生姜天然產物的提取及其對茶輪斑病的室內毒力強度

饒家瑞， 張 欣， 余用秀

(1.貴州省茶葉研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州省生物技術研究所， 貴州 貴陽 550006)

中國是茶葉生產第一大國，也是茶葉出口第二大國，但近年隨著國外對茶葉進口農藥最大殘留限定標準的提高，致使每年損失數(shù)億美元[1]；在農藥殘留限量標準中絕大部分是化學農藥[2]。因此，為使茶葉農藥殘留標準符合最大殘留限定、減少茶葉病害防控中化學農藥的施用，利用植物次生代謝產物進行茶葉病害防控，保障茶葉綠色安全生產具有重要的意義。植物中蘊含的天然產物種類繁多[3]，而生姜作為常見的烹飪調料植物，富含酚類、萜類、生物堿類和黃酮類等眾多植物次生代謝產物，具有增強免疫力、抗氧化和抑菌等生物活性[4-5]。有研究表明，生姜精油對病菌有一定的抑制作用，如對枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)分別為2.3 μg/mL和4.6 μg/mL、9.2 μg/mL和18.4 μg/mL[6]；對腐皮鐮刀菌、油菜菌核病菌和立枯絲核菌的IC50分別為396.39 mg/L、439.73 mg/L和146.83 mg/L[7]；10-姜酚對乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞用藥72 h后表現(xiàn)出最佳的抑制作用，其IC50分別為25.80 μmol/L和35.29 μmol/L[8]；生姜提取物∶檸檬酸=1.22∶1對金黃色葡萄球菌和啤酒酵母的抑菌活性分別為15 mg/mL和8 mg/mL[9]。為篩選出對茶樹茶輪斑病病害防控有效的植物源農藥，減少茶園化學農藥施用量，實現(xiàn)茶葉綠色環(huán)保安全生產，筆者采用有機溶劑浸提和超聲波輔助方法[10-11]，提取生姜中蘊含的天然產物，并利用菌絲生長速率法測試生姜提取天然產物對茶輪斑病病原菌(Pestalotiopsistrachicarpicola)的室內毒力強度，以期利用生姜天然提取物防治茶輪斑病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶輪斑病病原菌 病原菌為2020年7月張欣等[12]從貴州省銅仁市石阡縣采集，經分離、形態(tài)學鑒定、DNA比對和致病性鑒定為茶輪斑病病原菌(Pestalotiopsistrachicarpicola)，由貴州省生物技術研究所提供。

1.1.2 藥劑 二氯甲烷、乙酸乙酯，購于天津市富宇精細化工有限公司；甲醇，購于上海麥克林生化科技有限公司；乙醇，購于天津市致遠化學試劑有限公司；土豆培養(yǎng)基(PDA)，購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；二甲基亞砜，購于上海阿拉丁生化股份有限公司；吐溫80，購于天津市大茂化學試劑廠；其他試劑，購于上海安耐吉化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器 德意生超聲波清洗機(深圳市華策科技有限公司)，超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，電熱鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)，電子天平(型號：BSA224S-CW)，恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，高溫蒸汽滅菌鍋(上海沉匯儀器有限公司)，研缽80 mm(河北鼎盛隆華實驗儀器有限公司)，旋轉蒸發(fā)儀(德國IKA)，BHC-1300II A/B3生物潔凈安全柜，Mill-Q型超純水制備儀，20～200 μL、100～1 000 μL和1～5 mL移液槍等。

1.2 方法

1.2.1 生姜天然產物提取 將凱里生姜去皮洗凈，分別在電子天平上稱量30 g，共4組。將每組生姜切成小塊放入研缽中反復研磨，參照有機溶劑浸提法[10]和超聲波輔助提取法[11]，分別在4組研磨后的生姜中加入二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇，置于超聲波清洗儀中以30℃超聲10 min。用濾紙過濾提取液，再將過濾液分別裝入100 mL圓底燒瓶中旋轉蒸餾除去溶劑，得到生姜提取天然產物。

1.2.2 提取天然產物的抑菌活性試驗

1) 培養(yǎng)基配制。將3 L超凈水注入5 L燒杯中，加入土豆培養(yǎng)基120 g、瓊脂 40 g，并用玻璃棒攪拌均勻。在攪拌狀態(tài)下將配置的培養(yǎng)基以每瓶45 mL倒入100 mL錐形瓶中并封口，在121℃條件下高壓滅菌20 min，冷卻后備用。

2) 藥液配制。按1 mg天然產物使用20 μL二甲基亞砜溶解的比例，將提取的天然產物配成溶液置于2 mL離心管中備用[處理1：二氯甲烷提取天然產物；處理2：乙酸乙酯提取天然產物；處理3：甲醇提取天然產物；處理4：乙醇提取天然產物；處理5(CK1)：陽性對照藥劑春雷霉素；處理6(CK2)：空白對照，等量滅菌吐溫水]。在紫外滅菌30 min以上的超凈工作臺上，將200 μL吐溫80加入200 mL滅菌水中攪拌均勻，按照每種天然產物5個濃度梯度對應5只10 mL離心管進行配藥。每只10 mL離心管中依次加入0.8 mL吐溫水、200 μL對應天然產物配置液和4 mL吐溫水。將配置好的5 mL藥液倒入PDA培養(yǎng)基中混勻(使50 mL含藥液培養(yǎng)基的最終濃度為200 μg/mL)，再平均倒入3個培養(yǎng)皿中冷卻備用。

3) 真菌接種。提前用75%酒精擦拭超凈工作臺消毒，打開紫外燈30 min以上。將提前活化好的茶輪斑病病原菌(Pestalotiopsistrachicarpicola)置于消毒后的超凈工作臺上，用打孔器在其邊緣打孔并制成直徑為4.0 mm的菌餅。再用無菌接種針將菌餅移置到含有藥液的培養(yǎng)皿中央，每處理重復3次。最后，將接種后的培養(yǎng)皿置于25℃、80%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。待空白對照組菌絲長至6.0 cm左右時，采用十字交叉法測量生長菌絲的菌餅直徑，并計算抑制率(I)。

I=[(C-T)/(C-0.4)]×100%

式中，C為空白對照菌餅直徑，T為藥物處理菌餅直徑。

1.2.3 提取天然產物抗茶輪斑病的毒力測定 根據(jù)生姜提取天然產物在200 μg/mL濃度下對茶輪斑病的初篩抑制率，選擇處理1的濃度梯度為400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL；處理2的濃度梯度為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL和12.5 μg/mL；處理3和處理4的濃度梯度為1 600 μg/mL、800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL和100 μg/mL，進行4組天然產物的EC50測定。另設陽性對照組處理5(CK1，藥物為春雷霉素)、空白對照組處理6(CK2，等量滅菌吐溫水)。每處理重復3次。利用菌絲生長速率法測定生姜提取天然產物的抑菌活性，采用十字交叉法測量生長菌絲的菌餅直徑，并計算抑制率，取濃度對數(shù)與抑制率做線性回歸方程，從而計算得出EC50。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010和DPS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 生姜提取天然產物的產率

從表1可知，生姜提取天然產物的產率依次為乙醇>甲醇>二氯甲烷>乙酸乙酯，其產率分別為4.13%、2.62%、0.71%和0.45%。甲醇和乙醇提取物質以親水性的酚類、醛類和萜類等為主，二氯甲烷和乙酸乙酯提取物質以親脂性的黃酮類、生物堿等為主。

表1 4種溶劑提取生姜天然產物的產率

2.2 不同處理茶輪斑病病原菌的抑制率

從表2可知，在200 μg/mL濃度下4種溶劑提取生姜天然產物對茶輪斑病病原菌的抑制率以處理2最高，為56.67%，較CK1高26.37百分點；處理1其次，為43.33%，較CK1高13.03百分點；處理1、處理2均與CK1間差異極顯著。處理3和處理4的抑制率分別為19.09%和12.73%，分別比CK1少11.21百分點他17.57百分點。說明，二氯甲烷和乙酸乙酯親脂性溶劑提取生姜天然產物的活性優(yōu)于甲醇和乙醇溶劑提取。

表2 不同處理茶輪斑病病原菌的抑制率

2.3 不同處理濃度茶輪斑病病原菌的抑制率與EC50

2.3.1 抑制率 從表3看出，在200 μg/mL和100 μg/mL濃度下，4種溶劑提取生姜天然產物對茶輪斑病病原菌的抑制率均以處理2最高，抑制率分別為57.44%和38.39%，分別比同濃度下的處理1、處理3、處理4高5.65百分點和2.08百分點、37.20百分點和30.35百分點、43.15百分點和33.93百分點。4種溶劑提取生姜天然產物對茶輪斑病病原菌的抑制率隨濃度下降而降低，且各濃度間差異均達極顯著。

表3 不同處理及濃度下茶輪斑病病原菌的抑制率

2.3.2EC50從表4可知，4種溶劑提取生姜天然產物對茶輪斑病的毒力方程的相關系數(shù)(R2)均大于0.95，表明4種溶劑提取生姜天然產物的濃度與抑制率間均存在良好的線性關系。處理1～處理4的EC50分別為179.89 μg/mL、150.46 μg/mL、713.24 μg/mL和742.60 μg/mL。其中，處理1、處理2的EC50分別比CK1減少用藥量190.58 μg/mL和220.01 μg/mL。說明，乙酸乙酯溶劑提取生姜天然產物的毒力強度最大，二氯甲烷溶劑其次，且兩者抗茶輪斑病的效果均優(yōu)于陽性對照藥劑春雷霉素。

表4 不同處理茶輪斑病病原菌的毒力回歸方程及EC50

3 結論

1) 用4種不同有機溶劑從凱里生姜中浸提天然產物的產率依次為乙醇>甲醇>二氯甲烷>乙酸乙酯，產率分別為4.13%、2.62%、0.71%和0.45%。

2) 抑菌活性試驗結果表明，在200 μg/mL濃度下，4種溶劑提取生姜天然產物對茶輪斑病病原菌的抑制率以乙酸乙酯溶劑最高，為56.67%，較對照藥劑春雷霉素增加26.37百分點；二氯甲烷溶劑其次，為43.33%，較對照藥劑春雷霉素增加13.03百分點；二氯甲烷溶劑和乙酸乙酯溶劑提取生姜天然產物對茶輪斑病的抑菌活性均極顯著高于對照藥劑春雷霉素。

3) 毒力強度試驗結果表明，在不同濃度下，4種溶劑提取生姜天然產物對茶輪斑病病原菌的抑制率均隨濃度下降而降低，且各濃度間差異均達極顯著。二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇4種溶劑提取生姜天然產物的EC50分別為179.89 μg/mL、150.46 μg/mL、713.24 μg/mL和742.60 μg/mL，且二氯甲烷、乙酸乙酯溶劑提取生姜天然產物的EC50分別比對照藥劑春雷霉素的EC50(370.47 μg/mL)小190.58 μg/mL和220.01 μg/mL，即乙酸乙酯溶劑提取生姜天然產物的毒力強度最大，二氯甲烷溶劑其次，且兩者抗茶輪斑病的效果均優(yōu)于陽性對照藥劑春雷霉素。