谷精草與兩種混淆品的鑒別及其中槲皮素含量的測(cè)定

劉 燕，金 卓

（1.無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214000 ；2.江蘇省無(wú)錫藥品檢驗(yàn)所，江蘇 無(wú)錫 214028）

《中國(guó)藥典》2015 年版收載的谷精草為谷精草科植物谷精草的干燥帶花莖的頭狀花序[1]，而我國(guó)南方地區(qū)常以其同科屬植物華南谷精草和毛谷精草的干燥頭狀花序入藥。這兩種谷精草的混淆品多被稱(chēng)為“谷精珠”。谷精草、華南谷精草和毛谷精草均具有疏散風(fēng)熱，退翳明目的功效。谷精草在《開(kāi)寶本草》中被首次記載[2]。明代《本草綱目》[3]中也有關(guān)于谷精草的記載。谷精草屬植物較多，但其花序較小，因此鑒別起來(lái)較為困難。近年來(lái)有學(xué)者[4-9]對(duì)谷精草類(lèi)中藥材進(jìn)行了外觀性狀的研究。華南谷精草和毛谷精草作為谷精珠均收錄在《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2010 年版）》和《湖北省中藥飲片炮制規(guī)范（2009 年版）》中。華南谷精草和毛谷精草屬于近緣，二者同為大型的谷精草，在性狀上極為相似。我國(guó)中藥市場(chǎng)上時(shí)常會(huì)出現(xiàn)三種谷精草混用的情況。目前我國(guó)現(xiàn)有的文獻(xiàn)僅對(duì)谷精草的性狀進(jìn)行了描述，很少有關(guān)于三種谷精草色譜行為等方面的報(bào)道。本文主要是對(duì)這三種谷精草進(jìn)行鑒別，并比較三種谷精草中槲皮素的含量。

1 材料、試劑及儀器

谷精草樣品，編號(hào)為YP-1、YP-2、YP-3 ；華南谷精草樣品，編號(hào)為YP-4、YP-5、YP-6 ；毛谷精草樣品，編號(hào)為YP-7、YP-8、YP-9。甲醇為色譜純，乙醇、甲苯、丙酮、磷酸、鹽酸為分析純，水為蒸餾水。梅特勒電子天平XS205，卡瑪薄層自動(dòng)點(diǎn)樣儀，Agilent1260 高效液相色譜儀，Cary100 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別方法

采用薄層色譜法和紫外光譜法對(duì)三種谷精草進(jìn)行鑒別。

2.2 薄層色譜法

分別取三種谷精草樣品粉末各1g，加入乙醇30mL，進(jìn)行30 min的超聲處理，濾過(guò)后將濾液蒸干，在殘?jiān)屑?mL的乙醇使之溶解，即制得供試品溶液。按照《中國(guó)藥典》2015 年版四部通則0502 中的相關(guān)規(guī)定對(duì)供試品溶液進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)，方法是：吸取上述三種谷精草供試品溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-丙酮（10:0.6）為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出后晾干，置于紫外光燈（波長(zhǎng)為365nm）下檢視。檢測(cè)的結(jié)果顯示，谷精草與華南谷精草的薄層色譜行為比較相似，兩者與毛谷精草的薄層色譜行為存在明顯差異。詳見(jiàn)圖1。

圖1 三種谷精草的薄層色譜圖

2.3 紫外光譜法

取谷精草粉末1g，加入30 mL的乙醇，進(jìn)行30 min的超聲處理，濾過(guò)后將濾液蒸干，在殘?jiān)屑尤胍掖际怪芙?。將溶液轉(zhuǎn)移至100mL的量瓶中，加入乙醇定容至刻度，搖勻，即制得供試品溶液。取華南谷精草粉末3g，加入30 mL的乙醇，進(jìn)行30 min的超聲處理，濾過(guò)后將濾液蒸干，在殘?jiān)屑尤胍掖际怪芙?。將溶液轉(zhuǎn)移至100mL的量瓶中，加入乙醇定容至刻度，搖勻，即制得供試品溶液。取毛谷精草粉末0.3g，加入30 mL的乙醇，進(jìn)行30 min的超聲處理，濾過(guò)后將濾液蒸干，在殘?jiān)屑尤胍掖际怪芙?。將溶液轉(zhuǎn)移至100mL的量瓶中，加入乙醇定容至刻度，搖勻，即制得供試品溶液。采用紫外光譜法在波長(zhǎng)為220～450nm的范圍內(nèi)掃描三種供試品溶液，得到其紫外吸收光譜。結(jié)果顯示，谷精草在330.00nm和261.00nm 波長(zhǎng)處出現(xiàn)最大吸收峰，華南谷精草在279.00nm 波長(zhǎng)處出現(xiàn)最大吸收峰，毛谷精草在272.00nm和332.00 nm 波長(zhǎng)處出現(xiàn)最大吸收峰（詳見(jiàn)圖2、圖3和圖4）。這說(shuō)明，采用紫外光譜法可有效地區(qū)分鑒別三種谷精草。

圖2 谷精草的紫外光譜圖

圖3 華南谷精草的紫外光譜圖

圖4 毛谷精草的紫外光譜圖

2.4 三種谷精草中槲皮素含量的測(cè)定

2.4.1 色譜條件色譜柱：C18，流動(dòng)相：甲醇-0.4% 磷酸溶液（50:50），流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm，進(jìn)樣量：10μL。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取槲皮素對(duì)照品3mg，置于100mL的量瓶中，加入甲醇-25% 鹽酸溶液（4:1）的混合溶液進(jìn)行溶解并定容至刻度，搖勻，即制得對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備精密稱(chēng)取三種谷精草樣品粉末各2g，分別置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25mL，密塞后進(jìn)行20 min的超聲處理（功率為250W，頻率為33kHz），放冷后搖勻，進(jìn)行濾過(guò)處理。精密量取續(xù)濾液10mL，置于100mL的錐形瓶中，加入甲醇10 mL、25%的鹽酸溶液5mL，搖勻后置于水浴中加熱回流30 min。迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL的量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻后進(jìn)行濾過(guò)處理，取續(xù)濾液，即制得供試品溶液。

2.4.4 方法學(xué)考察 1）線性關(guān)系考察。分別取槲皮素對(duì)照品溶液1mL、2mL、5mL、10mL、25mL，置于25mL的量瓶中，加入甲醇-25% 鹽酸溶液（4:1）的混合溶液定容至刻度，搖勻，制得對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀中，記錄其峰面積。以對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程為y=42.873x-0.2445，r=0.9998。這表明，槲皮素在1.2～30μg/mL 范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系；在選定條件下，槲皮素的最低檢出濃度為0.84μg/mL。2）重復(fù)性試驗(yàn)。分別取同一批的谷精草樣品（YP-1）各2g，制成5 份供試品溶液，采用高效液相色譜法測(cè)定其中槲皮素的含量。結(jié)果表明，5 份供試品溶液中槲皮素的平均含量為20.6μg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.96%。3）回收率試驗(yàn)。采取加樣回收法，取已知含量的同一批次的谷精草樣品（YP-1）1 g，共取6 份，分別加入槲皮素對(duì)照品溶液（濃度為30μg/mL）0.7mL，按“2.6.3”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液10μL，注入液相色譜儀中進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算平均回收率和RSD。結(jié)果顯示，供試品溶液中槲皮素的平均回收率為98.14%，RSD 為1.56%。

2.4.5 三種谷精草中槲皮素的含量分別取三種谷精草粉末2g，按“2.6.3”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，注入液相色譜儀中測(cè)定其中槲皮素的含量。結(jié)果顯示，毛谷精草中槲皮素的含量高于谷精草和華南谷精草，谷精草中槲皮素的含量高于華南谷精草。三種谷精草中槲皮素含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。槲皮素對(duì)照品及三種谷精草中槲皮素含量的高效液相色譜圖見(jiàn)圖5～圖8。

圖8 毛谷精草中槲皮素含量的高效液相色譜圖

表1 三種谷精草中槲皮素含量的測(cè)定結(jié)果（μg/g）

圖5 槲皮素對(duì)照品中槲皮素含量的高效液相色譜圖

圖6 谷精草中槲皮素含量的高效液相色譜圖

圖7 華南谷精草中槲皮素含量的高效液相色譜圖

3 討論

華南谷精草和毛谷精草并非《中國(guó)藥典》中規(guī)定的谷精草來(lái)源，但在中藥市場(chǎng)上仍有將二者作為谷精草銷(xiāo)售的情況。本研究結(jié)果可作為區(qū)別谷精草和華南谷精草、毛谷精草的參考依據(jù)。根據(jù)本文的研究結(jié)果，建議在谷精草的藥典標(biāo)準(zhǔn)中可以考慮增加薄層色譜法和紫外光譜法作為鑒別谷精草、華南谷精草、毛谷精草的方法。在采用薄層色譜法和紫外光譜法對(duì)谷精草中槲皮素的含量進(jìn)行測(cè)定方面，有研究對(duì)不同色譜柱〔Waters XSelect CSH C18 液相色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm）、資生堂Capcell PAK C18液相色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm）、AgilentZORBAX Extend C18 液相色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm）〕及不同柱溫（30℃、35℃、40℃）進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素的峰形良好。

綜上所述，谷精草、華南谷精草、毛谷精草在薄層色譜及紫外光譜上存在明顯的區(qū)別，通過(guò)進(jìn)行薄層色譜和紫外光譜檢測(cè)可對(duì)三者進(jìn)行有效的鑒別。毛谷精草和谷精草中槲皮素的含量較高，華南谷精草中槲皮素的含量較低。