螺芴的π-π*躍遷引起。因此，在探針6 的4,4'-二甲氧基二苯氨基和螺芴片段中，插入一個(gè)芴的結(jié)構(gòu)，能明顯使吸收峰發(fā)生紅移。探針?lè)肿? 的吸收峰值紅移至382 nm，更加有利于細(xì)胞成像中的光激發(fā)（激發(fā)波長(zhǎng)404 nm）。探針?lè)肿?、6、9 在二甲基亞砜稀溶液中的熒光發(fā)射光譜如圖2（b）所示，最大發(fā)射峰依次為3 （519 nm），6（440 nm）和9（504 nm），峰值的變化趨勢(shì)與3 個(gè)探針?lè)肿拥淖贤?可見(jiàn)吸收光譜相吻合。進(jìn)一步測(cè)定并計(jì)算了探針?lè)肿?、6、9 的熒光量子產(chǎn)率（Φ），分別是0.51，0.07，0.23（表1）。探針?lè)肿? 是探針?lè)肿? 的改進(jìn)，可見(jiàn)其發(fā)射峰值的位置和熒光量子產(chǎn)率明顯增加，有利于探針?lè)肿釉诩?xì)胞成像中的應(yīng)用。

表1 化合物3、6、9 在二甲基亞砜中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的表征數(shù)據(jù)Table 1 UV-vis absorption and fluorescence emission characterization data of compounds 3, 6, 9 in dimethyl sulfoxide

圖2 化合物3、6、9 在二甲基亞砜中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜（a）和熒光發(fā)射光譜（b）Fig. 2 UV-vis absorption spectra (a) and fluorescence emission spectra (b) of compounds 3, 6, 9 in dimethyl sulfoxide

2.2.2 探針的水溶性測(cè)試 由于酸酐基團(tuán)與堿作用可轉(zhuǎn)化為羧酸根，因此酸酐基團(tuán)為探針?lè)肿釉谏項(xiàng)l件下的水溶性提供了重要的作用。為了探索探針?lè)肿有螒B(tài)與水溶液酸堿性之間的關(guān)系。以探針?lè)肿? 為例，測(cè)試了其在不同pH 下的紫外-可見(jiàn)吸收光譜（圖3(a)）。隨著溶液堿性的不斷增加，光譜最大吸收波長(zhǎng)處的吸收強(qiáng)度隨之增強(qiáng)。將365 nm 處的吸光度和472 nm 處的吸光度比值（A365/A472）對(duì)pH 值作圖（圖3(b)），可以看出，比值隨pH 增大而單調(diào)上升，表明分子中的酸酐官能團(tuán)逐漸與溶液中氫氧根負(fù)離子作用，轉(zhuǎn)變?yōu)轸人?羧酸根結(jié)構(gòu)和雙羧酸根結(jié)構(gòu)。由于這種轉(zhuǎn)變探針?lè)肿訋狭穗姾?，其在中性或生理酸性水溶液中的溶解能力得到了提高。生理?xiàng)l件（PBS 緩沖溶液，pH 約為7.4）下，溶液呈中性或偏弱堿性，此時(shí)酸酐基團(tuán)已經(jīng)向羧酸根進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使得這類探針?lè)肿幼兊盟埽⒖捎糜谏項(xiàng)l件下的細(xì)胞成像。

為了進(jìn)一步了解探針?lè)肿?、6、9 在水中和生理緩沖溶液（pH 約為7.4）中的吸收情況，考察了他們的紫外-可見(jiàn)吸收?qǐng)D譜（歸一化處理），結(jié)果分別如圖3（c）和（d）所示。與圖2 探針?lè)肿?、6、9 在二甲基亞砜中的吸收曲線進(jìn)行比較，可見(jiàn)3 個(gè)探針?lè)肿拥奈展庾V沒(méi)有明顯的變化，這說(shuō)明其水溶性皆良好，但3 個(gè)探針?lè)肿咏杂凶畲笪詹ㄩL(zhǎng)和起峰紅移現(xiàn)象，這是因?yàn)榕c二甲基亞砜相比，溶劑極性增大，探針?lè)肿拥募ぐl(fā)態(tài)受影響，從而使其能量強(qiáng)度降低。比較圖3（c）和3（d）可以看出，探針?lè)肿? 的水溶性隨著溶液堿性的增加而明顯增加，表明酸酐基團(tuán)對(duì)探針?lè)肿铀苄缘奶岣咂鸬搅酥匾饔谩?/p>

圖3 （a）化合物3 在不同pH 下的紫外-可見(jiàn)吸收曲線；（b）化合物3 在不同pH 下A365/A472 的比值；化合物3、6、9 在水中（c）和在PBS 緩沖溶液中（d）的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig. 3 (a) UV-Vis absorption spectra of compound 3 at different pH; (b)A365 / A472 ratio at different pH of compound 3; Normalized UV-Vis absorption spectra of compound 3, 6, 9 in water (c) and in PBS buffer solution (d)

2.2.3 共聚焦成像 為了探索基于3 個(gè)探針?lè)肿拥目梢暬┘?xì)胞的可行性，進(jìn)行了Hela 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。將Hela 細(xì)胞與3、6、9 3 個(gè)探針（10 μmol/L）在37 ℃、CO2/空氣（體積比5∶95）的條件下孵育30 min，隨后用PBS 溶液將細(xì)胞沖洗3 次，進(jìn)行共聚焦成像實(shí)驗(yàn)，其中激發(fā)波長(zhǎng)λex= 404 nm。如圖4 所示，3 個(gè)探針皆成功染色，其中探針3 和9 孵育的Hela 細(xì)胞在綠色通道中顯示了較強(qiáng)的熒光，探針6 孵育的細(xì)胞顯示了相對(duì)較弱的熒光，3 個(gè)探針的成像均背景信號(hào)干擾小，信噪比高。探針9 的熒光強(qiáng)度和成像效果高于探針6，這說(shuō)明結(jié)構(gòu)的改進(jìn)達(dá)到了良好的效果。3 個(gè)探針中，探針3 的成像效果最好，熒光強(qiáng)度最高，這是因?yàn)槠涔曹椥粤己?，熒光發(fā)射波長(zhǎng)最長(zhǎng)?？傊?，細(xì)胞成像結(jié)果表明設(shè)計(jì)合成的3 個(gè)探針均可以作為靶向癌細(xì)胞成像的有前途的工具。

圖4 化合物3、6、9 對(duì)Hela 細(xì)胞的共聚焦成像Fig. 4 Confocal imaging of Hela cells with compound 3, 6 and 9

3 結(jié)論與展望

本文成功設(shè)計(jì)并合成了以螺芴為骨架基于萘酸酐基團(tuán)的3 個(gè)水溶性良好的探針?lè)肿?，6，9，這是通過(guò)簡(jiǎn)單有效的化學(xué)修飾手段，將普通有機(jī)油溶性染料轉(zhuǎn)變成了水溶性良好的探針，為設(shè)計(jì)合成水溶性熒光探針提供了新思路。通過(guò)一系列光物理測(cè)試，發(fā)現(xiàn)隨著溶劑堿性的增加，分子中的酸酐官能團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轸人?羧酸根結(jié)構(gòu)和雙羧酸根結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步提高了探針?lè)肿釉谥行曰蛏硭嵝韵滤芤褐腥芙獾哪芰Γ固结樉哂辛肆己玫乃苄砸岳诩?xì)胞成像。共聚焦細(xì)胞成像中，3 個(gè)探針?lè)肿咏猿晒θ旧?，背景信?hào)干擾小，信噪比高，其中探針?lè)肿? 的成像效果最好，熒光強(qiáng)度最高，可作為靶向癌細(xì)胞成像的有前途的工具。本文的結(jié)果對(duì)于設(shè)計(jì)合成基于萘酸酐基團(tuán)水溶性熒光探針提供了重要的參考意義。