凡納濱對(duì)蝦WDS基因克隆及其表達(dá)分析

吳誠(chéng)旭 章雙 黎銘 張海濤 史黎黎

摘要：【目的】分析WDS基因在凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）各組織中的表達(dá)情況及應(yīng)對(duì)不同病原感染時(shí)的表達(dá)變化，以揭示W(wǎng)DS在動(dòng)物體除生殖外其他生理活動(dòng)中的功能作用。【方法】采用RACE-PCR克隆凡納濱對(duì)蝦WDS基因（LvWDS）cDNA序列，利用在線生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列分析，并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析LvWDS基因在凡納濱對(duì)蝦不同組織中的表達(dá)情況及不同病原感染后的表達(dá)變化?！窘Y(jié)果】LvWDS基因（GenBank登錄號(hào)MH330316）cDNA序列全長(zhǎng)1880 bp，其中，開放閱讀框（ORF）978 bp，5'端非編碼區(qū)（5'UTR）183 bp，3'端非編碼區(qū)（3'UTR）719 bp，編碼325個(gè)氨基酸。LvWDS氨基酸序列含有7個(gè)WD40重復(fù)序列（保守結(jié)構(gòu)域），與擬穴青蟹（Scylla paramamosain）WDS氨基酸序列的相似性最高，為99%，基于WDS氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也顯示LvWDS與擬穴青蟹WDS的親緣關(guān)系最近。LvWDS基因在凡納濱對(duì)蝦精囊中的相對(duì)表達(dá)量最高，在血細(xì)胞、鰓和腸道等免疫組織中處于較高表達(dá)水平，在肌肉組織中的表達(dá)水平最低。經(jīng)白斑綜合癥病毒（WSSV）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染后，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞、鰓和腸道組織中LvWDS基因的相對(duì)表達(dá)量均不同程度發(fā)生變化?！窘Y(jié)論】WDS進(jìn)化十分保守，其在不同物種中的功能穩(wěn)定。LvWDS除了在凡納濱對(duì)蝦生殖發(fā)育中發(fā)揮重要作用外，可能還與免疫相關(guān)，在凡納濱對(duì)蝦抗病免疫中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞： 凡納濱對(duì)蝦;WD重復(fù)蛋白;WDS基因;組織表達(dá);白斑綜合癥病毒（WSSV）;副溶血弧菌

中圖分類號(hào)： S945.49? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）01-0165-08

0 引言

【研究意義】我國(guó)是世界對(duì)蝦養(yǎng)殖第一大國(guó)，凡納濱對(duì)蝦是最主要的養(yǎng)殖品種（農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局，2016），而病害是制約對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸（周井娟，2016）。在對(duì)蝦病害中，以白斑綜合癥（White spot syndrome，WSS）的危害最嚴(yán)重（曹煜成等，2018），弧菌病則是對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中難以回避的問題（Lightner et al.，2005;呂莉等，2018;明磊等，2018）。對(duì)蝦發(fā)病受自身因素、病原侵入及外部環(huán)境3個(gè)方面的影響，其中增強(qiáng)對(duì)蝦自身免疫力能從根本上起到防治病害的作用（Thitamadee et al.，2016）。因此，開展對(duì)蝦先天性免疫防御機(jī)制研究，對(duì)尋求有效的對(duì)蝦病害防治方法具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對(duì)蝦的先天性免疫系統(tǒng)可分為細(xì)胞免疫和體液免疫，其中體液免疫的主體是血淋巴中一些天然或誘導(dǎo)產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)（Xu et al.，2014），主要包括各種酶類（酚氧化酶、溶菌酶、過氧化氫酶等）、免疫因子（凝集素、抗菌肽等）和調(diào)節(jié)因子等（Lai et al.，2005;Burge et al.，2007;Zhao et al.，2009;Zanjani et al.，2018），并通過Toll、IMD及JAK/STAT信號(hào)通路等多種免疫途徑傳遞信號(hào)，最終在應(yīng)對(duì)病原感染過程中發(fā)揮重要作用（Li and Xiang，2013）。但總體而言，有關(guān)對(duì)蝦先天性免疫的認(rèn)識(shí)還有待進(jìn)一步探究。WD重復(fù)蛋白是真核生物中的一個(gè)蛋白大家族，由多種結(jié)構(gòu)類似、功能各異的蛋白組成，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白運(yùn)輸、細(xì)胞骨架裝配、染色體修飾及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用（Villanueva et al.，2016），其基因突變與Allgrove綜合癥、Cockayne綜合癥等多種人類疾病相關(guān)（Li and Roberts，2001）。WD重復(fù)蛋白是由4～8個(gè)高度保守的WD重復(fù)基元（也稱WD40重復(fù)）組成，WD40重復(fù)的N端一般含有一個(gè)甘氨酸—組氨酸（GH）二肽序列，C端則含有一個(gè)色氨酸—天冬氨酸（WD）二肽序列（Coronin，2008）。WDS是WD重復(fù)蛋白家族的新成員，因包含7個(gè)WD重復(fù)又名WD seven，最早從黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）飽和誘變體的致死互補(bǔ)群zw8中分離獲得（Hollmann et al.，2002），后續(xù)的相關(guān)研究也主要集中在昆蟲類動(dòng)物，至今尚無(wú)脊椎動(dòng)物WDS基因的相關(guān)報(bào)道。在果蠅卵子發(fā)生過程中，WDS基因的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡（Hollmann et al.，2002）;在柞蠶（Antherea pernyi）中，WDS基因在脂肪體和馬氏管中的表達(dá)量最高，且卵巢中的表達(dá)量高于精巢，與在家蠶（Bombyx mori）中的表達(dá)規(guī)律一致（Li et al.，2011）;在甲殼類動(dòng)物擬穴青蟹（Scylla paramamosain）中，WDS基因在各組織中均有表達(dá)，但以在卵巢中的表達(dá)量較高（高潔，2013）。【本研究切入點(diǎn)】綜上所述，WDS在動(dòng)物體的生殖發(fā)育過程尤其是卵子發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要作用，但至今有關(guān)凡納濱對(duì)蝦WDS基因的功能研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在克隆凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）WDS基因（LvWDS）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析其在凡納濱對(duì)蝦各組織中的表達(dá)情況及應(yīng)對(duì)不同病原感染時(shí)的表達(dá)變化，旨在揭示W(wǎng)DS在動(dòng)物體除生殖外其他生理活動(dòng)的功能作用。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

凡納濱對(duì)蝦（8～10 g/尾）購(gòu)于廣東恒興集團(tuán)有限公司，試驗(yàn)前暫養(yǎng)7 d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。攜帶白斑綜合癥病毒（WSSV）的凡納濱對(duì)蝦及副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供;RACE模板制備試劑盒購(gòu)自美國(guó)Clontech公司;RNA提取試劑盒和克隆片段膠回收試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司;cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1. 2 LvWDS基因cDNA克隆及序列分析

LvWDS基因的部分序列信息來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同時(shí)采用Primer Premer 5.0設(shè)計(jì)5'RACE和3'RACE特異性引物（表1），5'端和3'端RACE-PCR擴(kuò)增分別采用特異性引物WDS-5R和WDS-3R與通用引物NUP配對(duì)，具體反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照黃金鳳等（2017）的研究方法。RACE-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目的片段進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1. 3 LvWDS基因序列生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站中的BLAST、EditSeq及SMART等在線軟件對(duì)LvWDS基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，預(yù)測(cè)其開放閱讀框（ORF）及氨基酸序列，并分析其編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域等相關(guān)生物學(xué)信息。利用ClustalX對(duì)不同物種來(lái)源的WDS蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并以MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 4 LvWDS基因在凡納濱對(duì)蝦組織中的表達(dá)差異分析

隨機(jī)挑選暫養(yǎng)7 d后的凡納濱對(duì)蝦12尾，4尾一組，分別采集眼柄、肝胰腺、胃、表皮、心臟、血細(xì)胞、神經(jīng)、肌肉、精囊、鰓和腸道等11個(gè)組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 模板后用于qPCR定量分析，引物為WDS-qF和WDS-qR，具體操作參照黃金鳳等（2017）的方法。以EF1α基因?yàn)閮?nèi)參基因。

1. 5 WSSV和副溶血弧菌感染后LvWDS基因表達(dá)差異分析

將凡納濱對(duì)蝦分為3組，每組90尾，每組又分成3個(gè)平行（10尾）。WSSV懸液制備、副溶血弧菌培養(yǎng)鑒定及人工感染均參照Z(yǔ)hang等（2016）的方法，分別在注射感染后不同時(shí)間點(diǎn)（0、4、8、12、24、48和72 h）采集血細(xì)胞、腸道和鰓3種組織，每個(gè)平行取3尾對(duì)蝦的相同組織混合成1個(gè)樣品。qPCR定量分析同1.4，并采用 t 檢驗(yàn)進(jìn)行LvWDS基因表達(dá)差異分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 LvWDS基因cDNA全長(zhǎng)及其序列分析結(jié)果

將RACE-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物拼接即獲得LvWDS基因（GenBank登錄號(hào)MH330316），測(cè)序結(jié)果（圖1）表明，其cDNA全長(zhǎng)1880 bp，包括ORF 978 bp、5'端非編碼區(qū)（5'UTR）183 bp和3'端非編碼區(qū)（3'UTR）719 bp，編碼325個(gè)氨基酸。SMART分析結(jié)果顯示，LvWDS氨基酸序列含有7個(gè)WD40保守結(jié)構(gòu)域（圖2），分別位于第25～64、67～106、109～148、151～190、193～233、236～278和281～322位氨基酸殘基。通過對(duì)比LvWDS氨基酸序列中的7個(gè)WD40重復(fù)序列（保守結(jié)構(gòu)域），發(fā)現(xiàn)與其他6個(gè)WD40重復(fù)序列不同，第7個(gè)WD40重復(fù)序列在靠近C端有兩個(gè)氨基酸殘基插入（圖3）。

2. 2 LvWDS氨基酸多重序列比對(duì)分析結(jié)果

分析不同物種WDS氨基酸序列間的相似性，結(jié)果顯示，LvWDS與所選昆蟲類和甲殼動(dòng)物類中多個(gè)物種WDS氨基酸序列的相似性較高，均超過84%，其中，與擬穴青蟹WDS氨基酸序列的相似性最高，達(dá)99%（圖4）。基于WDS氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5）也顯示，LvWDS與同為甲殼動(dòng)物的擬穴青蟹WDS和大型溞WDS聚為一類，且與擬穴青蟹的親緣關(guān)系最近。

2. 3 LvWDS基因在凡納濱對(duì)蝦不同組織中的表達(dá)情況

LvWDS基因在凡納濱對(duì)蝦不同組織中的表達(dá)情況如圖6所示。LvWDS基因在11種組織中均被檢測(cè)到，其中以心臟、血細(xì)胞、神經(jīng)、精囊、鰓及腸道組織中的表達(dá)量較高，而在肌肉組織中的表達(dá)量最低。經(jīng)2?△△Ct換算得知，LvWDS基因在精囊中的相對(duì)表達(dá)量最高，約是肌肉中相對(duì)表達(dá)量的22.40倍，在鰓組織中的表達(dá)量次之（圖7）。

2. 4 WSSV感染對(duì)LvWDS基因表達(dá)的影響

WSSV感染后，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中LvWDS基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)（圖8-A），在感染后24 h達(dá)峰值，約是對(duì)照組的3.00倍;感染48 h后開始下降，與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05，下同）。WSSV感染后8 h內(nèi)，凡納濱對(duì)蝦鰓組織中LvWDS基因的表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)顯著差異;至感染后12 h，LvWDS基因的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高（P<0.05，下同）;至感染后24 h達(dá)最高值，約是對(duì)照組的3.00倍;感染72 h后又降至對(duì)照組水平，二者差異不顯著（圖8-B）。在腸道組織中，LvWDS基因的相對(duì)表達(dá)量在凡納濱對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后呈先下降后上升再下降的變化趨勢(shì);感染4 h后，其相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降，約是對(duì)照組的60%;感染8 h后開始升高，且各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均顯著或極顯著（P<0.01，下同）高于對(duì)照組，至感染后24 h達(dá)最高值，約是對(duì)照組的3.50倍（圖8-C）。

2. 5 副溶血弧菌感染對(duì)LvWDS基因表達(dá)的影響

注射感染副溶血弧菌后，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中LvWDS基因的相對(duì)表達(dá)量除了感染后12和72 h外，其他檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均顯著或極顯著高于對(duì)照組，以感染后8 h的相對(duì)表達(dá)量最高，約是對(duì)照組的2.10倍（圖9-A）。感染副溶血弧菌后12 h內(nèi)，凡納濱對(duì)蝦鰓組織中LvWDS基因的相對(duì)表達(dá)量顯著或極顯著低于對(duì)照組，但感染24 h后較對(duì)照組極顯著升高，至感染后48 h又降至與對(duì)照組無(wú)顯著差異的表達(dá)水平（圖9-B）。在腸道組織中，LvWDS基因的相對(duì)表達(dá)量在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均顯著或極顯著高于對(duì)照組，以感染后4 h的相對(duì)表達(dá)量最高，約是對(duì)照組的3.30倍（圖9-C）。

3 討論

WDS作為新發(fā)現(xiàn)的WD重復(fù)蛋白家族成員，主要認(rèn)為其與動(dòng)植物的生殖發(fā)育相關(guān)。本研究成功從凡納濱對(duì)蝦克隆獲得LvWDS基因，其蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，LvWDS具有WDS蛋白的典型特征，包含7個(gè)WD40重復(fù)序列，與其他物種的同源蛋白一致。目前，在NCBI中能搜索到已注冊(cè)且具有ORF全長(zhǎng)的WDS基因序列主要有無(wú)脊椎動(dòng)物、植物和真菌三大類，脊椎動(dòng)物中只能搜索到相關(guān)的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）信息。對(duì)不同物種間的WDS蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各物種間相同位置WD重復(fù)基元的氨基酸序列十分保守，同源性較高;在WDS氨基酸序列的最后一個(gè)WD40重復(fù)序列中，除致倦庫(kù)蚊的插入氨基酸為谷氨酸（E）和絲氨酸（S）外，包括黑腹果蠅（Hollmann et al.，2002）和柞蠶（Li et al.，2011）在內(nèi)的多個(gè)物種插入氨基酸均為谷氨酸（E）和天冬酰胺（N），LvWDS氨基酸序列中的插入序列也為E和N。LvWDS與不同物種WDS蛋白的相似性較高，其中與同為甲殼動(dòng)物擬穴青蟹WDS的相似性高達(dá)99%;基于WDS氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也顯示，LvWDS與擬穴青蟹WDS的親緣關(guān)系最近?？梢姡琖DS在進(jìn)化上十分保守，暗示其在不同物種中的功能穩(wěn)定。

目前，有關(guān)WDS基因在動(dòng)物體不同組織分布的信息不多，僅在果蠅、柞蠶和擬穴青蟹中有相關(guān)報(bào)道，其中在柞蠶（Li et al.，2011）和擬穴青蟹（高潔，2013）中WDS基因的組織分布信息相對(duì)全面。與果蠅、柞蠶和擬穴青蟹WDS基因在生殖相關(guān)的組織中表達(dá)量最高相一致，LvWDS基因在凡納濱對(duì)蝦精囊中的相對(duì)表達(dá)量最高，提示LvWDS在凡納濱對(duì)蝦生殖發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在擬穴青蟹中，除生殖相關(guān)組織外，WDS基因在鰓、血細(xì)胞和腸道等免疫組織中的表達(dá)量較高，而在肝胰腺中的表達(dá)量最低（高潔，2013）。同樣，LvWDS基因在凡納濱對(duì)蝦的鰓、血細(xì)胞和腸道組織中表達(dá)量較高，其中在鰓組織中的表達(dá)量?jī)H次于精囊，提示LvWDS基因很可能與凡納濱對(duì)蝦的免疫相關(guān)。與前人的相關(guān)研究（Li et al.，2011;高潔，2013）不同，本研究中LvWDS基因在凡納濱對(duì)蝦肌肉組織中表達(dá)量最低，而在柞蠶和擬穴青蟹肌肉組織中的表達(dá)量均處于較高水平，說明在不同物種中WDS基因功能呈多樣性。

在人類生命的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和疾病防御及其治療上，WD重復(fù)蛋白調(diào)控機(jī)制發(fā)揮著不可或缺的作用（Coronin，2008）。WD重復(fù)蛋白之一smu-1在羅氏沼蝦中被干擾后，羅氏沼蝦應(yīng)對(duì)熱誘導(dǎo)能力顯著降低（錢美睿，2013）。同為WD重復(fù)家族成員，WDS在動(dòng)物體中的研究主要集中在生殖功能方面（Hollmann et al.，2002;Li et al.，2011;高潔，2013;Ye et al.，2014）?？紤]到WD重復(fù)蛋白家族基因功能的多樣性，基于LvWDS基因在凡納濱對(duì)蝦免疫組織中的較高表達(dá)情況，本研究對(duì)凡納濱對(duì)蝦應(yīng)答病原感染時(shí)LvWDS基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，病毒（WSSV）和細(xì)菌（副溶血弧菌）感染均能不同程度刺激對(duì)蝦體內(nèi)血細(xì)胞、鰓和腸道等免疫組織中LvWDS基因的表達(dá)，一定程度上表明LvWDS參與凡納濱對(duì)蝦的抗病免疫，但其參與免疫的具體作用途徑有待進(jìn)一步探究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

WDS進(jìn)化十分保守，其在不同物種中的功能穩(wěn)定。LvWDS除了在凡納濱對(duì)蝦生殖發(fā)育中發(fā)揮重要作用外，可能還與免疫相關(guān)，在凡納濱對(duì)蝦抗病免疫中發(fā)揮作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）