基于SCoT分子標記的金花茶組植物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

盧家仕，李先民，黃展文，余海娟，李春牛，蘇 群，卜朝陽

廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院 花卉研究所，廣西 南寧 530007

金花茶Camellia nitidssimaChi.是山茶科（Theaceae）山茶屬CamelliaL.金花茶組植物，是具有金黃色花的山茶屬植物代表，屬國家一級珍稀保護植物。金花茶主要分布于我國廣西南部和越南北部，地處亞熱帶南緣和熱帶北緣的熱帶季風氣候區(qū)，自1960年首次在廣西發(fā)現(xiàn)以來，已知的金花茶有42種5變種，其中廣西南部及西南部產(chǎn)29種5變種，云南、貴州、四川各產(chǎn)1種，越南北部產(chǎn)10種。金花茶是世界珍貴稀有的觀賞植物和種質(zhì)資源，被譽為“茶族皇后”“植物界中的大熊貓”和“幻想中的黃色山茶[1-3]。金花茶花朵金黃色，具蠟質(zhì)光澤，是培育黃色茶花的優(yōu)良親本[4]。金花茶的花朵和葉片中含有類黃酮、茶多酚及茶多糖等多種化學活性成分，也含有豐富的蛋白質(zhì)、人體必需的氨基酸及微量元素，具有調(diào)血脂、降血糖、降血壓和抗癌等藥用功效和重要的保健價值[5-8]。

目前對金花茶的研究主要集中在地理分布[9-10]、引種栽培[11-12]、繁殖方式[13-16]、化學成分[17-18]、基因克隆[19-20]等研究。隨著分子生物學的發(fā)展，分子標記技術在植物種植資源分類、品種鑒定、遺傳多樣性分析中發(fā)揮著重要的作用。分子標記技術在金花茶組植物種質(zhì)資源中的應用主要如下：施蘇華等[21]篩選14個隨機擴增多態(tài)性 DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）引物分析11種金花茶植物間的遺傳相似性，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹狀分支圖；張玥等[22]用簡單重復序列區(qū)間（intersimple sequence repeats，ISSR）分子標記方法對云南大圍山金花茶及廣西金花茶種質(zhì)資源進行親緣關系分析，結(jié)果表明廣西金花茶與云南金花茶分為2類，而且親緣關系較遠，云南大圍山金花茶可進一步細分為2個亞類；李辛雷等[23]用擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）分子標記技術，對4個金花茶種群進行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明金花茶種群內(nèi)遺傳變異為81.52%，種群間遺傳變異為18.48%，遺傳變異主要存在于種群內(nèi)，種群間遺傳變異與其地理距離無明顯相關性；劉凱等[24]用SNP標記技術從基因組水平揭示不同地區(qū)金花茶種質(zhì)遺傳關系，結(jié)果可分成2個大的類群；陳莉萍等[25]用簡單序列重復（simple sequence repeats，SSR）分子標記技術分析平果金花茶具有中等程度的遺傳多樣性和高水平的遺傳分化，種群內(nèi)遺傳變異達74.69%，種群間的遺傳變異為25.31%。

SCoT（start codon targeted polymorphism）為目標起始密碼子多態(tài)性標記，該標記具有操作簡單、重復性好等特點，可作為RAPD、ISSR等傳統(tǒng)分子標記的有效補充[26]。目前已廣泛應用在楊桃[27]、砂糖桔[28]、絲瓜[29]等作物的遺傳多樣性分析中。目前，未見有利用SCoT分子標記技術對金花茶進行遺傳多樣性分析的報道。利用SCoT分子標記技術分析不同金花茶組植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關系，為金花茶組植物種質(zhì)資源鑒定保護和開發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 材料

27份試驗的金花茶組植物種質(zhì)資源種植在廣西農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所金花茶種質(zhì)資源圃內(nèi)。材料由廣西農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所卜朝陽研究員和盧家仕副研究員共同鑒定，鑒定結(jié)果見表1。實驗材料統(tǒng)一采集新鮮的嫩葉，先用自來水清洗干凈，再用去離子水清洗一遍，最后用濾紙吸干水分后提取植物基因組總DNA。

表1 實驗材料Table 1 Test materials

1.2 主要儀器與試劑

HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（北京海天友誠科技有限公司）；FM130型雪花制冰機（北京長流科技有限責任公司）；H1650-W型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；MINI-4K微型離心機（杭州米歐儀器有限公司）；MixMate PBC-115353混勻儀（Eppendorf公司）；Nano Drop One核酸蛋白測定儀（美國Nano Drop產(chǎn)品）；LifeECO基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）；DDY-60型電泳儀（北京市六一儀器廠）；DYCP-31DN型電泳槽（北京市六一儀器廠）；BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)（美國產(chǎn)品）。Biospin全能型植物基因組DNA試劑盒、2×Es Taq Master Mix（杭州博日科技有限公司）；RNase A（天根生化有限公司）；Gold View I型核酸染色劑（北京索萊寶科技有限公司）；DL5000 Maker（Takara公司）；Biowest瓊脂糖（西班牙原裝）；超純水、50×TAE concentrate Solution緩沖液（南寧國拓生物科技有限公司）；SCoT引物由北京擎科生物科技有限公司（廣州分公司）合成。

2 方法

2.1 DNA提取與檢測

金花茶組植物DNA參照Biospin全能型植物基因組DNA試劑盒說明方法提取。DNA用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop One核酸蛋白測定儀檢測其純度和濃度，每個DNA濃度統(tǒng)一用超純水稀釋為10 ng /μL后放-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 引物篩選與SCoT-PCR擴增

用平果金花茶（廣西）和黃抱莖金花茶（越南）2份DNA樣品代表進行引物初篩選，從中篩選擴增產(chǎn)物多態(tài)性好、重復性高、條帶清晰的引物。SCoTPCR 20 μL反應體系如下：DNA 1 μL、超純水8 μL、2×Ex Taq Mix 10 μL、SCoT引物1 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，50～55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，擴增進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，產(chǎn)物于4 ℃保存。取7 μL PCR擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)檢測和拍照保存。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

SCoT-PCR擴增產(chǎn)物按同一遷移水平下條帶的有無分別賦值，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，采用人工讀取和統(tǒng)計條帶。將[0，1]數(shù)據(jù)矩陣導入NTsys 2.10e軟件中，用DICE法計算遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法構(gòu)建聚類樹狀圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 SCoT引物篩選與擴增結(jié)果

從100條SCoT引物中篩選出13條多態(tài)性高、條帶清晰的引物共擴增出566條條帶，其中多態(tài)性條帶549條，多態(tài)性比率為97%，平均每條SCoT引物擴增的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)分別為43.54和42.23條，多態(tài)性比率為89.74%～100.00%，平均為96.82%（表2）；擴增片段大小為250～5 000 bp，以500～3000 bp居多，圖1、2分別是引物SCoT 34和SCoT 40對不同金花茶組植物種質(zhì)資源的DNA擴增結(jié)果。

表2 13個SCoT引物的擴增結(jié)果Table 2 Amplification results of thirteen SCoT primers

圖1 引物SCoT 34對27份金花茶組植物種植資源的SCoT分子標記擴增結(jié)果Fig.1 Amplification result of 27 Camellia sect. chrysantha Chang germplasm resources with primer SCoT 34 by SCoT molecular marker

圖2 引物SCoT 40對27份金花茶組植物種植資源的SCoT分子標記擴增結(jié)果Fig.2 Amplification result of 27 Camellia sect. chrysantha Chang germplasm resources with primer SCoT 40 by SCoT molecular marker

3.2 遺傳相似性分析

利用NTSYS 2.10e軟件DICE法計算13條SCoT引物擴增結(jié)果，導出了在0.367～0.754，獲得了遺傳相似性矩陣（表3）。2個不同種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)越大說明材料間的親緣關系越近，相反，2個不同種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)越小說明材料間的親緣關系越遠。龍州金花茶和毛籽金花茶之間的相似系數(shù)最大，為0.754，其親緣關系最近，普通金花茶和羅斯曼金花茶之間的相似系數(shù)最小，為0.367，其親緣關系最遠。

表3 27份金花茶組植物種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)Table 3 Genetic similarity coefficients of 27 Camellia sect. chrysantha Chang germplasm resources

3.3 聚類分析

通過非加權(quán)平均距離法（UPGMA）聚類分析，構(gòu)建27份金花茶組植物種質(zhì)資源的聚類樹狀圖（圖3）。由圖可見，13條SCoT引物的擴增結(jié)果在遺傳相似系數(shù)0.480處聚為5組，分別是I、II、III、IV、V組。第I組有8個金花茶種質(zhì)，在遺傳相似系數(shù)0.511處第I組被分為a、b 2個亞組，其中a亞組包括普通金花茶和毛瓣金花茶2個種質(zhì)，b亞組包括小花金花茶、東興金花茶、薄葉金花茶、凹脈金花茶、中東金花茶和顯脈金花茶6個種質(zhì)。第II組有5個金花茶種質(zhì)，在遺傳相似系數(shù)0.517處第II組被分為c、d 2個亞組，其中c亞組包括黃抱莖金花茶和隆安金花茶2個種質(zhì)，d亞組包括扶綏金花茶、大葉顯脈金花茶和小葉顯脈金花茶3個種質(zhì)。第III組有夏石金花茶、紅頂金花茶和多毛金花茶3個種質(zhì)。第IV組有10個金花茶種質(zhì)，在遺傳相似系數(shù)0.508處第IV組被分e、f 2個亞組，其中e亞組只有頂生金花茶1個種質(zhì)，f亞組包括崇左金花茶、龍州金花茶、毛籽金花茶、隴瑞金花茶、弄崗金花茶、平果金花茶、檸檬黃金花茶、庫克芳金花茶和天鵝金花茶9個種質(zhì)。第V組只有羅斯曼金花茶1個種質(zhì)，與其他種質(zhì)資源之間遺傳相似系數(shù)在0.367～0.509，其遺傳相似系數(shù)與普通金花茶的最小，為0.367，與凹脈金花茶的最大，為0.509。

圖3 27份金花茶組植物材料的UPGMA聚類樹狀圖Fig.3 UPGMA dendrogram of 27 plants of Camellia sect.chrysantha Chang germplasms resources

4 討論

SCoT分子標記是一種根據(jù)起始密碼子ATG側(cè)翼序列的保守性和一致性設計單向引物，擴增產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)的顯性多態(tài)性標記[30]，其操作簡單、多態(tài)性高、重復性好、引物通用性強，能有效產(chǎn)生與性狀連鎖的位點，可檢測出不同基因型供試材料間的微小差異，準確反映種質(zhì)間親緣關系[31]。本研究用13條引物對27份金花茶種質(zhì)進行PCR擴增，共擴增出566條條帶，其中多態(tài)性條帶549條，多態(tài)性比率為97%。賓曉蕓[32]用ISSR、RAPD和AFLP 3種分子標記方法揭示了金花茶物種的遺傳多樣性水平，ISSR、RAPD和AFLP多態(tài)位點百分數(shù)分別為75.2%、79.7%、80.73%。陳莉萍等[25]用8對SSR引物對7個野生代表種群，共216個個體擴增獲得多態(tài)性條帶比率為94.64%。SCoT分子標記多態(tài)性比ISSR、RAPD和AFLP的高，與SSR分子標記接近。傳統(tǒng)分子標記較穩(wěn)定、可靠、操作簡便，不受外部環(huán)境條件干擾，但也存在一些缺點，如AFLP分子標記需要高質(zhì)量的DNA模板及制膠技術，RAPD分子標記重復性較差，SSR和cqSSR分子標記的引物開發(fā)較困難[33]。SCoT分子標記可作為ISSR、RAPD和AFLP的有效補充[26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)金花茶組植物基因組有較高的多態(tài)性，可用于該類植物種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建，這些多態(tài)性位點信息很可能是一些功能基因或與目標性狀相關聯(lián)，可為基因定位和基因克隆提供理論參考依據(jù)。

第I組8個金花茶種質(zhì)中，a亞組普通金花茶和毛瓣金花茶相近，b亞組小花金花茶與東興金花茶相近，薄葉金花茶與凹脈金花茶相近，中東金花茶與顯脈金花茶相近，第I組的聚類結(jié)果與葉創(chuàng)興等[34]研究結(jié)果相似，如普通金花茶、凹脈金花茶與顯脈金花茶相近，毛瓣金花茶、薄葉金花茶與小花金花茶相近；小花金花茶與中東金花茶聚為一組與張宏達[35]、施蘇華等[36]的研究結(jié)果相似，不同的是本組不包括扶綏金花茶；毛瓣金花茶與東興金花茶聚為一組與肖政等[37]的研究結(jié)果相似，不同的是其還包括薄瓣金花茶與東興金花茶相近，但這兩者的差異大。

第II組5個金花茶種質(zhì)中，黃抱莖金花茶和隆安金花茶相近，區(qū)別在于前者嫩葉紫紅色，葉基部呈耳狀抱莖，嫩枝光滑無毛[38]，隆安金花茶花期較早，每年11月底始開；大葉顯脈金花茶和小葉顯脈金花茶遺傳相似系數(shù)較高，為0.749，扶綏金花茶與這兩者相近，而扶綏金花茶嫩葉淡紅色，嫩枝淡紫紅色。第III組3個金花茶種質(zhì)中，紅頂金花茶和多毛金花茶遺傳相似系數(shù)較高，為0.626，兩者都是越南種，區(qū)別在于紅頂金花茶花色金黃，花大，產(chǎn)量高，具有較好的耐曬性[39]，多毛金花茶花色淡黃，花瓣無蠟質(zhì)，嫩枝有濃密絨毛[38]，夏石金花茶與這兩者相近，而不與小花金花茶相聚，這個研究結(jié)果與肖政等[37]的研究結(jié)果不一致，與梁盛業(yè)[1]的兩者分開分類相似，夏石金花茶與小花金花茶花形態(tài)近似，但夏石金花茶葉片比較寬長，子房無銀灰色短柔毛，其可能原因是SCoT分子標記擴增產(chǎn)生偏向于候選功能基因區(qū)的顯性標記，紅頂金花茶、多毛金花茶和夏石金花茶之間可能有共同的性狀連鎖位點，聚類分析表現(xiàn)為親緣關系較近。

第IV組10個金花茶種質(zhì)中，龍州金花茶和毛籽金花茶遺傳相似系數(shù)最高，為0.754，隴瑞金花茶和弄崗金花茶與龍州金花茶、毛籽金花茶聚為小組，結(jié)果與閔天祿等[40]將毛籽金花茶、弄崗金花茶、大樣弄崗金花茶、大茶金花茶、隴瑞金花茶歸并到淡黃金花茶的觀點相似，與施蘇華等[36]的4個聚為一組研究結(jié)果一致。平果金花茶與檸檬黃金花茶聚在一起，遺傳相似系數(shù)較高，為0.698，結(jié)果與葉創(chuàng)興等[34]研究結(jié)果相似。頂生金花茶花大，多單生于小枝頂端，其習性和葉形特征與平果金花茶十分相似[23]。隴瑞金花茶與檸檬黃金花茶、天鵝金花茶同為f亞組，結(jié)果與肖政等[37]的研究結(jié)果聚為A類相似。庫克芳金花茶為越南引進種，與檸檬黃金花茶相近，遺傳相似系數(shù)較高，為0.583，區(qū)別在于庫克芳金花茶長勢旺，一年可多次抽稍。第V組只有羅斯曼金花茶1個越南種質(zhì)，與其他種質(zhì)資源差異較大，可以作與為其他種質(zhì)遠緣雜交的資源。

不同金花茶組植物種質(zhì)間的遺傳多樣性豐富，SCoT分子標記多態(tài)性高，重復性好，可有效用于金花茶組植物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和親緣關系鑒定，為金花茶組植物種質(zhì)資源的鑒定保護、分子輔助育種和開發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突