潘氏細(xì)胞為小腸干細(xì)胞提供微環(huán)境信號因子研究進(jìn)展

李艷麗，郭煜暉，劉 雨，熊正國，張長城，頓耀艷

(三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，宜昌 443002)

小腸干細(xì)胞(intestinal stem cells,ISCs)位于小腸隱窩(又名小腸腺)底部，具有強(qiáng)大增殖和分化能力，可分化為不同類型的腸上皮細(xì)胞。ISCs每3～6 d更新1次，以修復(fù)因大量外源性物質(zhì)攻擊而受損的小腸上皮細(xì)胞，因而ISCs的增殖和分化平衡是維持小腸上皮穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵[1]。ISCs能分化為成熟的潘氏細(xì)胞，但與其他成熟的腸上皮細(xì)胞不同，潘氏細(xì)胞在分化后向下移動，定居于隱窩底部，與ISCs在隱窩底部交叉排列[2-3]。由于特殊的生理位置，潘氏細(xì)胞對干細(xì)胞功能的影響受到廣泛關(guān)注。多個研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)的ISCs體外培養(yǎng)相比，ISCs與潘氏細(xì)胞共培養(yǎng)形成的類器官的數(shù)量明顯增加[4-5]，提示潘氏細(xì)胞對ISCs發(fā)揮正常功能具有重要意義。進(jìn)一步研究表明，ISCs的干性取決于其所在的隱窩微環(huán)境。隱窩微環(huán)境由ISCs附近的潘氏細(xì)胞和周圍的間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，它們特殊的凹形結(jié)構(gòu)減少ISCs與腸腔物質(zhì)接觸，形成一個相對穩(wěn)定的環(huán)境，并可提供多種信號因子，調(diào)控ISCs內(nèi)部關(guān)鍵信號通路，決定ISCs增殖和分化命運(yùn)，當(dāng)ISCs離開隱窩微環(huán)境，便失去增殖潛能，并向特定的方向分化，最終成為成熟的腸上皮細(xì)胞[6]。潘氏細(xì)胞相關(guān)微環(huán)境能提供多種信號因子調(diào)控ISCs內(nèi)多個信號通路，如Wnt、Notch、EGF、mTORC1等信號通路，對ISCs的增殖、分化發(fā)揮重要作用[6]。而潘氏細(xì)胞釋放的信號分子變化則可因改變ISCs增殖分化狀態(tài)，引起腸上皮穩(wěn)態(tài)失衡。本文就潘氏細(xì)胞為ISCs提供的微環(huán)境信號因子及其在腸上皮穩(wěn)態(tài)中的作用進(jìn)行綜述，旨在為相關(guān)的腸上皮穩(wěn)態(tài)失衡提供治療思路。

1 潘氏細(xì)胞為ISCs提供的微環(huán)境Wnt 信號因子

Wnt信號通路是ISCs增殖的關(guān)鍵信號通路，其中潘氏細(xì)胞是ISCs上皮Wnt配體的主要來源，能表達(dá)多種Wnt配體，如Wnt3、Wnt6和Wnt9b[7]。相關(guān)研究表明，Wnt配體溶解性較差，主要由細(xì)胞間的直接接觸傳遞。Wnt蛋白在細(xì)胞內(nèi)被翻譯后，于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)進(jìn)行修飾，如被?；D(zhuǎn)移酶PORC(porcupine)棕櫚?；闹|(zhì)修飾、N-糖基化修飾，修飾完成后與高爾基體膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Wnless通過棕櫚油酸部分結(jié)合，由囊泡運(yùn)送至細(xì)胞膜分泌[8]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠腸上皮細(xì)胞囊泡運(yùn)輸調(diào)控基因Rab8a，位于潘氏細(xì)胞頂端或基底外側(cè)質(zhì)膜的Wnless蛋白GPR177明顯減少，而位于溶酶體的GPR177增多，腸隱窩Wnt信號活性明顯降低[9]，表明Rab8a敲除后潘氏細(xì)胞內(nèi)Wnt蛋白囊泡運(yùn)輸至溶酶體增多，導(dǎo)致潘氏細(xì)胞Wnt蛋白的分泌減少。潘氏細(xì)胞分泌的Wnt3配體通過旁分泌途徑覆蓋在ISCs的細(xì)胞膜表面，并隨著細(xì)胞分裂離開ISCs，形成獨(dú)特的以隱窩底部濃度最高的Wnt3信號濃度梯度，這是Wnt信號濃度梯度從隱窩底部至絨毛部依次向上遞減的原因之一[7]。

Wnt信號通路在ISCs中的具體過程：Wnt配體與ISCs膜表面受體FZD(frizzled)、LRP5/6(low density lipoprotein receptor related protein5/6)結(jié)合，經(jīng)過一系列反應(yīng)后，阻斷β-連環(huán)蛋白(β-catenin，β-cat)磷酸化降解，導(dǎo)致β-cat與核轉(zhuǎn)錄因子TCF4(T cell factor)結(jié)合增多，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生等相關(guān)基因[10]。因此，該信號通路異?；罨瘜?dǎo)致ISCs過度增殖，形成異常隱窩甚至發(fā)展為腫瘤[2,11]。Wnt靶基因Sox9參與ISCs分化為潘氏細(xì)胞的過程，通過上調(diào)Wnt信號通路促進(jìn)Sox9表達(dá)，能誘導(dǎo)潘氏細(xì)胞增多[12]，而增多的潘氏細(xì)胞又能為ISCs提供更多Wnt3配體[13]。由此可見，潘氏細(xì)胞能激活I(lǐng)SCs的Wnt信號通路，激活的Wnt信號通路又能通過增加ISCs分化為潘氏細(xì)胞的數(shù)量，形成一個正反饋。

不同病理情況下，潘氏細(xì)胞能通過Wnt信號通路影響腸上皮的穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)：衰老小鼠潘氏細(xì)胞分泌的Wnt3配體減少，ISCs內(nèi)Wnt信號通路下調(diào)，隱窩數(shù)量減少[14]。Pentinmikko等[15]研究顯示，與青年鼠相比，衰老小鼠小腸潘氏細(xì)胞分泌更多的Notum，Notum為Wnt抑制劑，可使Wnt配體去?；?，因而導(dǎo)致Wnt配體與ISCs膜上的受體分離，局部Wnt活性降低，衰老小鼠ISCs的增殖能力減弱。以上衰老相關(guān)研究表明，衰老小鼠ISCs增殖能力減弱、腸上皮穩(wěn)態(tài)失調(diào)與細(xì)胞內(nèi)Wnt信號抑制密切相關(guān)，其中，潘氏細(xì)胞通過減少Wnt配體分泌，并增加Wnt抑制劑Notum分泌發(fā)揮重要作用。在DSS誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥中，ISCs顯著減少，腸上皮穩(wěn)態(tài)失衡；而成熟的潘氏細(xì)胞內(nèi)Wnt信號通路被激活，并重新進(jìn)入細(xì)胞周期，去分化而獲得自我更新和多能干細(xì)胞特性，維持干細(xì)胞的功能，促進(jìn)受損腸上皮的修復(fù)和再生[16]。潘氏細(xì)胞提供的Wnt信號分子對維持腸上皮穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠小腸Wnt信號水平明顯降低、干細(xì)胞增殖能力減弱、小腸上皮發(fā)生退行性變化[17]；對高脂飲食小鼠研究發(fā)現(xiàn)，腸道Wnt/β-cat信號通路明顯上調(diào)，ISCs過度增殖[18]，潘氏細(xì)胞在其中功能的變化值得進(jìn)一步研究。

圖 1 潘氏細(xì)胞為小腸干細(xì)胞提供微環(huán)境信號因子Figure 1 Microenvironment signaling factors of intestinal stem cells provided by Paneth cells

2 潘氏細(xì)胞為ISCs提供的微環(huán)境Notch 信號因子

Notch信號通路在調(diào)控ISCs分化命運(yùn)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究顯示，Notch配體及其受體均為跨膜蛋白，主要存在于兩個細(xì)胞的間隙中，是腸隱窩中作用最短的信號因子，故ISCs膜表面的Notch受體主要由鄰近潘氏細(xì)胞的Notch配體Dll 1(delta-like 1)和Dll 4激活[13]。Notch配體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體進(jìn)行糖基化、泛素化等修飾后，通過囊泡被運(yùn)輸至細(xì)胞膜。RFNG (radical fringe)高表達(dá)于潘氏細(xì)胞高爾基體，是一種能調(diào)節(jié)Notch配體活性的糖基轉(zhuǎn)移酶，將RFNG基因敲除的ISCs體外培養(yǎng)形成類器官，發(fā)現(xiàn)由RFNG基因敲除ISCs分化而來的潘氏細(xì)胞表面的配體Dll 1和Dll 4減少，ISCs的Notch活性減弱，形成的類器官數(shù)量減少[19]。

Notch信號通路的具體過程：Notch配體和受體結(jié)合后，受體胞外區(qū)構(gòu)象變化，暴露ADAM(a disintegrin and metalloprote)家族金屬蛋白酶裂解位點(diǎn)，引起胞外段結(jié)構(gòu)域斷裂，Notch受體截余部分作為γ-分泌酶的作用底物，經(jīng)蛋白水解反應(yīng)剪切后釋放轉(zhuǎn)錄因子NICD(notch intracellular domain)[20]。NICD能結(jié)合靶基因啟動子區(qū) RBP-J，促進(jìn)堿性環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子Hes1轉(zhuǎn)錄，同時抑制堿性環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子Atoh1轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致ISCs更多地分化為吸收系細(xì)胞，減少分泌系細(xì)胞的分化[ 21]。

潘氏細(xì)胞Notch配體變化可影響ISCs的數(shù)量和腸上皮穩(wěn)態(tài)。由RFNG基因敲除ISCs分化而來的潘氏細(xì)胞表面Notch配體減少，能明顯減少體外培養(yǎng)形成的類器官、Lgr5+干細(xì)胞數(shù)量[19]。感染胃腸炎病毒后，仔豬小腸Lgr5+干細(xì)胞更多地分化為杯狀細(xì)胞，絨毛明顯萎縮，提示病毒感染后腸上皮穩(wěn)態(tài)失衡。進(jìn)一步研究表明，病毒能影響潘氏細(xì)胞Dll 4啟動子的活性，降低Dll 4表達(dá)水平，通過Notch信號通路抑制Lgr5+干細(xì)胞的增殖和正常分化，導(dǎo)致腸道穩(wěn)態(tài)失衡[22]。衰老相關(guān)研究表明，衰老小鼠小腸發(fā)生退行性變化與Notch信號水平下調(diào)有關(guān)[14]。本課題組前期研究也表明，衰老大鼠回腸Notch信號通路下調(diào)[23]，但衰老大鼠潘氏細(xì)胞Notch配體表達(dá)是否下調(diào)仍有待進(jìn)一步研究。

ISCs內(nèi)的Wnt信號通路與Notch信號通路存在相互作用，共同調(diào)節(jié)ISCs的分化。Notch和Wnt能共同調(diào)控基因Bmi1的表達(dá)，該基因表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)小鼠ISCs增殖和吸收系細(xì)胞分化[24]。Van等[20]研究發(fā)現(xiàn)，抑制小鼠小腸Notch信號通路，隱窩內(nèi)Wnt信號通路異?；罨琁SCs大量分化為杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞，運(yùn)用Wnt抑制劑能恢復(fù)ISCs的正常分化水平，表明Noch信號能抑制Wnt信號通路，維持隱窩適當(dāng)?shù)腤nt信號水平，調(diào)控干細(xì)胞的增殖和分化。激活的Wnt信號通路能增加腸上皮細(xì)胞Notch信號通路的穩(wěn)定性[25]。由此可見，兩個信號通路之間的關(guān)聯(lián)具有復(fù)雜性。潘氏細(xì)胞如何協(xié)調(diào)兩個信號通路保持在合適的水平，以及其中的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3 潘氏細(xì)胞為ISCs提供的微環(huán)境EGF信號因子

潘氏細(xì)胞能分泌表皮生長因子EGF和轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)，作用于細(xì)胞膜上高表達(dá)EGF受體的ISCs，激活I(lǐng)SCs的EGF信號通路[13]。間質(zhì)細(xì)胞通過囊泡運(yùn)輸向ISCs提供EGF配體[26]，但潘氏細(xì)胞提供EGF配體的途徑尚未見報道，仍需進(jìn)一步研究。

EGF配體是腸道類器官培養(yǎng)基的核心成分之一，能明顯增強(qiáng)ISCs的增殖能力[6]。EGF信號通路主要通過RI3K/PIP3/AKT軸和SOS/RAS/MEK/ERK軸發(fā)揮作用[27-28]。EGF信號通路可影響多個ISCs增殖和分化相關(guān)通路。首先，EGF可調(diào)控Wnt 信號通路：激活EGF信號通路促進(jìn)Akt 發(fā)生磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜E-鈣粘著蛋白(e-cadherin，e-cad)復(fù)合物中的β-cat發(fā)生磷酸化，并脫離 E-cad復(fù)合物，增加細(xì)胞質(zhì)中游離β-cat的水平，上調(diào)Wnt 信號通路[29]。日糧中添加EGF的仔豬小腸隱窩Wnt信號水平上調(diào)，小腸上皮潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量增加，表明EGF促進(jìn)仔豬小腸增殖和分泌系細(xì)胞分化，且與Wnt 信號通路活化相關(guān)[30]。其次，EGF可調(diào)控mTORC1信號通路：EGF通過磷酸化AKT促進(jìn)Rheb(ras homolog enriched in brain)的去泛素化，使Rheb從TSC(tuberous sclerosis protein)中釋放，將被招募到溶酶體表面的mTORC1蛋白激活[31]。磷酸化的Akt通過引起細(xì)胞內(nèi)L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3的穩(wěn)定和膜定位增加，促進(jìn)亮氨酸的攝取，激活mTORC1信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的多種蛋白質(zhì)合成[32]。

4 潘氏細(xì)胞與ISCs相關(guān)的微環(huán)境mTORC1信號通路

mTORC1信號通路是機(jī)體重要的能量感受機(jī)制，可感知機(jī)體營養(yǎng)狀態(tài)，mTORC1激酶通過磷酸化p70核糖體S6激酶(S6K1)促進(jìn)核糖體蛋白S6磷酸化驅(qū)動蛋白質(zhì)合成，調(diào)控細(xì)胞的代謝與生長[31]。潘氏細(xì)胞和ISCs內(nèi)均存在mTORC1信號通路。潘氏細(xì)胞的mTORC1信號通路可通過多種機(jī)制影響ISCs的功能。

Pentinmikko等[15]研究表明，進(jìn)行熱量限制時潘氏細(xì)胞內(nèi)mTORC1信號通路明顯抑制，從而增加骨基質(zhì)抗原1(bone stromal antigen 1)的表達(dá)，促進(jìn)環(huán)腺苷二磷酸核糖(cyclic adenosine diphosphate ribose，cADPR)形成和旁分泌，導(dǎo)致ISCs更傾向于自我更新而非分化。在熱量限制中，小鼠潘氏細(xì)胞分泌的cADPR激活鄰近ISCs中SIRT1和mTORC1信號通路，SIRT1通過促進(jìn)S6K1去乙?；鰪?qiáng)mTORC1激酶磷酸化S6K1的作用，增加ISCs蛋白質(zhì)合成、自我更新和隱窩擴(kuò)張[33]。因而，熱量限制相關(guān)研究表明，在機(jī)體的營養(yǎng)狀況發(fā)生變化時，ISCs并不直接感受能量的信號，而是由潘氏細(xì)胞內(nèi)mTORC1信號通路發(fā)生變化感知能量信號，并分泌因子cADPR作用于ISCs，調(diào)控ISCs內(nèi)mTORC1信號通路，促進(jìn)ISCs增殖。

衰老小鼠的小腸潘氏細(xì)胞mTORC1信號通路活化，抑制過氧化物酶體增殖物激活受體α作用增強(qiáng)，導(dǎo)致潘氏細(xì)胞分泌的Notum增加，通過Wnt信號通路抑制衰老小鼠ISCs的增殖能力[15]。衰老小鼠ISCs中的mTORC1信號通路異常激活，小腸發(fā)生絨毛和隱窩數(shù)量減少、增殖水平降低、電離輻射刺激后上皮恢復(fù)能力降低等一系列退行性變化，通過雷帕霉素治療抑制異?；罨膍TORC1信號，能挽救衰老小鼠這一系列變化，表明衰老小鼠腸上皮退行性變化與ISCs中的mTORC1信號通路異常激活有關(guān)[34]；衰老果蠅的相關(guān)研究表明，衰老導(dǎo)致腸上皮干細(xì)胞丟失與干細(xì)胞內(nèi)mTORC1信號的反復(fù)激活密切相關(guān)[35]。衰老的ISCs增殖能力減弱、數(shù)量減少與潘氏細(xì)胞和ISCs中mTORC1信號通路活化有關(guān)，但潘氏細(xì)胞是否參與ISCs中mTORC1信號通路的激活尚不清楚。

5 其他

潘氏細(xì)胞進(jìn)行糖酵解產(chǎn)生的乳酸鹽是支持ISCs功能所必需的。潘氏細(xì)胞能量代謝的方式主要為無氧酵解，其最終產(chǎn)物主要為乳酸鹽和氫離子；ISCs則表現(xiàn)出更強(qiáng)的線粒體活性，通過線粒體氧化磷酸化的有氧途徑提供能量[36]。抑制潘氏細(xì)胞糖酵解與抑制ISCs線粒體氧化磷酸化，均可影響ISCs的功能；體外小鼠ISCs培養(yǎng)，加入乳酸鹽比加入葡萄糖形成的類器官多，表明潘氏細(xì)胞糖酵解的能量代謝方式可影響干細(xì)胞的功能，潘氏細(xì)胞經(jīng)過糖酵解產(chǎn)生乳酸鹽，能提供給鄰近ISCs。乳酸鹽在ISCs內(nèi)能氧化為丙酮酸，增強(qiáng)ISCs線粒體氧化磷酸化，并通過線粒體活性氧激活下游p38 MAPK信號通路，誘導(dǎo)ISCs增殖和分化，促進(jìn)隱窩形成[36-37]。

6 總結(jié)與展望

潘氏細(xì)胞是ISCs的重要微環(huán)境信號因子提供者，目前大量研究證實其能直接提供Wnt、Notch、EGF等因子影響ISCs的增殖與分化，也能通過mTORC1信號通路影響干細(xì)胞的功能；近期研究更是開始關(guān)注潘氏細(xì)胞內(nèi)部的代謝變化對ISCs的影響。隨著老齡化社會的到來，衰老的研究日益受到重視，大量研究顯示衰老時ISCs的功能減退。同樣，隨著生活水平的提高，高脂飲食所致的各種疾病也越來越多，研究發(fā)現(xiàn)高脂時小腸干細(xì)胞增殖活躍甚至?xí)?dǎo)致腸道腫瘤的發(fā)生。作者所在課題組也發(fā)現(xiàn)在衰老和高脂時，小腸干細(xì)胞Wnt信號通路或Notch信號通路都會發(fā)生明顯改變，影響干細(xì)胞功能[17-18,23]。但是小腸干細(xì)胞增殖分化功能在不同情況下的變化都與干細(xì)胞微環(huán)境的改變密切相關(guān)，因而研究者們逐漸認(rèn)識到潘氏細(xì)胞在其中的重要作用。就目前的研究進(jìn)展來看還存在以下問題：(1)潘氏細(xì)胞分泌的ISCs微環(huán)境因子在不同情況下的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)制目前研究較少；(2)潘氏細(xì)胞內(nèi)部其他信號通路(如自噬、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等)如何間接影響Wnt、Notch、EGF等因子的表達(dá)水平；(3)潘氏細(xì)胞內(nèi)部代謝相關(guān)研究較少；(4)潘氏細(xì)胞分泌防御素等炎癥因子是否與ISCs微環(huán)境因子相關(guān)也值得關(guān)注。對潘氏細(xì)胞進(jìn)一步研究，有望揭示在不同病理條件下潘氏細(xì)胞功能的變化導(dǎo)致ISCs關(guān)鍵信號通路不平衡的機(jī)制，并提供新的防治思路。