光對高等真菌次級代謝影響的研究進展

張宗源，潘夢詩，郭文陽，岳丹丹，張英濤，亓蘭達

(河南省科學院 生物研究所,鄭州 450008)

真菌物種豐富，被認為是陸地和水生生物中最大的生物多樣性資源之一。真菌在長期演化過程中形成了可以產(chǎn)生多類型、多功能的次級代謝物代謝機制，這些次級代謝產(chǎn)物有利于真菌爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，可抵御惡劣的生存環(huán)境，實現(xiàn)自我保護[1]，完成細胞增殖、分化和整個生命周期，并可作為與環(huán)境中生物交流的信號分子[2]。不僅如此，豐富的真菌次級代謝物結(jié)構(gòu)新穎，骨架豐富，活性獨特，是現(xiàn)代新藥研發(fā)的重要來源，在疾病治療中發(fā)揮巨大作用[3]。目前在臨床上有重要應(yīng)用價值的抗生素、免疫調(diào)節(jié)劑、降血脂、膽固醇等藥物多數(shù)源于真菌的次級代謝物[4]。由于真菌次級代謝物具有重要應(yīng)用價值，所以次級代謝研究一直是研究熱點。

環(huán)境因素對真菌次級代謝生物合成起著重要的作用。光是最重要的環(huán)境因素之一，它對生物體的生理和行為產(chǎn)生決定性影響，真菌也不例外。在長期進化過程中，真菌形成精細且復雜的光感應(yīng)系統(tǒng)，它們通過光敏蛋白和特異的信號網(wǎng)絡(luò)傳導途徑將感受到的光信號(有光或無光、光的方向、光質(zhì)、光強等)轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W和生物信號，并做出反應(yīng)以更好地適應(yīng)環(huán)境[5]。本文對近年真菌光生物學研究進行概述，介紹光對真菌天然活性次級代謝物合成的影響及其分子調(diào)控機制的研究。

1 真菌的光生物學研究

光以一種被稱為光子的粒子形式存在，具有波粒二象性，根據(jù)不同的波長將其分為紫外輻射區(qū)(<380 nm)、可見光(380～780 nm)、紅外輻射區(qū)(>780 nm)[6]。光為真菌提供重要的環(huán)境信息，真菌的光反應(yīng)接近于人類視覺，即從藍/近紫外區(qū)(450 nm)到近紅外區(qū)(700 nm)。在紅曲霉(Monascus)光生物學研究中，黑暗條件促進其營養(yǎng)生長，且分生孢子數(shù)量以及閉囊殼的數(shù)量明顯大于光照條件[7]。光質(zhì)對真菌也有不同程度的影響，藍光和(或)紅光會抑制構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)[8]、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)[9]、禾柄銹菌(Pucciniagraminis)[10]等真菌孢子的萌發(fā)，除了藍光和紅光之外，最近的研究表明，綠光可以抑制灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的孢子萌發(fā)，并在該反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)了一個功能未知的視蛋白[11]。在靈芝菌絲體培養(yǎng)過程中，藍光促進靈芝菌絲體生長，綠光生長的最慢，同時不同光質(zhì)對靈芝菌絲體生長形態(tài)也有顯著影響，藍光處理菌絲體生長密實，紅光和黃光處理菌絲體生長蓬松，綠光處理菌絲體生長則為前期較稀薄，后期密實[12]。

光在大型真菌由營養(yǎng)生長階段轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L階段的發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。在人工栽培食藥用菌中，光照對香菇菌棒的轉(zhuǎn)色起到重要作用，相比黑暗環(huán)境，光照條件下香菇菌絲體轉(zhuǎn)色正常[13]。光作為環(huán)境因子之一，對食藥用菌生長具有調(diào)控作用，錢磊等[14]的文章中詳細闡述了光質(zhì)、光強、光周期對菌絲體生長、原基形成和子實體形態(tài)的影響。

2 光對真菌次級代謝產(chǎn)物生物合成的影響

真菌次級代謝物種類豐富，是天然藥物的重要來源之一，絲狀真菌例如半知菌類曲霉科青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和頭孢菌屬(Cephalosporium)等菌株產(chǎn)生的次級代謝物廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥生產(chǎn)中。大型真菌如靈芝、香菇、蟲草等被稱為食藥用真菌，也是重要的天然活性物質(zhì)來源[15]。真菌天然活性產(chǎn)物按照其合成途徑歸類為萜類，如靈芝酸、β-胡蘿卜素等；多糖，如靈芝胞外多糖等；非核糖體多肽，如青霉素等；聚酮類，如紅曲素、美伐他汀、竹紅菌甲素等；生物堿，如蟲草素等(圖1)。

圖1 真菌中具有代表性天然產(chǎn)物Figure 1 Representatives of fungal natural products

2.1 光對萜類化合物生物合成的影響

萜類化合物(萜烯類或者類異戊二烯)大多具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等功效。蛇孢菌素(ophiobolin A)是玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)產(chǎn)生的具有抗腫瘤活性的二倍半萜類化合物，白光處理可以促進其生物合成，藍光、綠光、紅光、黃光則起到抑制作用[16]。類胡蘿卜素是一類基本結(jié)構(gòu)單位為異戊二烯的天然產(chǎn)物。藍光能誘導蛹蟲草菌絲體以及子實體類胡蘿卜素的積累，失活蛹蟲草中藍光受體基因(Cmwc-1)導致類胡蘿卜素產(chǎn)量降低[17]。通過控制光照和(或)黑暗能夠獲得四萜類化合物β-類胡蘿卜素高產(chǎn)菌(MucorcircinelloidesMU218)[18]。藍光對促進靈芝菌絲體三萜類化合物靈芝酸的積累優(yōu)于其他光質(zhì)，綠光和藍光處理對提高靈芝酸種類有明顯優(yōu)勢[12]。可見不同光質(zhì)對同種萜類化合物有不同的影響，藍光在誘導類胡蘿卜素、蟲草素和靈芝三萜類化合物具有促進作用。

2.2 光對多糖生物合成的影響

靈芝出菇實驗發(fā)現(xiàn)不同光質(zhì)影響不同時期靈芝多糖含量：現(xiàn)蕾期黃、藍光有利于靈芝多糖含量積累；開傘期藍光有利于靈芝多糖含量積累；彈孢后期綠光、藍光、紅光均能促進靈芝多糖積累[19]，而紅、藍光照射后有利于液體發(fā)酵靈芝胞內(nèi)多糖的積累[20]。液體發(fā)酵條件下，藍光抑制胞內(nèi)多糖積累[21]，但是促進胞外多糖積累[22]。光不僅影響真菌多糖的積累，還影響多糖中單糖組分的含量。Puchkova 等[23]發(fā)現(xiàn)紅、藍光照射蛹蟲草菌絲體后液體發(fā)酵，胞內(nèi)多糖中葡萄糖組分百分含量增加，甘露糖組分和半乳糖組分含量降低；紅、藍光照射后，靈芝液體發(fā)酵中胞內(nèi)多糖中甘露糖百分含量升高，葡萄糖含量降低[20]。由此可見，在不同生長時期，光對真菌多糖合成具有不同影響。此外，光質(zhì)還影響真菌多糖單糖組分比例。

2.3 光對非核糖體多肽類化合物生物合成的影響

真菌可通過非核糖體途徑合成一系列低分子量多肽類次級代謝產(chǎn)物，這種多肽類化合物統(tǒng)稱為非核糖體肽(non-ribosomal peptides，NRPs)，其通常具有抗菌、抗病毒、抗癌等生物活性。常見的非核糖體多肽有青霉素G、環(huán)孢菌素A和博來霉素。Spr?te等[24]證明了光調(diào)控蛋白VeA的缺失會抑制青霉素的生物合成。Wang等通過構(gòu)建△CsVosA(VeA組件)禾旋孢腔菌(Cochliobolussativus)突變株，發(fā)現(xiàn)兩個非核糖體多肽合成酶(NRPs)基因表達下調(diào)[25]。

2.4 光對聚酮類化合物生物合成的影響

光質(zhì)對聚酮類活性物質(zhì)合成的影響與種屬有關(guān)，光照強度對聚酮類化合物一定影響。Zhang等[26]研究表明紅光、藍光、綠光處理Haloroselliniasp.(No.1403)1403R和1403C產(chǎn)量增加76%。紅曲色素是由Monascus產(chǎn)生的聚酮類色素，其生物合成與光照(藍光)強度和時間有關(guān)[27-28]。發(fā)酵前期光處理會抑制橘青霉(Penicilliumcitrinum)產(chǎn)聚酮類化合物美伐他汀(Mevastatin)[29]。竹紅菌素(hypocrellin)是竹黃菌(ShiraiabambusicolaP.Hennigs)主要有效成分，是一種苝醌類色素，屬聚酮類化合物，紅光可促進竹紅菌素合成，藍光則會抑制[30]。

2.5 光對生物堿類化合物生物合成的影響

蛇足石杉中的石杉堿，是吡啶酮類生物堿，研究表明黑暗處理比光照更有利于蛇足石杉內(nèi)生菌石衫堿的積累[31]。蟲草素屬嘌呤類生物堿，具有抑制微生物、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功效，液體發(fā)酵蛹蟲草，藍光處理蛹蟲草產(chǎn)量最高[32]，通過失活蛹蟲草中藍光受體基因(Cmwc-1)，蟲草素產(chǎn)量降低[17]。

2.6 光對其他活性物質(zhì)生物合成的影響

二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)是具有促進腦部發(fā)育和抗動脈粥樣化功效的不飽和脂肪酸。粉核油球藻(Pinguiococcuspyrenoidosus)在光照強度為100 μmol /(m2·s)時產(chǎn)生的EPA比例最高[33]。霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)是從短密青霉(Penicilliumbrevicompactum)發(fā)酵液中分離的一種具有多種活性的酶抑制劑。光照強度以及光質(zhì)對其合成有不同影響，光強為1 400 Lx時MPA濃度最高，紅光對MPA的合成有促進作用，藍光產(chǎn)生抑制[34]。在A.nidulans中，白光可以促進亞鐵血紅素的合成，可能跟VeA互作蛋白(VipA)有關(guān)[35]。

3 光調(diào)控真菌次級代謝分子機制研究

在光響應(yīng)研究中首要任務(wù)是要了解真菌如何感受到光。真菌感知光的能力與感光蛋白有關(guān)，不同的光受體蛋白能感應(yīng)特定波段的光質(zhì)。光受體蛋白的種類、結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)有了較為全面的研究[5]，光調(diào)控真菌次級代謝及其分子機制研究也越來越深入(表1)。真菌次級代謝的分子調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯以及表觀遺傳等多個層次上，有大量蛋白參與的復雜過程，其中不乏光作為重要的環(huán)境因子通過影響表觀遺傳因子(DNA甲基化酶Dnmt，組蛋白乙?；窰DA等)、全局調(diào)控因子(LaeA，VeA，VelB等)和途徑特異性調(diào)控因子調(diào)控真菌次級代謝(圖2)。

表1 幾種主要活性物質(zhì)及光調(diào)控分子機制Table1 Several main bioactive compounds and molecular mechanisms of light regulation

圖2 光調(diào)控真菌次級代謝的分子機制Figure 2 Molecular mechanism of light regulation of fungal secondary metabolism

表觀遺傳對真菌次級代謝物合成具有調(diào)控作用，其主要研究內(nèi)容為DNA甲基化和組蛋白乙?；?。DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基基團，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化作用下，將甲基基團轉(zhuǎn)移到DNA分子的堿基中，在真菌中，DNA甲基化發(fā)生在胞嘧啶上，而形成5-甲基胞嘧啶主要是在CpG二核苷酸上，DNA甲基化通過改變DNA穩(wěn)定性、DNA構(gòu)象、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等控制基因的表達，其中甲基化抑制基因表達，去甲基化促進基因的活化和表達。光照可誘導生物體基因組的甲基化和去甲基化[38]；肖冬來等[39]研究表明光照可誘導廣葉繡球菌(Sparassislatifolia)菌絲去甲基化，表明在光照條件下其更多基因表達。組蛋白乙酰化是組蛋白的乙?；?，是通過組蛋白乙?；?HAT)和組蛋白去乙?；?HDAC)來調(diào)控，根據(jù)組蛋白乙?；c去乙?；嗷マD(zhuǎn)變，就猶如基因的開關(guān)，可以控制基因的表達與沉默。組蛋白乙?；梢杂绊懻婢渭壌x物的生物合成。Osorio-concepción等[40]的研究中發(fā)現(xiàn)深綠木霉(Trichodermaatroviride)的組蛋白去乙?；窰DA-2是由光誘導的。以上結(jié)果均表明光可通過表觀遺傳調(diào)控真菌次級代謝。

全局性調(diào)控是指由全局性調(diào)控因子參與并對多個次級代謝物生物合成以及形態(tài)分化進行的調(diào)控。全局調(diào)控因子在真菌次級代謝調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。其主要研究內(nèi)容為Velvet蛋白和LaeA全局調(diào)控因子，而這兩種蛋白都直接或間接受到光的調(diào)節(jié)。Velvet家族主要包含有VeA、VelB、VosA和VelC，其中VeA蛋白是光依賴性的無性/有性發(fā)育和次級代謝的全局調(diào)控因子，研究表明它與VelB、LaeA(loss of aflR expression A)形成異源三聚體系統(tǒng)調(diào)控構(gòu)巢曲霉的生長發(fā)育和次級代謝[41]。光可以影響VeA蛋白在細胞質(zhì)和細胞核的分布，從而影響其功能的發(fā)揮。在真菌體內(nèi)，VeA為橋梁與其家族成員或LaeA及其家族成員形成復合物，直接或間接調(diào)控真菌有性、無性發(fā)育和次級代謝物的合成[42]。同時VeA蛋白還能夠與紅光受體蛋白相互作用，在構(gòu)巢曲霉中其與紅光受體蛋白FphA的組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域相互作用，且與LreA/LreB二聚體形成VeA-FphA-LreA-LreB光復合物[43]，但目前還不清楚該復合物是如何調(diào)控真菌光依賴性的生長發(fā)育和次級代謝。

相對于全局性調(diào)控，光對真菌次級代謝還存在途徑特異性調(diào)控，目前該方面研究較少。以光誘導類胡蘿卜素合成為例，crgA基因是在研究絲狀真菌光誘導類胡蘿卜素生物合成過程中發(fā)現(xiàn)的一個關(guān)鍵負調(diào)控因子，其對類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)合成基因發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。該基因受光的調(diào)控，其表達產(chǎn)物具有泛素連接酶活性，通過催化類胡蘿卜素合成過程中其他蛋白泛素化來調(diào)控類胡蘿卜素的合成[44]。由此推測在光的影響下，途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子基因表達受到調(diào)控，進而調(diào)控相關(guān)次級代謝基因簇的表達。

4 總結(jié)與展望

真菌因能生產(chǎn)有價值的天然化合物而受到高度重視，其次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎，骨架豐富，活性獨特，通常具有抗菌、抗腫瘤和抗氧化等特性，是現(xiàn)代新藥研發(fā)的重要來源。然而這類化合物產(chǎn)率很低，不足以大規(guī)模提取與純化。為了解決這一限制，通常通過發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、基因水平修飾和外源刺激等方法策略來提高該類化合物的生物合成。而光作為一種重要的環(huán)境信號，顯然是一種有效、環(huán)保、清潔的能源和低成本的方法來調(diào)節(jié)真菌次級代謝物的生產(chǎn)。目前以LED為理想的光環(huán)境調(diào)控設(shè)施已經(jīng)應(yīng)用到食藥用菌生產(chǎn)[45-46]。今后可以在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中加強LED的應(yīng)用以提高藥源真菌的活性成分。

隨著光生物學研究的深入，越來越多的真菌光受體蛋白被發(fā)現(xiàn)，從光信號向生物信號轉(zhuǎn)化出現(xiàn)了意想不到的復雜性。以目前的研究還不足以呈現(xiàn)出完整的真菌光響應(yīng)信號通路圖。雖然大多真菌有類似的光響應(yīng)現(xiàn)象，但在不同的真菌種屬間其調(diào)控機制存在差異。目前研究較為深入的為模式真菌N.crassa中的WCC蛋白復合體及其如何感知并傳遞光信號。然而為什么真菌可以感知不同的光色？推測其原因跟大自然環(huán)境競爭有很大關(guān)系。如在森林冠層環(huán)境中，綠光占主要優(yōu)勢[47]，同樣的已有研究表明紅光比藍光更容易穿透土壤[48]。同時，真菌對不同的光照強度做出不同反應(yīng)，然而其影響機理需進一步研究。

真菌光響應(yīng)被廣泛研究，包括光生物學相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和差異基因表達研究等方面也取得新進展。真菌次級代謝調(diào)控研究主要包括表觀遺傳調(diào)控、全局性調(diào)控、途徑特異性調(diào)控。光在真菌發(fā)育和次級代謝過程中起著至關(guān)重要的作用，但其作用機制還不清楚。在模式真菌構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)的光依賴全局調(diào)控因子Vet為我們提供了研究思路，光照抑制VeA-VelB復合蛋白進入細胞核，進而影響真菌的發(fā)育和次級代謝。而隨后VelB-VeA-LaeA三聚復合物的發(fā)現(xiàn)更是將光信號調(diào)控真菌發(fā)育和次級代謝物生物合成與染色質(zhì)的表觀遺傳修飾建立了橋梁。光照可以影響真菌DNA甲基化水平，推測可能跟具有甲基化功能的LaeA有關(guān)。真菌生物合成途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子主要包含Zn2Cys6和Cys2His2兩種類型，研究表明60%的真菌次級代謝產(chǎn)物合成基因簇內(nèi)含有途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子基因[49]，真菌光響應(yīng)與這兩類調(diào)控因子的關(guān)系仍需進一步研究。