野生歐洲李離體葉柄再生體系的建立*

陳 曦，耿文娟

（新疆農業(yè)大學園藝學院，烏魯木齊830052）

野生歐洲李（Prunus domesticaL.）俗名野酸梅，屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，為灌木或小喬木，樹高1.0～2.5 m，是新疆珍稀的野生植物之一[1-2]。自1980 年施麗首次在新疆新源縣交吾托海野果林發(fā)現(xiàn)，認為新疆伊犁天山野果林是歐洲李的唯一起源地[3-4]。之后有學者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其余6 處生存分布點，據(jù)調查表明，野生歐洲李僅分布在我國新疆伊犁地區(qū)的新源縣和鞏留縣，零散分布，個別分布點僅有幾株，其只有在溫濕的陰坡面或近水邊才能較好地生存，抗性較弱，且生長狀況逐年衰弱[5-8]。野生歐洲李因其含酸量高，適合加工成李產品，也具有藥用和營養(yǎng)價值，有一定的經濟效益，但野生分布的歐洲李還沒有開發(fā)利用[6,9]。當前由于生存環(huán)境惡劣、過度放牧開墾和人為破壞等因素，造成野生歐洲李種群數(shù)量逐年減少，生存面積驟縮，已處于瀕危狀態(tài)[10]。研究并建立多層次保護保存體系，對新疆野生歐洲李果樹資源的保護具有重要的現(xiàn)實意義。

近年來，植物組織培養(yǎng)技術在我國發(fā)展迅猛，不僅繁殖周期短、速度快，人為控制下可實現(xiàn)工廠化批量生產育苗，也對新品種的遺傳改良、種質資源的保存和瀕危植物種群數(shù)量的擴大有重要意義[11-13]。如今在核果類果樹育種應用上也越來越廣泛。在桃[14-15]、櫻桃[16-17]和杏[18-19]等果樹中報道較多，而關于李的研究報道較少，Nowak 等[20]以歐洲李試管苗上部第2～3 片完全展開的帶葉柄的葉片為試材，得到再生植株。櫻桃李作為歐洲李的親本之一，劉崇琪等[21]采用新疆野生櫻桃李試管苗葉片為試材也得到了再生植株。姚延興[22]則以歐洲李‘Tardicots’的葉柄為試材，不定芽的再生率可達83.33%。而針對野生歐洲李葉柄再生的研究還未有報道，組培苗葉柄和野外采摘的葉柄材料相比，污染低，分化能力強。因此，以近年來對野生歐洲李莖段和葉片組織培養(yǎng)的研究為基礎[23-25]，采用野生歐洲李試管苗幼嫩葉片上的葉柄作為外植體，探究暗培養(yǎng)時間、基礎培養(yǎng)基類型、植物生長調節(jié)劑種類及配比對葉柄離體再生的影響，期望建立高效穩(wěn)定的野生歐洲李葉柄離體培養(yǎng)再生植株體系，對野生歐洲李資源的保護提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新疆野生歐洲李組培苗材料采自新疆伊寧市新源縣交吾托海（野生歐洲李原生分布地之一），25 d 左右繼代1 次。取葉齡在25～30 d 的組培苗，選取上部分完全展開的3～6 片幼嫩葉片的葉柄作為外植體，接種到各處理的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱溫度為（25±1）℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 暗培養(yǎng)時間的篩選

設計5 組暗培養(yǎng)時間，依次為0、7、14、21、28 d，每個處理接種30 個外植體。培養(yǎng)基配方為B5＋0.2 mg/L 6-BA＋1.5 mg/L NAA＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂，pH 值為5.5±0.1，30 d 后統(tǒng)計離體葉柄不定芽誘導率，并觀察記錄生長狀況。

不定芽誘導率（%）＝（葉柄出芽數(shù)/接種總數(shù)）×100

1.2.2 基礎培養(yǎng)基類型的篩選

選取B5、WPM、MS（合肥巴斯夫生物科技有限公司）3 種不含瓊脂和蔗糖的基礎培養(yǎng)基，每個處理接種30 個外植體。培養(yǎng)基配方同1.2.1，30 d 后統(tǒng)計離體葉柄不定芽誘導率，并觀察記錄生長狀況。

1.2.3 初代培養(yǎng)中植物生長調節(jié)劑濃度配比的篩選

初代培養(yǎng)中基礎培養(yǎng)基選用B5＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂，植物生長調節(jié)劑選取6-BA（0.1、0.2、0.3 mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L），共15 個處理，每個處理接種30 個外植體，30 d 后統(tǒng)計離體葉柄不定芽誘導率，并觀察記錄生長狀況。

1.2.4 不定芽增殖培養(yǎng)中植物生長調節(jié)劑濃度配比的篩選

不定芽增殖培養(yǎng)中基礎培養(yǎng)基選用B5＋30 g/L蔗糖＋7 g/L 瓊脂，植物生長調節(jié)劑選取6-BA（0.5、0.6、0.7 mg/L）和NAA（0.2、0.3 mg/L），共6 個處理，每個處理接種15 個不定芽，30 d 后統(tǒng)計離體葉柄再生不定芽增殖系數(shù)，并觀察記錄生長狀況。

不定芽增殖系數(shù)＝30 d 后不定芽總數(shù)/接種前不定芽數(shù)

1.2.5 生根培養(yǎng)中植物生長調節(jié)劑濃度配比的篩選

待離體葉柄誘導的不定芽苗長到1.5 cm左右轉接到繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)1～2 次后可誘導生根。生根培養(yǎng)中基礎培養(yǎng)基選用1/2 MS 或B5＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂，植物生長調節(jié)劑選取IBA（0.4、0.5、0.6、0.7 mg/L），共8 個處理，每個處理接種10 瓶，每瓶接種1～2 個不定芽苗，30 d 后統(tǒng)計離體葉柄再生苗生根率，并觀察記錄生長狀況。

2 結果與分析

2.1 不同暗培養(yǎng)時間對離體葉柄誘導不定芽的影響

不同暗培養(yǎng)時間對葉柄不定芽誘導率有明顯影響，未經過暗培養(yǎng)的葉柄不定芽誘導率為0，褐化嚴重；暗培養(yǎng)21 d 處理的葉柄再生的不定芽長勢良好，不定芽誘導率最高，為33.3%；而暗培養(yǎng)28 d 處理的葉柄完全愈傷化，并分化出少量不定芽（表1，圖版1-A）。

表1 不同暗培養(yǎng)時間對離體葉柄誘導不定芽的影響

2.2 不同基礎培養(yǎng)基類型對離體葉柄誘導不定芽的影響

葉柄只有在B5 培養(yǎng)基中再生出不定芽，誘導率為26.7%，不定芽長勢好，未分化出不定芽的葉柄全部愈傷化，有松軟質地和偏硬質地2 種愈傷組織；在WPM 和MS 培養(yǎng)基中葉柄不定芽誘導率皆為0，愈傷組織生長狀況也較差（表2）。

表2 不同基礎培養(yǎng)基類型對離體葉柄誘導不定芽的影響

2.3 初代培養(yǎng)中不同植物生長調節(jié)劑濃度配比對離體葉柄誘導不定芽的影響

在B5 培養(yǎng)基中，添加不同濃度配比的植物生長調節(jié)劑6-BA 和NAA對葉柄再生不定芽有明顯影響，添加0.1 mg/L 6-BA 時，僅有處理1 再生出不定芽，長勢較弱，最后死亡。添加0.2 mg/L 6-BA時，處理7、8、9、10 均有不定芽再生，其中處理8 的誘導率最高，為30.0%，不定芽長勢好，生長健壯（圖版1-B、C）；處理9 有不定芽再生，同時也有不定根再生（圖版1-D），隨著NAA 濃度的增加，不定芽發(fā)生玻璃化現(xiàn)象。添加0.3 mg/L 6-BA 時，5 組處理均無不定芽再生，部分葉柄愈傷化（表3）。

表3 初代培養(yǎng)中不同植物生長調節(jié)劑濃度配比對離體葉柄誘導不定芽的影響

2.4 增殖培養(yǎng)中不同植物生長調節(jié)劑濃度配比對不定芽增殖的影響

以B5 作為增殖培養(yǎng)中的基礎培養(yǎng)基，隨著植物生長調節(jié)劑6-BA 濃度的增加，不定芽增殖效果更明顯，在添加0.7 mg/L 6-BA 時的增殖系數(shù)最高，為2.8，不定芽長勢好，葉綠且苗高；添加0.3 mg/L NAA 效果優(yōu)于0.2 mg/L NAA，處理2、4、6 的增殖系數(shù)明顯高于相同6-BA 濃度的其他3 個處理，梢的伸長生長效果也好，利于后續(xù)繼代培養(yǎng)（表4）。添加0.7 mg/L 6-BA 和0.3 mg/L NAA 的培養(yǎng)基中不定芽增殖和生長效果較好（圖版1-E）。

表4 增殖培養(yǎng)中不同植物生長調節(jié)劑濃度配比對不定芽增殖的影響

2.5 在B5 和1/2 MS 培養(yǎng)基中IBA 濃度對不定芽苗生根的影響

在B5 和1/2 MS 培養(yǎng)基中添加不同濃度的IBA，所有處理均有生根現(xiàn)象，但長勢不一，IBA 濃度相同的條件下，在B5 培養(yǎng)基中生根效果好于1/2 MS培養(yǎng)基，但這2 個培養(yǎng)基中生根率最高都為20%，隨著IBA 濃度的增加，長勢也越差，葉片發(fā)黃，根部褐化。在B5＋0.6 mg/L IBA 處理中，葉柄生根苗長勢好，20 d 左右后基部有根的發(fā)生，單根現(xiàn)象居多，培養(yǎng)一段時間根長8.0 cm 左右，且單根上有較多側根，有5～8 條，根基部都伴有少許愈傷組織（表5，圖版1-F）。

表5 在B5 和1/2 MS 培養(yǎng)基中IBA 濃度對不定芽苗生根的影響

3 討 論

3.1 暗培養(yǎng)時間對野生歐洲李離體葉柄再生不定芽的影響

在核果類果樹葉片組織培養(yǎng)的報道中，暗培養(yǎng)是影響葉片誘導愈傷組織和不定芽再生的重要因素之一。劉崇琪等[21]在新疆櫻桃李組培苗葉片誘導不定芽研究中發(fā)現(xiàn)，未經暗培養(yǎng)的葉片不能誘導不定芽，經過14 d 暗培養(yǎng)后的葉片誘導不定芽效果最好。劉航空等[26]也在誘導油桃葉片胚性愈傷組織的研究中發(fā)現(xiàn)，經暗培養(yǎng)21 d 時，有利于愈傷組織的產生，并進一步分化再生了8.0%的不定芽。歐洲李試管苗葉片（帶葉柄）離體培養(yǎng)也經過21 d 暗培養(yǎng)，誘導出不定芽并獲得了再生植株[22]。本試驗也得到了相同結果，發(fā)現(xiàn)在暗培養(yǎng)21 d 時，葉柄可直接再生不定芽或經過少量愈傷組織再生出不定芽，誘導率為33.3%。但在暗培養(yǎng)28 d 時，葉柄完全愈傷化，愈傷組織質地較硬，也再生出少量不定芽，而暗培養(yǎng)時間太短，則不能再生不定芽，說明只有適宜的暗培養(yǎng)時間才能使外植體再生不定芽。

3.2 基礎培養(yǎng)基類型對野生歐洲李離體葉柄再生的影響

基礎培養(yǎng)基是保證外植體存活狀況與生理活動的最基本物質，在核果類組織培養(yǎng)中，MS 培養(yǎng)基應用較廣泛，不同樹種選用的基礎培養(yǎng)基也不同。在李組織培養(yǎng)中，鄒英寧等[27]研究表明，1/2 MS培養(yǎng)基和WPM 培養(yǎng)基對‘海灣紅寶石’李莖段離體再生效果較好，生根率分別為10.4%和10.1%，生根倍數(shù)均為2.0。孫清榮等[28]對歐洲李‘紅艷1 號’莖段初代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)基礎培養(yǎng)基QL 比MS 有效，增殖培養(yǎng)時MS 培養(yǎng)基效果好于QL 和WPM。吳建華等[29]以歐洲李幼嫩莖段為試材，叢生芽的誘導和增殖在MS 培養(yǎng)基中效果最佳。在本試驗中，比較了B5、MS 和WPM 3 種基礎培養(yǎng)基對離體葉柄不定芽誘導的影響，發(fā)現(xiàn)只有在B5 培養(yǎng)基中再生出不定芽，MS 和WPM 培養(yǎng)基中不定芽誘導率均為0；在B5 和1/2 MS 培養(yǎng)基中均有生根現(xiàn)象，但在1/2 MS培養(yǎng)基中長勢較弱，表明B5 培養(yǎng)基對野生歐洲李離體葉柄再生效果最好，和前人研究結果一致。

3.3 植物生長調節(jié)劑種類及其濃度配比對野生歐洲李離體葉柄再生的影響

植物生長調節(jié)劑種類及其濃度配比對外植體愈傷組織的誘導、不定芽分化起關鍵作用，不同的品種選用的植物生長調節(jié)劑濃度也不同，也影響其生長狀況。彭麗萍等[30]選用6-BA＋2,4-D 組合對中國櫻桃試管苗葉片誘導愈傷組織，在部分含有葉柄的葉基部誘導率可達100%，在中國李‘Nubiana’離體葉柄培養(yǎng)中添加0.2 mg/L TDZ＋1.65 mg/L 2,4-D 對不定芽再生效果好，而在櫻桃李中添加1.8 mg/L 2,4-D 對不定芽再生效果好，二者誘導率分別為31.7%和36.7%[15]。在前期預試驗中也選用7.5 mg/L TDZ，對愈傷組織誘導較好，但未誘導出不定芽，而選取0.2 mg/L 6-BA＋1.5 mg/L NAA 對野生歐洲李離體葉柄不定芽再生效果好，當添加2.0 mg/L NAA 時，離體葉柄直接分化出不定根。中國李‘帥李’在生根培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L NAA，生根率為33.3%[31]。本研究中生根培養(yǎng)基中添加IBA 對不定芽誘導生根效果好，但生根率僅有10%～20%。在后續(xù)的研究中，可不斷優(yōu)化基礎培養(yǎng)基類型和植物生長調節(jié)劑種類及其濃度配比來提高生根率。

4 結 論

野生歐洲李試管苗葉柄最佳暗培養(yǎng)時間為21 d，適合初代培養(yǎng)誘導不定芽再生的培養(yǎng)基為：B5＋0.2 mg/L 6-BA＋1.5 mg/L NAA＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂，誘導率為30.0%；適合不定芽增殖的培養(yǎng)基為：B5＋0.7 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L NAA＋30 g/L蔗糖＋7 g/L 瓊脂，增殖系數(shù)為2.8；適合不定芽生根的培養(yǎng)基為：B5＋0.6 mg/L IBA＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂，生根率為20%，培養(yǎng)基pH 值均為5.5。