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    基于萘酸酐的水溶性熒光探針:合成以及在細(xì)胞成像中的應(yīng)用

    2021-10-26 08:26:44黃存存晏琦帆
    關(guān)鍵詞:二甲基亞砜酸酐吸收光譜

    黃存存, 晏琦帆

    (華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海 200237)

    熒光成像技術(shù)已成為具有高空間分辨率以及實(shí)時(shí)非侵入式生物過(guò)程可視化功能的強(qiáng)大工具,可用于癌細(xì)胞的早期診斷和治療等[1-4]。優(yōu)異的熒光探針必須滿足以下條件:一定的波長(zhǎng)范圍、熒光發(fā)射強(qiáng)度高、生物穩(wěn)定性好、光穩(wěn)定性能高、水溶性好、靈敏度高?;诜肿幼R(shí)別和特定的有機(jī)反應(yīng)原理,研究開(kāi)發(fā)了多種多樣的熒光探針。目前,使用廣泛并具有代表性的熒光探針類別包括有機(jī)染料[5-6]、生物熒光團(tuán)[7]、量子dots[8]等,而常被用于構(gòu)建熒光探針的染料片段包括熒光素、羅丹明、花青、BODIPY、萘酰亞胺等[9]。其中BODIPY 是受歡迎的一類熒光團(tuán)[10],在生物成像中獲得了空前的成功,但缺點(diǎn)是其在特定細(xì)胞器中的積累會(huì)引起聚集淬滅,并且該類分子的水溶性不高。酰亞胺類也是常見(jiàn)的功能性良好的熒光探針片段,尤其是萘酰亞胺,富含具有光物理性質(zhì)的結(jié)構(gòu),其吸收和熒光發(fā)射光譜位于紫外和熒光的可見(jiàn)光區(qū)域[11-12]。另外,萘酰亞胺易于修飾,可通過(guò)理性的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)輕松地微調(diào)各種光物理性質(zhì),生物相容性高。

    近幾年,在熒光探針?lè)肿釉O(shè)計(jì)方面,水溶性問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注。在生物化學(xué)的應(yīng)用研究中,特別是在細(xì)胞成像方面,由于有機(jī)溶劑會(huì)破壞生物分子的正常功能,因而探針?lè)肿恿己玫乃苄灾陵P(guān)重要。目前,水溶性差的小分子探針通常是通過(guò)包裹在水溶性基質(zhì)中進(jìn)行生物應(yīng)用,或者在分子設(shè)計(jì)中通過(guò)引入含離子鹽側(cè)鏈或與金屬離子配位來(lái)提高探針的水溶性,但這增加了制備和分離的難度。Peng 等[13]合成了DCF-MPYM 染料,該染料通過(guò)引入一個(gè)羧酸基團(tuán)來(lái)增加探針?lè)肿拥乃苄?,其在?xì)胞成像的應(yīng)用中依然被包裝在BSA 基質(zhì)中以隔絕氧氣,防止熒光淬滅。Zhang 等[14]合成了具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)功能的TCM 系列探針,為解決探針的親水性和親脂性問(wèn)題,以及防止探針在進(jìn)入細(xì)胞前聚集,他們添加了三苯基膦基團(tuán)以增加水溶性,使得探針在細(xì)胞應(yīng)用中有很好的效果。Yang 等[15]開(kāi)發(fā)了具有典型熱活化延遲熒光(TADF)和結(jié)晶誘導(dǎo)的室溫磷光(RTP)特征的新型供體-受體(D-A)熒光探針PXZT,通過(guò)PXZT 與鋅離子的配位,進(jìn)而得到水溶性的無(wú)熒光分子ZnPXZT1,分子進(jìn)入細(xì)胞后,ZnPXZT1會(huì)自動(dòng)解離釋放PXZT,由于PXZT 的疏水性會(huì)引發(fā)分子聚集進(jìn)而開(kāi)啟聚集誘導(dǎo)的TADF 發(fā)射,其熒光成像效果良好。

    本文基于螺芴骨架,通過(guò)分子內(nèi)弱相互作用連接供體和受體,設(shè)計(jì)合成了D-π-A 體系,骨架采用9,9’-螺二芴這種經(jīng)典的螺形非共平面分子,中心碳原子通過(guò)sp3雜化使得兩個(gè)芴單元互相垂直,形成十字架結(jié)構(gòu),提供有效的立體需求。這種剛性結(jié)構(gòu)不僅能夠阻止分子之間的團(tuán)聚,還能有效抑制熒光淬滅。另外探針?lè)肿拥氖荏w使用的是萘酰亞胺熒光團(tuán),其易于修飾和發(fā)光性能好的優(yōu)點(diǎn)受到很多人的青睞,但純油性分子的水溶性差,應(yīng)用于細(xì)胞成像前需要將探針?lè)肿影谒苄粤己玫幕|(zhì)中,這增加了合成的難度。為了解決探針的水溶性問(wèn)題,通常的方法是在萘酰亞胺熒光團(tuán)上引入低聚乙二醇和含離子鹽的水溶性側(cè)鏈。本文提出將萘酰亞胺基團(tuán)直接水解得到萘酸酐,一方面萘酸酐基團(tuán)的引入可以使得探針?lè)肿釉谥行院蜕硭嵝匀芤褐蝎@得足夠的水溶性,另一方面該制備方法簡(jiǎn)單,制得的萘酸酐探針?lè)肿涌扇苡谟袡C(jī)相中,有利于探針的分離純化。細(xì)胞成像測(cè)試結(jié)果表明3 個(gè)探針?lè)肿尤旧Ч己?,水溶性和生物相容性良好,有望成為癌?xì)胞可視化的強(qiáng)大工具。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 原料與試劑

    4,4’-二甲氧基二苯胺、9,9-二己基-2,7-二溴芴,購(gòu)于上海麥克林生化科技公司;氯仿、二氯甲烷、乙酸酐、硝酸、二水合氯化亞錫、乙醚、鹽酸、亞硝酸鈉、碘化鉀、無(wú)水乙醇、石油醚、碳酸鉀、二氯化鈀、四氫呋喃(THF)、氯化鈉、甲苯、乙腈、乙酸乙酯、乙酸鉀、乙酸、硫酸鈉、氯化銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉、叔丁醇(t-BuOH)、叔丁醇鉀(t-BuOK)、甲醇、1,4-二氧六環(huán)、四氟硼酸三叔丁基膦(t-Bu3PHBF4)、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯、9,9’-螺二芴,均購(gòu)于上海泰坦科技股份有限公司;[1,1’-雙(二苯基膦)二茂鐵] 二氯化鈀(Pd(dppf)Cl2)、三(二亞芐基丙酮)二鈀(Pd2(dba)3)、4-溴-1,8-萘酐、2-乙基己胺,均購(gòu)于上海阿拉丁試劑股份有限公司;三苯基膦、二甲亞砜,購(gòu)于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。以上所有試劑均為分析純。

    1.2 測(cè)試與表征

    核磁共振氫譜(1H-NMR)與核磁共振碳譜(13CNMR):分別采用瑞士布魯克公司的AVANCE Ш400 型超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振波譜儀(400 MHz)和Ascend 600 型 的 核 磁 共 振 波 譜 儀(600 MHz),在室溫下測(cè)量,以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo),以氘代氯仿(CDCl3)、氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)為溶劑。

    質(zhì) 譜(MS ) 采 用 美 國(guó)Waters 公 司 生 產(chǎn)的GCTPremier 型電子轟擊(EI)-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,測(cè)試范圍10~1 500 Da,分辨率≥7 000;ESI-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,型號(hào)為Xevo G2 TOF MS,測(cè)試范圍50~4 000 Da,分辨率≥20 000;飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采用新加坡ABS 公司生產(chǎn)4800plus,測(cè)試范圍400~500 000 Da。檢測(cè)樣品質(zhì)量大約是5 mg。

    紫外-可見(jiàn)光吸收光譜(UV-Vis):采用日本SHIMADZU 公司生產(chǎn)的型號(hào)為Cary 60 的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),樣品分別溶于二甲基亞砜、去離子水、磷酸鹽緩沖液(PBS)、不同pH 緩沖溶液中并稀釋成濃度10 μmol/L,然后在比色皿中檢測(cè),掃描范圍200~800 nm,室溫下測(cè)定。

    熒光發(fā)射光譜:采用HORIBA 高靈敏一體式熒光光譜儀,型號(hào)FluoroMax-4,激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為紫外-可見(jiàn)光吸收光譜的最大吸收波長(zhǎng),激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)為10 nm,電壓設(shè)定為530 V,樣品稀釋成濃度為10 μmol/L 后于二甲基亞砜中檢測(cè),測(cè)定溫度室溫。熒光量子效率的測(cè)定采用參比法,標(biāo)準(zhǔn)化合物為羅丹明6G,室溫下測(cè)定。

    共聚焦成像:采用德國(guó)卡爾蔡司生產(chǎn)的Laser Scanning Confocal Microscopy (Nikon A1R and TCS SP8)測(cè)試,配制探針濃度為10 μmol/L,孵育Hela 細(xì)胞30 min,進(jìn)行激光掃描測(cè)試。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 化 合 物2 和 化 合 物5 的 制 備 Buchwald-Harting(碳氮偶聯(lián))的一般反應(yīng)條件,以化合物5 的制備為例。分別稱取化合物4[16](200 mg, 0.27 mmol)和化合物1[16](200 mg,0.28 mmol)、4,4'-二甲氧基二苯胺(91.8 mg,0.40 mmol)、三(二亞芐基丙酮)二鈀(19.8 mg,0.02 mmol)、四氟硼酸三叔丁基膦(23.5 mg,0.08 mmol)和 叔 丁 醇 鉀(49.9 mg,0.45 mmol)于Schlenk 管內(nèi),抽真空充氮?dú)? 次,加入除氧重蒸過(guò)的甲苯10 mL,氮?dú)饷芊?,反?yīng)混合物在50 ℃加熱30 min,然后120 ℃回流過(guò)夜。冷卻至室溫后,將有機(jī)層分別用飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次、二氯甲烷萃取3 次,然后用無(wú)水硫酸鈉干燥。真空除去溶劑后,將粗產(chǎn)物通過(guò)柱層析純化,用石油醚和二氯甲烷(體積比9∶1)洗脫,用二氯甲烷和甲醇進(jìn)行重結(jié)晶,得到黃 色 固 體5(120 mg,產(chǎn) 率52%)和 磚 紅 色 固體2(149.3 mg,產(chǎn)率63%)。

    1.3.2 化合物8 的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[17]方法制備化合物8,所得產(chǎn)物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17] 一致。將4,4’-二甲氧基二苯胺(2.33 mg,10.16 mmol)、9,9-二己基-2,7 二溴芴(1.0 g,2.03 mmol)、叔丁醇鉀(360.1 mg,3.25 mmol)、四氟硼酸三叔丁基膦(120.5 mg,0.41 mmol)、三(二亞芐基丙酮)二鈀(99 mg,0.10 mmol)一起加入到烘干的Schlenk 管中,抽真空充氮?dú)? 次,加入重蒸過(guò)的甲苯50 mL,80 ℃下加熱攪拌22 h。然后冷卻至室溫,分別用乙酸乙酯萃取3 次、飽和氯化鈉溶液洗滌3 次,取有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥,減壓旋蒸除去溶劑得粗產(chǎn)物。通過(guò)柱層析進(jìn)一步純化,石油醚和乙酸乙酯(體積比9∶1)作為展開(kāi)劑,得到黃色固體7-溴-9,9-二己基-N,N-雙(4-甲氧基苯基)-9H 芴-2-胺(701.2 mg,產(chǎn)率54%)。

    分別稱取7-溴-9,9-二己基-N,N-雙(4-甲氧基苯基)-9H 芴-2-胺(500 mg,0.78 mmol)、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯(297.4 mg,1.17 mmol)、[1,1’-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀(44 mg,0.114 mmol)和醋酸鉀(114.6 mg,1.17 mmol),加入到烘干的100 mL Schlenk 燒瓶中,抽真空充氮?dú)? 次,加入10 mL 重蒸的1,4-二氧六環(huán),用氮?dú)饷芊?,將反?yīng)在70 ℃下攪拌回流12 h。冷卻至室溫后,用乙酸乙酯萃取3 次,用飽和氯化鈉溶液洗滌3 次,有機(jī)相用硫酸鈉干燥,并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑,留下黑色油狀物。將該油狀物通過(guò)柱層析純化,并使用乙酸乙酯與石油醚的體積比逐漸增加的展開(kāi)劑進(jìn)行淋洗,然后旋干得到黃色油狀物,乙醇重結(jié)晶,得到黃色的固體7(299.8 mg,產(chǎn)率56%)。

    分別稱取化合物7(278.5 mg,0.41 mmol),化合物4(200 mg,0.27 mmol)、四(三苯基膦)鈀(5.8 mg,0.01 mmol) 、 碳 酸 鉀( 91.2 mg, 0.66 mmol)于Schlenk 管中,抽真空充氮?dú)? 次,向反應(yīng)器中分別加入四氫呋喃10 mL 和去離子水1 mL,用氮?dú)饷芊?,將反?yīng)在65 ℃下回流過(guò)夜。冷卻至室溫后,將有機(jī)層用鹽水洗滌3 次、二氯甲烷萃取3 次,然后用無(wú)水硫酸鈉干燥。真空除去溶劑后,將粗產(chǎn)物通過(guò)柱層析進(jìn)一步純化,并使用乙酸乙酯與石油醚的體積比逐漸增加的展開(kāi)劑進(jìn)行淋洗,得到黃色固體化合物8(147 mg,產(chǎn)率46%)。

    1.3.3 探針?lè)肿拥暮铣?參考文獻(xiàn)[18]方法并進(jìn)一步改進(jìn)。水解反應(yīng)的一般步驟是:在叔丁醇(10 mL)中加入萘酰亞胺衍生物(0.80 mmol),室溫下攪拌20 min,再加入氫氧化鉀(817 mg,16.0 mmol),在氮?dú)夥諊禄亓骷訜? h,冷卻至室溫后,加入乙酸30 mL。室溫下再攪拌5 h,析出固體,過(guò)濾,柱層析純化,以石油醚和二氯甲烷(體積比2∶1)作為展開(kāi)劑得到固體,在二氯甲烷和甲醇中重結(jié)晶,得到相應(yīng)的3 個(gè)探針?lè)肿?、6、9。基于萘酸酐的這3 個(gè)探針?lè)肿右兹芙庥谟袡C(jī)溶劑,并可以在有機(jī)溶劑中分離純化,大大減少了普通水溶性熒光探針?lè)蛛x純化的難度,為設(shè)計(jì)合成水溶性熒光探針提供了新的思路。酸酐取代基由于對(duì)水溶液或生理?xiàng)l件下pH 的響應(yīng),其在中性或弱堿性條件下可轉(zhuǎn)化為帶電荷的羧酸根基團(tuán),從而使探針?lè)肿訌挠腿苄赞D(zhuǎn)化為水溶性,方便探針?lè)肿釉谏锍上穹矫娴膽?yīng)用。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 探針的結(jié)構(gòu)表征

    通過(guò)Buchwald-Harting 反應(yīng)(碳氮偶聯(lián))/Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)和水解反應(yīng)制備探針3、6、9(圖1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)由核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、質(zhì)譜等譜學(xué)技術(shù)表征。

    圖1 化合物3、6、9 的合成路線Fig. 1 Synthetic routes of compounds 3、6 and 9

    化合物2(紅色固體,54%):1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.54 (d, 1H,J= 7.2 Hz), 8.49 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 8.09 (d, 1H,J= 8.8 Hz), 7.85 (d, 1H,J= 7.6 Hz),7.73 (d, 2H,J= 7.2 Hz), 7.68 (d, 1H,J= 8.4 Hz),7.56~7.52 (m, 2H), 7.46 (dd, 1H,J= 7.8, 1.0 Hz), 7.33(t, 2H,J= 7.4 Hz), 7.16 (t, 2H,J= 7.4 Hz), 6.90 (d, 7H,J= 8.4 Hz), 6.75 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 6.69 (d, 4H,J= 8.8 Hz), 6.47 (d, 1H,J= 1.6 Hz), 4.15~4.05 (m, 2H), 3.74 (s,6H), 1.94~1.89 (m, 1H), 1.37~1.27 (m, 8H), 0.91 (t, 3H,J= 7.4 Hz), 0.85 (t, 3H,J= 6.8 Hz);13C-NMR (151 MHz, CDCl3,δ) : 164.9, 164.7, 155.8, 150.5, 149.7,149.3, 148.8, 147.1, 142.4, 141.9, 141.0, 136.9, 134.0,132.8, 131.3, 130.9, 130.1, 129.9, 128.9, 127.94, 127.91,127.9, 126.8, 126.2, 125.5, 124.1, 123.0, 121.5, 121.2,121.0, 120.4, 119.2, 116.8, 114.7, 66.2, 55.6, 44.3, 38.1,31.0, 28.9, 24.3, 23.3, 14.3, 10.9;MS (EI) calcd. for C59H50N2O4: 850.4 (m/z), found 850.4 (m/z)。

    化合物3(紅色固體,83%):1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.56 (dd, 1H,J= 7.2, 0.4 Hz), 8.51 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 8.20 (dd, 1H,J= 8.6, 0.6 Hz), 7.86 (d, 1H,J= 8.0 Hz), 7.74 (d, 2H,J= 7.6 Hz), 7.69 (d, 1H,J= 8.4 Hz), 7.61~7.57 (m, 2H), 7.45 (dd, 1H,J= 8.0, 1.6 Hz),7.34 (td, 2H,J= 7.5, 0.7 Hz), 7.17 (td, 2H,J= 7.6, 0.8 Hz), 6.93~6.89 (m, 7H), 6.75 (d, 1H,J= 0.8 Hz),6.71~6.67 (m, 4H), 6.47 (d, 1H,J= 2.0 Hz), 3.74 (s,6H);13C- NMR (151 MHz, CDCl3,δ): 161.0, 160.8,155.9, 150.6, 149.9, 149.5, 148.8, 148.6, 142.9, 141.9,140.9, 136.0, 134.4, 133.7, 133.4, 133.1, 131.1, 130.4,129.8, 128.4, 128.01, 128.0, 127.2, 126.3, 125.4, 124.0,121.08, 121.06, 120.4, 119.4, 119.0, 117.3, 116.6, 114.7,66.1, 55.6;MS (EI) calcd. for C51H33NO5:739.2 (m/z),found 739.2 (m/z)。

    化合物5(黃色固體,46%):1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.59 (dd, 1H,J= 7.4, 0.6 Hz), 8.56 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 8.14 (dd, 1H,J= 8.4, 0.8 Hz), 7.92 (d, 1H,J= 8.0 Hz), 7.85 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.68 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.64 (t, 1H,J= 8.0 Hz), 7.59 (dd, 2H,J= 8.0, 1.6 Hz), 7.48 (dd, 1H,J= 8.0, 1.6 Hz), 7.39 (td, 1H,J= 7.5,0.9 Hz), 7.31 (td, 1H,J= 7.6, 0.8 Hz), 7.19 (td, 1H,J=7.5, 0.9 Hz), 7.04 (td, 1H,J= 7.6, 0.8 Hz), 7.93 (d, 1H,J= 1.2 Hz), 6.90~6.85 (m, 6H), 6.73 (d, 1H,J= 7.6 Hz),6.67 (dd, 4H,J= 6.8, 2.4 Hz), 6.54 (d, 1H,J= 2.0 Hz),4.18~4.08 (m, 2H), 3.73 (s, 6H), 1.98~1.92 (m, 1H),1.41~1.29 (m, 8H), 0.93 (t, 3H,J= 7.4 Hz), 0.87 (t, 3H,J= 7.0 Hz);13C-NMR (151 MHz, CDCl3,δ): 164.9,164.7, 155.8, 150.5, 149.7, 149.3, 148.8, 147.1, 142.4,141.9, 141.0, 136.9, 134.0, 132.8, 131.3, 130.9, 130.1,129.9, 128.9, 127.94, 127.91, 127.9, 126.8, 126.2, 125.5,124.0, 123.0, 121.5, 121.2, 121.0, 120.4, 119.2, 116.8,114.7, 66.2, 55.6, 44.3, 38.1, 31.0, 28.9, 24.3, 23.3, 14.3,10.9;MS (EI) calcd. for C59H50N2O4: 850.4 (m/z), found 850.4 (m/z)。

    化合物6(亮 黃 色固體,73%):1H-NMR (400 MHz, CDCl3,δ): 8.61 (dd, 1H,J= 7.6, 0.8 Hz), 8.58 (d,1H,J= 7.6 Hz), 8.25 (dd, 1H,J= 8.4, 0.8 Hz),7.94 (d,1H,J= 8.0 Hz), 7.85 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.69~7.58 (m,5H), 7.47 (dd, 1H,J= 8.0, 1.6 Hz),7.40 (td, 1H,J= 7.4,0.8 Hz),7.31 (td, 1H,J= 7.4, 0.6 Hz), 7.20 (td, 1H,J=7.6, 0.8 Hz), 7.05 (td, 1H,J= 7.4, 0.8 Hz), 6.94 (d, 1H,J= 1.6 Hz), 6.91~6.85 (m, 6H), 6.73 (d, 1H,J= 7.2 Hz),6.69~6.65 (m, 4H), 6.53 (d, 1H,J= 2.0 Hz), 3,73 (s,6H);13C- NMR (151 MHz, CDCl3,δ) : 161.0, 160.7,155.7, 150.2, 149.6, 149.5, 148.8, 148.8, 148.2, 142.8,141.9, 141.2, 140.8, 137.4, 135.2, 134.2, 133.5, 133.13,131.10, 130.5, 129.7, 128.7, 128.4, 128.1, 127.4, 126.9,125.9, 125.4, 124.4, 123.9, 121.8, 120.8, 120.7, 120.5,119.5, 119.1, 117.6, 117.1, 114.7, 66.2, 55.7;MS (EI)calcd. for C51H33NO5: 739.2 (m/z), found 739.2 (m/z)。

    化合物8(黃色固體,52%):1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.52 (d, 2H,J= 6.8 Hz), 8.10 (d, 1H,J= 8.4 Hz), 8.04 (d, 1H,J= 6.4 Hz), 7.97 (d, 1H,J= 6.0 Hz),7.89 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.84 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.67(d, 1H,J= 8.4 Hz), 7.59 (d, 1H,J= 6.4 Hz), 7.56~7.51(m, 2H), 7.48~7.37 (m, 5H), 7.34~7.11(m, 4H),7.05~7.04 (m, 4H), 6.95~6.87(m, 4H), 6.86~6.80 (m,5H), 4.17~4.03 (m, 2H), 3.79 (s, 6H), 1.92~1.77 (m, 5H),1.37~1.26 (m, 8H), 1.10~1.00 (m, 12H), 0.92~0.85 (m,6H), 0.76~0.75 (m, 6H), 0.64~0.60 (m, 4H);13C-NMR(101 MHz, CDCl3,δ): 164.8, 164.7, 155.6, 152.4, 151.3,149.9, 149.4, 149.1, 149.0, 148.4, 146.8, 142.4, 141.9,141.7, 141.3, 141.0, 140.8, 138.6, 138.4, 134.2, 132.6,131.3, 130.9, 130.1, 130.0, 128.9, 128.7, 128.2, 128.0,127.4, 126.9, 126.0, 124.6, 124.1, 123.0, 122.6, 121.8,121.2, 120.9, 120.6, 120.3, 119.0, 116.7, 114.8, 66.4,55.7, 55.2, 44.4, 40.4, 38.1, 31.6, 31.0, 29.8, 28.9, 24.3,23.9, 23.2, 22.7, 14.3, 14.2, 10.9;MS (ESI) calcd. for C84H82N2O4: 1 182.6 [M]+, found 1 183.6[M+H+]。

    化合物9(黃色固體,79%):1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.55 (d, 1H,J= 4.0 Hz), 8.53 (d, 1H,J= 4.8 Hz), 8.21 (d, 1H,J= 8.8 Hz), 8.05 (d, 1H,J= 8.0 Hz),7.97 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.89 (d, 1H,J= 8.0 Hz), 7.85(d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.69~7.64 (m, 2H), 7.58~7.53 (m,2H), 7.50~7.32 (m, 6H), 7.23 (t, 1H,J= 7.8 Hz), 7.15 (t,1H,J= 7.8 Hz), 7.11~7.03 (m, 5H), 6.95~6.88 (m, 4H),6.84~6.80 (m, 5H), 3.80 (s, 6H), 1.84~1.77 (m, 4H),1.10~1.00 (m, 12H), 0.77~0.73 (m, 6H), 0.65~0.60 (m,4H);13C- NMR (101 MHz, CDCl3,δ): 161.0, 160.7,155.7, 152.4, 151.4, 150.2, 149.4, 149.0, 148.8, 148.6,148.4, 142.9, 141.9, 141.7, 141.1, 141.0, 140.9, 138.5,137.6, 134.3, 134.1, 133.5, 133.1, 131.0, 130.4, 130.0,128.9, 128.5, 128.32, 128.3, 128.0, 127.4, 127.3, 126.1,125.8, 124.7, 124.1, 122.5, 121.2, 120.9, 120.71, 120.7,120.5, 120.4, 120.3, 119.0, 117.6, 116.7, 114.8, 66.4,55.7, 55.2, 40.4, 31.6, 29.8, 23.9, 22.7, 14.2;MS (Maldi Tof)calcd. for C76H65NO5: 1 071.5 (m/z), found 1 071.5 (m/z)。

    2.2 光物理性能表征

    2.2.1 紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光發(fā)射光譜 首先比較探針?lè)肿?、6、9 在二甲基亞砜中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜,如圖2(a)所示??梢?jiàn)探針?lè)肿? 在351 nm處的強(qiáng)譜帶歸因于其π-π 共軛骨架的吸收,400~500 nm 處較長(zhǎng)的寬吸收帶是由于電子給體的4,4'-二甲氧基二苯氨基單元和電子受體的萘酸酐單元之間的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)躍遷的結(jié)果?;诜肿觾?nèi)電荷轉(zhuǎn)移類型的躍遷,探針的熒光發(fā)射性質(zhì)對(duì)溶劑極性非常敏感[16]。因此對(duì)于探針?lè)肿?,采取本共軛(HOMO-conjugation)的方式將電子給體和電子受體進(jìn)行鍵連,其吸收峰值明顯藍(lán)移至356 nm,這一吸收帶應(yīng)該是由4,4'-二甲氧基二苯氨基螺芴的π-π*躍遷引起。因此,在探針6 的4,4'-二甲氧基二苯氨基和螺芴片段中,插入一個(gè)芴的結(jié)構(gòu),能明顯使吸收峰發(fā)生紅移。探針?lè)肿? 的吸收峰值紅移至382 nm,更加有利于細(xì)胞成像中的光激發(fā)(激發(fā)波長(zhǎng)404 nm)。探針?lè)肿?、6、9 在二甲基亞砜稀溶液中的熒光發(fā)射光譜如圖2(b)所示,最大發(fā)射峰依次為3 (519 nm),6(440 nm)和9(504 nm),峰值的變化趨勢(shì)與3 個(gè)探針?lè)肿拥淖贤?可見(jiàn)吸收光譜相吻合。進(jìn)一步測(cè)定并計(jì)算了探針?lè)肿?、6、9 的熒光量子產(chǎn)率(Φ),分別是0.51,0.07,0.23(表1)。探針?lè)肿? 是探針?lè)肿? 的改進(jìn),可見(jiàn)其發(fā)射峰值的位置和熒光量子產(chǎn)率明顯增加,有利于探針?lè)肿釉诩?xì)胞成像中的應(yīng)用。

    表1 化合物3、6、9 在二甲基亞砜中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的表征數(shù)據(jù)Table 1 UV-vis absorption and fluorescence emission characterization data of compounds 3, 6, 9 in dimethyl sulfoxide

    圖2 化合物3、6、9 在二甲基亞砜中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)Fig. 2 UV-vis absorption spectra (a) and fluorescence emission spectra (b) of compounds 3, 6, 9 in dimethyl sulfoxide

    2.2.2 探針的水溶性測(cè)試 由于酸酐基團(tuán)與堿作用可轉(zhuǎn)化為羧酸根,因此酸酐基團(tuán)為探針?lè)肿釉谏項(xiàng)l件下的水溶性提供了重要的作用。為了探索探針?lè)肿有螒B(tài)與水溶液酸堿性之間的關(guān)系。以探針?lè)肿? 為例,測(cè)試了其在不同pH 下的紫外-可見(jiàn)吸收光譜(圖3(a))。隨著溶液堿性的不斷增加,光譜最大吸收波長(zhǎng)處的吸收強(qiáng)度隨之增強(qiáng)。將365 nm 處的吸光度和472 nm 處的吸光度比值(A365/A472)對(duì)pH 值作圖(圖3(b)),可以看出,比值隨pH 增大而單調(diào)上升,表明分子中的酸酐官能團(tuán)逐漸與溶液中氫氧根負(fù)離子作用,轉(zhuǎn)變?yōu)轸人?羧酸根結(jié)構(gòu)和雙羧酸根結(jié)構(gòu)。由于這種轉(zhuǎn)變探針?lè)肿訋狭穗姾?,其在中性或生理酸性水溶液中的溶解能力得到了提高。生理?xiàng)l件(PBS 緩沖溶液,pH 約為7.4)下,溶液呈中性或偏弱堿性,此時(shí)酸酐基團(tuán)已經(jīng)向羧酸根進(jìn)行轉(zhuǎn)化,使得這類探針?lè)肿幼兊盟埽⒖捎糜谏項(xiàng)l件下的細(xì)胞成像。

    為了進(jìn)一步了解探針?lè)肿?、6、9 在水中和生理緩沖溶液(pH 約為7.4)中的吸收情況,考察了他們的紫外-可見(jiàn)吸收?qǐng)D譜(歸一化處理),結(jié)果分別如圖3(c)和(d)所示。與圖2 探針?lè)肿?、6、9 在二甲基亞砜中的吸收曲線進(jìn)行比較,可見(jiàn)3 個(gè)探針?lè)肿拥奈展庾V沒(méi)有明顯的變化,這說(shuō)明其水溶性皆良好,但3 個(gè)探針?lè)肿咏杂凶畲笪詹ㄩL(zhǎng)和起峰紅移現(xiàn)象,這是因?yàn)榕c二甲基亞砜相比,溶劑極性增大,探針?lè)肿拥募ぐl(fā)態(tài)受影響,從而使其能量強(qiáng)度降低。比較圖3(c)和3(d)可以看出,探針?lè)肿? 的水溶性隨著溶液堿性的增加而明顯增加,表明酸酐基團(tuán)對(duì)探針?lè)肿铀苄缘奶岣咂鸬搅酥匾饔谩?/p>

    圖3 (a)化合物3 在不同pH 下的紫外-可見(jiàn)吸收曲線;(b)化合物3 在不同pH 下A365/A472 的比值;化合物3、6、9 在水中(c)和在PBS 緩沖溶液中(d)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig. 3 (a) UV-Vis absorption spectra of compound 3 at different pH; (b)A365 / A472 ratio at different pH of compound 3; Normalized UV-Vis absorption spectra of compound 3, 6, 9 in water (c) and in PBS buffer solution (d)

    2.2.3 共聚焦成像 為了探索基于3 個(gè)探針?lè)肿拥目梢暬┘?xì)胞的可行性,進(jìn)行了Hela 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。將Hela 細(xì)胞與3、6、9 3 個(gè)探針(10 μmol/L)在37 ℃、CO2/空氣(體積比5∶95)的條件下孵育30 min,隨后用PBS 溶液將細(xì)胞沖洗3 次,進(jìn)行共聚焦成像實(shí)驗(yàn),其中激發(fā)波長(zhǎng)λex= 404 nm。如圖4 所示,3 個(gè)探針皆成功染色,其中探針3 和9 孵育的Hela 細(xì)胞在綠色通道中顯示了較強(qiáng)的熒光,探針6 孵育的細(xì)胞顯示了相對(duì)較弱的熒光,3 個(gè)探針的成像均背景信號(hào)干擾小,信噪比高。探針9 的熒光強(qiáng)度和成像效果高于探針6,這說(shuō)明結(jié)構(gòu)的改進(jìn)達(dá)到了良好的效果。3 個(gè)探針中,探針3 的成像效果最好,熒光強(qiáng)度最高,這是因?yàn)槠涔曹椥粤己?,熒光發(fā)射波長(zhǎng)最長(zhǎng)??傊?,細(xì)胞成像結(jié)果表明設(shè)計(jì)合成的3 個(gè)探針均可以作為靶向癌細(xì)胞成像的有前途的工具。

    圖4 化合物3、6、9 對(duì)Hela 細(xì)胞的共聚焦成像Fig. 4 Confocal imaging of Hela cells with compound 3, 6 and 9

    3 結(jié)論與展望

    本文成功設(shè)計(jì)并合成了以螺芴為骨架基于萘酸酐基團(tuán)的3 個(gè)水溶性良好的探針?lè)肿?,6,9,這是通過(guò)簡(jiǎn)單有效的化學(xué)修飾手段,將普通有機(jī)油溶性染料轉(zhuǎn)變成了水溶性良好的探針,為設(shè)計(jì)合成水溶性熒光探針提供了新思路。通過(guò)一系列光物理測(cè)試,發(fā)現(xiàn)隨著溶劑堿性的增加,分子中的酸酐官能團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轸人?羧酸根結(jié)構(gòu)和雙羧酸根結(jié)構(gòu),進(jìn)一步提高了探針?lè)肿釉谥行曰蛏硭嵝韵滤芤褐腥芙獾哪芰Γ固结樉哂辛肆己玫乃苄砸岳诩?xì)胞成像。共聚焦細(xì)胞成像中,3 個(gè)探針?lè)肿咏猿晒θ旧?,背景信?hào)干擾小,信噪比高,其中探針?lè)肿? 的成像效果最好,熒光強(qiáng)度最高,可作為靶向癌細(xì)胞成像的有前途的工具。本文的結(jié)果對(duì)于設(shè)計(jì)合成基于萘酸酐基團(tuán)水溶性熒光探針提供了重要的參考意義。

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