結(jié)核分枝桿菌rpoB基因和突變檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核性腦膜炎中的診斷價(jià)值

李 靜，焦向陽(yáng)，白廣紅，仵倩紅

(陜西省結(jié)核病防治院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710100)

結(jié)核性腦膜炎(tuberculousmeningitis，TBM)是臨床上一種常見(jiàn)的肺外結(jié)核，被認(rèn)為是最嚴(yán)重的肺外結(jié)核(EPTB)，約占EPTB病例中的5%～10%[1]，死亡率高達(dá)67.2%[2]，該病多發(fā)于青壯年，發(fā)病無(wú)明顯季節(jié)性[3-4]且發(fā)病隱匿，常繼發(fā)于其他系統(tǒng)的感染，大多為結(jié)核分枝桿菌經(jīng)血循環(huán)進(jìn)入顱內(nèi)而發(fā)病。臨床表現(xiàn)缺乏特異性，病原學(xué)陽(yáng)性檢出率很低[5]，所以早期診斷極為困難。早期快速的實(shí)驗(yàn)室診斷方法能夠?yàn)榛颊叩闹委熀皖A(yù)后提供較大幫助。由于條件限制，對(duì)于基層而言，實(shí)驗(yàn)室診斷TBM常用的檢測(cè)方法是：抗酸桿菌(AFB)涂片和分枝桿菌培養(yǎng)。AFB涂片雖然快速、價(jià)低，但是腦脊液標(biāo)本陽(yáng)性檢出率及敏感性都很低，而分枝桿菌培養(yǎng)周期長(zhǎng)、不能滿足臨床早期、快速診治的需求，故尋求一種新的快速、準(zhǔn)確且高敏感度和高特異度的實(shí)驗(yàn)室診斷方法成為T(mén)BM檢測(cè)工作的重要目標(biāo)。GeneXpert是以全自動(dòng)半巢式實(shí)時(shí)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以rpoB基因?yàn)榘谢?，? h內(nèi)同時(shí)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和利福平(rifampin,RIF)耐藥。2013年GeneXpert檢測(cè)作為新型分子診斷技術(shù)被WHO推薦用于肺外結(jié)核的診斷[6-7]。但目前GeneXpert用于腦脊液樣本的診斷價(jià)值說(shuō)法不一，本研究中，通過(guò)對(duì)比分析AFB涂片、MGIT960培養(yǎng)、GeneXpert檢測(cè)對(duì)TBM的診斷效能，進(jìn)一步評(píng)估GeneXpert檢測(cè)對(duì)TBM的診斷價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集2019年1月至2020年6月陜西省結(jié)核病防治院收治的同時(shí)采用AFB涂片、MGIT960培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)的142例疑似TBM患者，其中確診TBM組中男52例(63.4%)、女30例(36.6%)；年齡12～76歲，中位年齡為32(25,47)；非TBM組中男33例(55.0%)、女27例(45.0%)，年齡14～81歲，中位年齡為30(25,56)。所有患者臨床確診資料均來(lái)源于臨床原始病例記錄，且通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核，獲得所有患者知情同意。

1.2 診斷依據(jù)

參照2010年國(guó)際TBM協(xié)作組[8]制定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，按此標(biāo)準(zhǔn)，臨床診斷為T(mén)BM患者共82例(包括確診的TBM 46例，很可能的TBM 26例，可能的TBM 10例)；非TBM組60例患者(包括臨床評(píng)分<6分的疑似結(jié)核性腦膜炎患者38例，化膿性腦膜炎15例，病毒性腦膜炎7例)。

1.3 主要試劑和儀器

抗酸染色試劑為實(shí)驗(yàn)室自配萋尼染色試劑；MGIT960檢測(cè)系統(tǒng)所用的培養(yǎng)儀及試劑均由美國(guó)BD公司提供；GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)及配套試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Cepheid公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

按照無(wú)菌采集標(biāo)本的要求收集留取腦脊液≥5 mL，每份標(biāo)本均進(jìn)行AFB涂片、MGIT960培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)。

1.4.1 AFB涂片 嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[9]操作。將腦脊液標(biāo)本用一次性吸管吸取少許于潔凈玻片上涂片，大小約為1 cm×2 cm、干燥后萋尼染色鏡檢，按照檢驗(yàn)規(guī)程報(bào)告結(jié)果。

1.4.2 MGIT960培養(yǎng) 嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[9]操作。取0.5 mL腦脊液標(biāo)本接種至MGIT960培養(yǎng)管中，加入0.8 mL營(yíng)養(yǎng)添加劑(OADC)和雜菌抑制劑(PANTA)的混合液，嚴(yán)格按照說(shuō)明進(jìn)行操作。將接種好的MGIT960培養(yǎng)管放入MGIT960系統(tǒng)中孵育，儀器對(duì)分枝桿菌的生長(zhǎng)進(jìn)行自動(dòng)監(jiān)測(cè)。儀器報(bào)陽(yáng)后采用結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒(MPB64)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的初步鑒定[10]。

1.4.3 GeneXpert 嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢驗(yàn)。將1 mL腦脊液標(biāo)本與2 mL GeneXpert系統(tǒng)前處理液混合，擰緊瓶蓋，渦旋振蕩15 s，室溫靜置15 min，使標(biāo)本充分液化，將消化后的2 mL樣品用無(wú)菌吸管吸入GeneXpert系統(tǒng)測(cè)試盒中，上機(jī)檢測(cè)，約2 h報(bào)告結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以臨床確診患者為參考標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)AFB涂片、MGIT960培養(yǎng)、GeneXpert技術(shù)的敏感度、特異度、符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同檢測(cè)方法對(duì)TBM的陽(yáng)性檢出率

回顧性分析臨床確診142例的住院患者，其中臨床確診為結(jié)核性腦膜炎有(TBM組)82例(82/142,57.7%),其中AFB涂片檢出陽(yáng)性3例，陰性79例，陽(yáng)性檢出率為3.7%(3/82)；MGIT960培養(yǎng)檢出陽(yáng)性20例，陰性62例，陽(yáng)性檢出率為24.4%(20/82)；Xpert分子檢出陽(yáng)性33例，陰性49例，陽(yáng)性檢出率為40.2%(33/82)。

2.2 不同檢測(cè)方法診斷TBM的檢測(cè)效能

以臨床確診患者為標(biāo)準(zhǔn)，AFB涂片、MGIT960培養(yǎng)、GeneXpert對(duì)TBM的檢測(cè)效能見(jiàn)表1。腦脊液標(biāo)本AFB涂片的敏感度低于MGIT960培養(yǎng)(χ2=14.615，P<0.05)，GeneXpert檢測(cè)的敏感度高于AFB涂片的敏感度(χ2=32.031，P<0.05)和MGIT960培養(yǎng)(χ2=4.711，P<0.05)。

表1 不同檢測(cè)方法對(duì)TBM診斷效能分析

3 討論

TBM是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病最常見(jiàn)的類型，由結(jié)核分枝桿菌侵入蛛網(wǎng)膜下隙引起軟腦膜、蛛網(wǎng)膜病變進(jìn)而累及腦血管，部分可累及腦實(shí)質(zhì)，在我國(guó)為常見(jiàn)病，致殘率及死亡率高[11]。由于TBM早期臨床癥狀不明顯和缺乏特異性常常導(dǎo)致診斷的延誤，從而影響患者的生存質(zhì)量并危及生命。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法仍是結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而與痰標(biāo)本不同，腦脊液標(biāo)本實(shí)驗(yàn)室檢查中AFB涂片查找抗酸桿菌的陽(yáng)性率很低，而分枝桿菌培養(yǎng)周期長(zhǎng)、不能滿足臨床早期、快速、準(zhǔn)確診治的需求，故尋求一種新的快速、準(zhǔn)確且高敏感度和高特異度的診斷方法成為T(mén)BM檢測(cè)工作的重要目標(biāo)。而GeneXpert作為新型分子診斷技術(shù)，其在肺外結(jié)核中的診斷價(jià)值已被多項(xiàng)研究評(píng)估[12-14]，認(rèn)為應(yīng)用GeneXpert檢測(cè)胸腔積液、骨關(guān)節(jié)結(jié)核部位膿液標(biāo)本具有較高的敏感度和檢測(cè)方法的優(yōu)越性，被認(rèn)為可用于肺外結(jié)核的各種類型的臨床標(biāo)本檢測(cè)的確證性診斷試驗(yàn)，但對(duì)于腦脊液的診斷敏感度還存在爭(zhēng)議[15-17]，需要進(jìn)行更深入的研究[18]。2019年鄭立恒，等[19]以臨床診斷為診斷標(biāo)準(zhǔn)比較了AFB涂片和GeneXpert檢測(cè)方法在TBM中的診斷敏感度，分別為4.44%(2/45)和35.56%(16/45)。鄭會(huì)強(qiáng)，等[20]以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)比較了MGIT960培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)方法在TBM中的診斷敏感度，分別為19.7%(14/71)和42.3%(30/71)。本研究中以臨床確診為診斷標(biāo)準(zhǔn)比較了AFB涂片、MGIT960培養(yǎng)和GeneXpert3種檢測(cè)方法在TBM中的診斷敏感度，分別為3.7%(3/82；95%CI：0.4%～7.7%)，24.4%(20/82；95%CI：15.1%～33.7%)和40.2%(33/82；95%CI：29.6%～50.9%)。相比于上面提到的研究，本研究中AFB涂片敏感度較低，分析原因主要有以下2點(diǎn)：①腦脊液標(biāo)本含菌量本就較低，而由于腦脊液所處位置特殊，每次所留取樣本量較少，含菌量更少，使得AFB涂片陽(yáng)性檢出率更低；②本研究中AFB涂片法的腦脊液標(biāo)本染色具體實(shí)驗(yàn)操作方法同痰液，冷染0.5 h，而腦脊液標(biāo)本相比痰液黏附率本身就很低[21]，冷染時(shí)間長(zhǎng)，固定效果減弱沖片時(shí)更容易脫落，且AFB涂片需抗酸桿菌達(dá)到5×103～1×104個(gè)/mL的濃度才能檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，涂片樣本量難以達(dá)到檢測(cè)需求故而陽(yáng)性檢出率更低。MGIT960培養(yǎng)的敏感度較高的可能原因?yàn)椋孩俦狙芯咳脒xTBM患者選擇嚴(yán)格；②MGIT960培養(yǎng)對(duì)環(huán)境要求極高，操作較為復(fù)雜，但所有操作人員均受到嚴(yán)格的訓(xùn)練，操作規(guī)范。

本研究中，GeneXpert檢測(cè)的敏感度明顯高于其他兩種檢測(cè)方法，其中MGIT960培養(yǎng)和GeneXpert的檢測(cè)陽(yáng)性者僅有10例為同時(shí)陽(yáng)性，重疊比例較低，這可能的原因?yàn)椋罕狙芯恐写蠖郥BM患者在留取樣本之前已服用抗結(jié)核藥物治療，而結(jié)核菌培養(yǎng)主要檢測(cè)的是活的結(jié)核分枝桿菌，GeneXpert主要檢測(cè)的是結(jié)核分枝桿菌的DNA，抗結(jié)核藥物會(huì)影響結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率，且MGIT960培養(yǎng)與GeneXpert的細(xì)菌濃度陽(yáng)性閾值檢測(cè)限也不同(前者為10～100條/mL，后者為131條/mL)。在這3種檢測(cè)方法中GeneXpert檢測(cè)有明顯的優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快速、2 h可在患者標(biāo)本中直接檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，敏感度高，對(duì)TBM的早期診斷、治療和預(yù)后有很大的幫助，且能檢測(cè)利福平是否耐藥。

本研究也存在一定的局限性，①雖然統(tǒng)計(jì)了一年半的疑似病例，但最終納入的TBM患者樣本量仍然很少；②由于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)條件有限，無(wú)法對(duì)不相符的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行深入研究。

綜上所述，AFB涂片檢測(cè)TBM的陽(yáng)性率極低，MGIT960培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，不適于TBM的早期診斷。GeneXpert檢測(cè)的敏感度明顯高于傳統(tǒng)的AFB涂片和結(jié)核菌培養(yǎng)，且生物安全風(fēng)險(xiǎn)性極低，對(duì)TBM早期診斷具有良好的指導(dǎo)意義。在臨床工作中優(yōu)先選擇GeneXpert檢測(cè)用于診斷，幫助TBM患者早期診斷，減少漏診及誤診，降低死亡率。