毛冬青三萜皂苷對動脈粥樣硬化大鼠腸道菌群的影響

白榮鈺，易 歡，陳豐連，邱靜文，王 瑩，陳冰瑩，李 瑜，張 蕾*

1.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006

2.廣州中醫(yī)藥大學護理學院，廣東 廣州 510006

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎性疾病，是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機制復雜，涉及內(nèi)皮細胞損傷、脂質(zhì)沉積、炎性細胞的聚集浸潤、炎性因子的釋放、血小板的聚集活化、血管平滑肌增殖與遷移等多種病理過程[1]。AS與人體衰老過程密切相關(guān)，其相關(guān)疾病的死亡率位居我國首位。研究表明，腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能的異常可通過三甲胺/三甲胺N-氧化物、初級和次級膽汁酸、短鏈脂肪酸、細菌內(nèi)毒素易位等多種途徑促進AS、高血壓、心衰、心肌缺血等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[2]。Eelke等[3]將Casp1-/-小鼠的促炎性腸道菌群移植至Ldlr-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)促炎性腸道菌群會增強小鼠全身性炎性反應并加速AS的形成。在中醫(yī)“心與小腸相表里”的理論指導下，越來越多的研究表明在中醫(yī)藥治療心血管疾病的作用機制中，中藥與腸道微生態(tài)相互作用的過程是關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[4]。

毛冬青是冬青科冬青屬植物毛冬青Ilex pubescensHook.et Am.的干燥根，主產(chǎn)于廣東、廣西、湖南等地，具有消腫止痛、活血通脈、清熱解毒等功效[5-6]，已被開發(fā)成針劑、片劑、膠囊劑等，臨床上廣泛用于治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦血栓、血栓性脈管炎、中心視網(wǎng)膜炎等疾病[5]。毛冬青主要活性成分為三萜皂苷類成分[7-8]。毛冬青三萜皂苷（IPTS）的口服生物利用度低，本課題組前期研究表明，IPTS主要分布于胃腸道和胸主動脈，僅有少量分布于心臟、肝臟和腎臟，腦中幾乎檢測不到[9]。其較低的生物利用率難以直接解釋其對AS等心血管疾病的治療作用，本研究擬探究IPTS對AS大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用及其機制，為IPTS治療AS提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，6～7周齡，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK（粵）2013-0034。動物于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物房適應性喂養(yǎng)1周，溫度（24±2）℃、12 h光晝交替，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學實驗動物倫理審查委員會批準（批準號ZYD-2020-065）。

1.2 藥材

毛冬青購自廣州致信藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學張丹雁教授鑒定為冬青科冬青屬植物毛冬青I.pubescensHook.et Am.的干燥根。

1.3 藥品與試劑

毛冬青皂苷B1對照品（質(zhì)量分數(shù)＞98%）購自維克奇生物科技有限公司；高脂飼料（由3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、10%豬油、5%白糖、81.3%基礎(chǔ)飼料組成）購自北京華阜康生物科技股份有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、甲醛溶液和水合氯醛購自廣州蘇鋮粵貿(mào)易有限公司；辛伐他汀片（20 mg/片，批號T020243）購自上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司；維生素D3注射液（批號20190401）購自哈爾濱市道外區(qū)宏達動物藥品廠；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒（批號20190924）、三酰甘油（triglycerides，TG）試劑盒（批號201909016）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒（批號20190905）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒（批號20190905）和一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號20190904）購自南京建成生物工程研究所；內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）ELISA試劑盒（批號I30013321）和血管緊張素-II（angiotensin-II，Ang-II）ELISA試劑盒（批號J22013320）購自武漢華美生物工程有限公司；瓊脂糖購自廣州浩瑪生物科技有限公司；3422A 100bp DNA ladder購自日本Takara公司；引物由美國Thermo Fisher Scientific公司合成；無水乙醇均為分析純，購自廣州蘇城粵有限公司；凝膠回收試劑盒購自美國Omega公司；糞便基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.4 儀器

多功能酶標儀（美國Promega公司）；生化培養(yǎng)箱（上海和呈儀器制造有限公司）；冷凍切片機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；恒溫水浴箱（上海一恒科技有限公司）；制冰機（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；實驗室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）；5417R型冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；渦旋混合器電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 IPTS的制備

將毛冬青飲片打成粗粉，加入10倍量水浸泡24 h，定時攪拌，浸泡2次，濾過，棄去濾液。粗粉再按料液比1∶10加入85%～90%乙醇，加熱回流提取2次，1 h/次，收集濾液，濃縮，干燥后得提取物粉末。粉末分散于5倍量10%～20%乙醇中，濾過，棄去濾液，沉淀經(jīng)干燥后得IPTS。以毛冬青皂苷B1為對照品，采用比色法[10]測定總?cè)圃碥盏暮?，標準曲線為Y＝369.95X－0.052 9（R2＝1），計算得三萜皂苷的質(zhì)量分數(shù)為81.63%。

2.2 造模、分組與給藥

SD大鼠隨機分為對照組、模型組、辛伐他?。? mg/kg）組和IPTS低、中、高劑量（30、60、120 mg/kg，分別相當于臨床劑量的0.5、1.0、2.0倍）組，每組10只。模型組、辛伐他汀組和IPTS低、中、高劑量組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)8周，并于第3天ip維生素D3注射液（7×105U/kg）；對照組大鼠給予正常飼料喂養(yǎng)，并于第3天ip等體積0.9%氯化鈉溶液。IPTS溶于0.5% CMC-Na分別配制成質(zhì)量濃度為30、60、120 mg/mL的溶液，超聲20 min使其分散均勻；辛伐他汀片溶于0.5% CMC-Na配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液。各給藥組大鼠自造模第1天ig相應藥物（10 mL/kg），對照組和模型組大鼠ig等體積0.5% CMC-Na溶液，1次/d，連續(xù)8周。

2.3 糞便樣本采集

給藥結(jié)束后，將大鼠置于代謝籠中，連續(xù)收集8 h的糞便樣本，分裝于2 mL冷凍離心管中，于-80 ℃保存。

2.4 IPTS對AS大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、NO、ET-1和Ang-II含量的影響

收集糞便后，大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后腹主動脈取血。血液靜置30 min，4 ℃、3800 r/min離心10 min，分離得到血清。按照試劑盒說明書測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、NO、ET-1和Ang-II含量。

2.5 IPTS對AS大鼠胸主動脈病理變化的影響

大鼠失血致死，解剖取胸主動脈，除去胸主動脈的脂肪組織，于冰浴上用0.9%氯化鈉溶液沖洗組織，切取部分胸主動脈組織置于4%甲醛溶液中，用常規(guī)石蠟包埋，均勻切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 糞便中細菌DNA的提取與測序

2.6.1 DNA的提取與檢測 按照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書提取總DNA，采用微量分光光度計測定樣品DNA的濃度和純度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA完整性。

2.6.2 PCR擴增及產(chǎn)物檢測 選用上游引物515F（5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和下游引物806R（5’-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’）對大鼠糞便樣本的16S rRNA V4區(qū)進行擴增。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物片段長度和濃度，主帶長度在290～310 bp的樣品可用于進一步的實驗；利用GeneTools軟件（Version 4.03.05.0）對PCR產(chǎn)物進行濃度對比，再計算每個樣品所需的體積，將每個PCR產(chǎn)物進行混合。使用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，用TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段。

2.6.3 16S rRNA 基因測序 使用 Illumina Hiseq2500平臺對樣本進行16S擴增子測序，采用paired-end雙端測序方式對產(chǎn)物的V4區(qū)域進行高通量測序，測序過程在廣東美格基因科技有限公司進行。

2.6.4 測序數(shù)據(jù)分析 利用USEARCH軟件對樣本的Clean Tags 進行分類學單元操作（operational taxonomic unit，OTU）聚類，借助QIIME平臺對OTU數(shù)據(jù)進行β多樣性分析、Lefse分析和PICRUSt功能預測。β多樣性分析主要是針對組間差異性進行分析，可以判斷相同條件下樣本組成的相似程度，樣本之間的距離表示樣本的組成相似程度，樣本點越接近說明樣品的相似程度越高。LEfse分析可以對多個組別之間進行比較，從而找到各組在豐度上有顯著差異的物種。通過PICRUSt功能預測來推測樣本中的菌群基因功能的構(gòu)成，從而分析不同組別之間在功能上的差異。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料滿足正態(tài)分布以±s表示，計量資料不滿足正態(tài)分布用M（P25，P75）描述；多組資料進行單因素方差分析檢驗，如方差齊采用LSD檢驗，如方差不齊采用DunnettT3檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗。

3 結(jié)果

3.1 IPTS對AS大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、NO、ET-1和Ang-II含量的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明顯升高（P＜0.01），HDL-C水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組和IPTS高劑量組大鼠血清中TC水平顯著降低（P＜0.05、0.01），HDL-C水平明顯升高（P＜0.05）；辛伐他汀組大鼠血清中LDL-C水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 IPTS對AS大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的影響 (n = 10)Table 1 Effect of IPTS on contents of TC, TG, LDL-C and HDL-C in serum of AS rats (n = 10)

如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中NO水平顯著降低（P＜0.01），ET-1和Ang-II水平顯著增高（P＜0.05、0.01），NO/ET-1顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，IPTS各劑量組大鼠血清中NO水平顯著升高（P＜0.05、0.01），ET-1和Ang-II水平顯著降低（P＜0.05、0.01）；IPTS各劑量組和辛伐他汀組大鼠血清中NO/ET-1顯著升高（P＜0.05、0.01)。

表2 IPTS對AS大鼠血清中NO、ET-1和Ang-II含量的影響 (n = 10)Table 2 Effect of IPTS on contents of NO, ET-1 and Ang-Ⅱ in serum of AS rats (n = 10)

3.2 IPTS對AS大鼠胸主動脈病理變化的影響

如圖1所示，對照組大鼠胸主動脈壁未見增厚，未見粥樣硬化斑塊形成，血管內(nèi)皮光滑，未見損傷脫落；模型組大鼠胸主動脈管壁中有明顯的藍色鈣化斑塊形成，可見膽固醇結(jié)晶，血管內(nèi)皮損傷脫落，有壞死的組織沉積；辛伐他汀組大鼠胸主動脈管壁有些增厚，無明顯斑塊，血管內(nèi)皮粗糙，有些損傷脫落；IPTS中、高劑量組大鼠大部分動脈壁未見增厚，血管內(nèi)皮大致正常，較平滑，未見明顯損傷脫落；IPTS低劑量組大鼠胸主動脈壁有些增厚，但無明顯斑塊，血管內(nèi)皮較粗糙。

圖1 IPTS對AS大鼠胸主動脈病理變化的影響 (HE, ×100)Fig.1 Effect of IPTS on pathological changes of thoracic aorta in AS rats (HE, × 100)

3.3 大鼠腸道菌群多樣性分析

β多樣性分析中樣品的空間距離越接近，樣品的物種組成結(jié)構(gòu)越相似。如圖2所示，模型組與對照組腸道菌群組成有很大差異；IPTS中、高劑量組腸道菌群組成彼此間接近，與模型組有較大差異，表明IPTS可以調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群的組成。

圖2 各組糞便樣本β多樣性PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of β diversity in feces samples of each group

3.4 腸道菌群物種歸屬與差異分析

將OTU表格中的信息按照門水平提取序列信息，并計算各物種的相對豐度，同時選取相對豐度在1%以上的物種繪制物種相對豐度分布圖（圖3）。從門水平上看，4組之間的優(yōu)勢菌群主要為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和疣微菌門。與對照組相比，模型組大鼠腸道菌群中擬桿菌門相對豐度降低，變形菌門相對豐度增加，厚壁菌門相對豐度差異不大；與模型組相比，IPTS中、高劑量組大鼠腸道菌群中擬桿菌門相對豐度增加，厚壁菌門、變形菌門相對豐度降低，腸道菌群結(jié)構(gòu)得到改善。

圖3 IPTS對AS大鼠腸道菌群的影響Fig.3 Effect of IPTS on intestinal flora of AS rats

3.5 LEfSe分析

LEfSe分析可以用于微生物菌群標記物的篩選。對對照組、模型組以及IPTS中、高劑量組進行LEFSe分析，進一步篩選差異菌屬，對差異菌屬（LDA≥2）進行Mann-Whitney U檢驗，并采用Graphpad Prism 7軟件對各組在門、科、屬水平上的菌屬相對豐度差異進行可視化。

3.5.1 門水平腸道菌群相對豐度變化 如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠腸道菌群中脫鐵桿菌門、疣微菌門、螺旋體門和變形桿菌門相對豐度明顯增高（P＜0.05、0.01），擬桿菌門相對豐度明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，IPTS中劑量組大鼠腸道菌群中疣微菌門、變形桿菌門和擬桿菌門相對豐度明顯降低（P＜0.05、0.01），厚壁菌門相對豐度明顯升高（P＜0.05）；IPTS高劑量組大鼠腸道菌群中疣微菌門相對豐度明顯降低（P＜0.01），變形桿菌門相對豐度顯著升高（P＜0.05）。

圖4 門水平各組腸道菌群相對豐度Fig.4 Relative abundance of intestinal flora in each group at phylum level

3.5.2 科水平腸道菌群相對豐度變化 如圖5所示，與對照組比較，模型組大鼠腸道菌群中Christensenellaceae、Odoribacteraceae、腸桿菌科、紫單胞菌科、螺旋體科、疣微菌科、瘤胃菌科、脫疏弧菌科、毛螺菌科相對豐度明顯增高（P＜0.05、0.01），乳桿菌科、S24-7和普雷沃氏菌科相對豐度明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，IPTS中劑量組大鼠腸道菌群中Marinilabiaceae、脫疏桿菌科、疣微菌科、毛螺菌科相對豐度顯著降低（P＜0.05、0.01），鞘氨醇桿菌科相對豐度顯著升高（P＜0.05）；IPTS高劑量組大鼠腸道菌群中Marinilabiaceae、脫疏桿菌科、產(chǎn)堿桿菌科、疣微菌科、毛螺菌科相對豐度顯著降低（P＜0.05、0.01），鞘氨醇桿菌科和氣球菌科相對豐度顯著升高（P＜0.05、0.01）。

圖5 科水平各組腸道菌群相對豐度Fig.5 Relative abundance of intestinal flora in each group at family level

3.5.3 屬水平腸道菌群相對豐度變化 如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠腸道菌群中乳酸桿菌屬Lactobacillus和普雷沃氏菌屬Prevotella相對豐度顯著降低（P＜0.05、0.01），密螺旋體屬Treponema、擬桿菌屬Bacteroides、Parabacteroides、Akkermansia、顫螺菌屬Oscillospira、毛螺菌屬Lachnospira、糞球菌屬Coprococcus、羅氏菌屬Roseburia、大腸桿菌屬Escherichia相對豐度顯著升高（P＜0.05、0.01）。與模型組比較，IPTS中劑量組大鼠腸道菌群中埃希菌屬、羅氏菌屬、毛螺菌屬、脫硫葉菌屬Desulfobulbus、脫硫弧菌屬Desulfovibrio、Akkermansia相對豐度顯著降低（P＜0.05、0.01），乳酸桿菌屬、布勞特氏菌屬Blautia相對豐度顯著升高（P＜0.05）；IPTS高劑量組大鼠腸道菌群中毛螺菌屬、脫硫葉菌屬、脫硫弧菌屬、薩特氏菌屬Sutterella、Akkermansia相對豐度顯著降低（P＜0.05、0.01），布勞特氏菌屬相對豐度顯著升高（P＜0.05）。

圖6 屬水平各組腸道菌群相對豐度Fig.6 Relative abundance of intestinal flora in each group at genus level

3.6 PICRUSt腸道菌群功能預測分析

通過STAMP軟件的PICRUSt分析各組大鼠腸道菌群的基因功能。部分預測代謝途徑結(jié)果見圖7，發(fā)生顯著變化的功能主要是細菌運動蛋白、細菌趨化性以及酶水平變化中的藥物代謝酶，發(fā)生顯著變化的代謝通路是核苷酸代謝中的嘧啶代謝和嘌呤代謝、脂質(zhì)代謝中的甘油磷脂代謝、氨基酸代謝中的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、賴氨酸降解。

圖7 腸道菌群功能預測結(jié)果Fig.7 Result of intestinal flora function prediction

PICRUSt功能預測結(jié)果表明，模型組大鼠腸道菌群中的細菌運動蛋白、細菌趨化性指標顯著升高（P＜0.01），表明AS大鼠腸道菌群中的微生物過度繁殖，而IPTS可顯著減少細菌運動蛋白（P＜0.05），減少病原菌的侵入；模型組腸道菌群中藥物代謝相關(guān)酶、嘌呤代謝、嘧啶代謝水平顯著低于對照組（P＜0.01），表明AS大鼠的核酸代謝受到抑制，經(jīng)IPTS干預后核酸代謝得到改善。

甘油磷脂由甘油、膽堿、絲氨酸等生成，甘油磷脂代謝屬于脂質(zhì)代謝，其代謝水平上升會導致脂質(zhì)在血管內(nèi)沉積，易引發(fā)AS等心血管疾病。模型組腸道菌群中的肽聚糖生物合成水平顯著下調(diào)（P＜0.01），甘油磷脂代謝水平上升；經(jīng)IPTS干預后，甘油磷脂代謝和肽聚糖生物合成得到改善。與對照組相比，模型組腸道菌群中的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝水平顯著下降（P＜0.01），纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成水平顯著上升（P＜0.05），賴氨酸降解水平上升；經(jīng)IPTS干預后，上述氨基酸代謝紊亂得到改善。

4 討論

本研究采用高脂飼養(yǎng)聯(lián)合ip維生素D3方法建立AS大鼠模型，對大鼠血脂、血管內(nèi)皮因子（NO、ET-1和Ang-II）和胸主動脈病理變化進行考察，結(jié)果顯示IPTS能夠改善AS大鼠的血管內(nèi)皮損傷，減少AS斑塊，且有一定的調(diào)脂作用。采用16S rRNA高通量測序方法分析IPTS對腸道微生物的作用，菌群差異分析和功能分析結(jié)果表明IPTS可以改變腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)組成，下調(diào)致病菌的相對豐度，抑制病原菌入侵以及改善部分腸道菌群基因功能，從而發(fā)揮治療AS的作用。

Emoto等[11]發(fā)現(xiàn)AS患者腸道菌群中厚壁菌門/擬桿菌門相對豐度增加，擬桿菌門數(shù)量減少。另有文獻報道厚壁菌門/擬桿菌門相對豐度與血脂變化相關(guān)[12]。IPTS組大鼠腸道菌群中擬桿菌門相對豐度降低，厚壁菌門相對豐度升高，表明IPTS可以改善AS大鼠的腸道菌群的結(jié)構(gòu)失衡，調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，從而發(fā)揮抗AS的作用。IPTS組大鼠腸道菌群中毛螺菌科相對豐度降低，Koren等[13]發(fā)現(xiàn)腸道中毛螺菌科相對豐度與LDL-C、TC水平呈正相關(guān)，LDL-C和TC升高會加劇AS，表明IPTS可能通過下調(diào)腸道菌群中的毛螺菌科相對豐度調(diào)節(jié)AS大鼠血脂水平。

腸道菌群中的雙歧桿菌、乳酸桿菌可以促進膽固醇排泄，提高機體的抗氧化能力[14-15]，口服益生菌可以預防小鼠AS的發(fā)展。王玲等[16]研究表明冠心病患者腸道中的大腸桿菌數(shù)量明顯增加，AS與致病菌數(shù)量上調(diào)有關(guān)。經(jīng)IPTS干預后，埃希菌屬相對豐度降低，推測IPTS可能通過下調(diào)致病菌來改善AS。雖然與對照組相比，模型組布勞特氏菌屬相對豐度沒有顯著變化，但經(jīng)IPTS干預后，布勞特氏菌屬相對豐度增加。Ozato等[17]發(fā)現(xiàn)布勞特氏菌屬與女性的內(nèi)臟脂肪面積呈負相關(guān)，且與性別無關(guān)，表明IPTS抗AS作用可能與上調(diào)布勞特氏菌屬有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突