我國(guó)有機(jī)肥原料及商品有機(jī)肥中四環(huán)素類抗生素的檢出率及含量

楊 威，狄彩霞，李 季，田有國(guó)，史凱麗，趙 迪，王甲辰，譚啟玲*

[1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/新型肥料湖北省工程實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院資源環(huán)境與檢測(cè)技術(shù)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；3 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100091；4 全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，北京 100125；5 北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所，北京 100089；6 成都土壤肥料測(cè)試中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(成都)，四川成都 610041]

四環(huán)素類抗生素 (TCs) 是一類具有并四苯結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素，包括由放線菌產(chǎn)生的土霉素 (OTC)、四環(huán)素 (TTC)、金霉素 (CTC) 和半合成的強(qiáng)力霉素 (DXC)等。由于TCs具有廣譜性和廉價(jià)性的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖，具有防治禽畜疾病、促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。世界許多國(guó)家都在生產(chǎn)和使用TCs，中國(guó)已成為世界上生產(chǎn)和消費(fèi)TCs量最大的國(guó)家之一[1]。大部分TCs不能完全被動(dòng)物消化或吸收，約有30%～90%以母體化合物的形態(tài)隨畜禽糞尿排放[2]。對(duì)規(guī)模化養(yǎng)殖企業(yè)禽畜糞便有害成分檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，在32個(gè)豬糞檢測(cè)樣本中不同程度地檢測(cè)出TCs的殘留[3]。

有機(jī)肥是畜禽糞便資源化利用和提供作物養(yǎng)分的重要途經(jīng)之一，對(duì)實(shí)現(xiàn)有機(jī)肥替代化肥、發(fā)展綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有重要意義。但畜禽糞便也是抗生素污染土壤的重要來(lái)源之一，施用畜禽糞便肥的農(nóng)田表層土壤中OTC、TTC和CTC的平均殘留量分別是未施畜禽糞便的農(nóng)田38、13和12倍[4]。堆肥是畜禽糞便無(wú)害化處理和資源化利用的主要措施，是國(guó)內(nèi)外較為常用且經(jīng)濟(jì)、有效、成熟的畜禽糞便處理方法，也是去除畜禽糞便抗生素殘留的主要方式之一[5-6]，堆肥發(fā)酵過(guò)程被認(rèn)為是有機(jī)肥生產(chǎn)中抗生素降解的主要途徑，除了微生物的降解，堆肥溫度、pH、含水率、光線、容重及抗生素自降解等均會(huì)影響抗生素的降解[7-13]，雖然堆肥對(duì)大部分抗生素具有好的降解效果，但仍從商品有機(jī)肥中檢出11種抗生素，其中TTC的檢出率為8.82%[14]，畜禽糞便結(jié)合秸稈進(jìn)行高溫堆肥，豬糞堆肥和雞糞堆肥TTC、OTC、CTC去除率分別為81.5%、66.8%、59.7%和73.7%、53.0%和46.6%[15]，經(jīng)50天堆肥處理后，TTC、CTC及OTC的去除率分別為70%、92%及74%[16]，說(shuō)明堆肥化處理并未能完全降解抗生素。未降解的抗生素隨著肥料進(jìn)入農(nóng)田，不僅能殺死有益的微生物，甚至可產(chǎn)生耐藥菌，從而對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響?？股乇粍?dòng)植物吸收后進(jìn)入食物鏈，對(duì)人類健康也形成潛在威脅，如在3家中國(guó)商業(yè)養(yǎng)豬場(chǎng)糞肥中發(fā)現(xiàn)了149種“獨(dú)特”的抗生素耐藥基因[17]，甘藍(lán)、玉米和葉用洋蔥不僅能吸收CTC且隨CTC濃度增加吸收量增加[18-19]。我國(guó)有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)雖已于2021年6月進(jìn)行修訂 (NY/T 525-2021《有機(jī)肥料》)，但仍未對(duì)有機(jī)肥的抗生素含量作限量規(guī)定，因此亟需建立我國(guó)有機(jī)肥抗生素含量限量標(biāo)準(zhǔn)。

本研究對(duì)我國(guó)不同地區(qū)的畜禽糞便原料及以其為主要原料生產(chǎn)的有機(jī)肥進(jìn)行4種TCs含量的檢測(cè)，通過(guò)分析不同原料及地區(qū)TCs含量與檢出率、有機(jī)肥制作過(guò)程對(duì)4種TCs的去除率，評(píng)估不同畜禽糞便及不同地區(qū)存在TCs風(fēng)險(xiǎn)的可能性，為我國(guó)有機(jī)肥的安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年5—12月，以華中、華南、東北、華北、西南地區(qū)等典型縣市區(qū)為代表，包括內(nèi)蒙古、河北、甘肅、湖北、湖南、云南、四川、廣西、江西、安徽、江蘇、山東等省區(qū)，采集商品有機(jī)肥樣品244個(gè)，有機(jī)肥原料樣品180個(gè)，其中畜禽養(yǎng)殖類原料占抽樣數(shù)的86.1%，其它則為商品有機(jī)肥生產(chǎn)常用的輔料。同時(shí)采集原料及利用該原料生產(chǎn)的商品有機(jī)肥樣品各81份。

袋裝商品有機(jī)肥根據(jù)所需抽樣商品有機(jī)肥的樣袋，每袋從斜長(zhǎng)對(duì)角線放入到取樣器的四分之三處，取樣量應(yīng)多于或等于100 g，一個(gè)樣品取樣應(yīng)多于或等于2 kg，裝入樣品袋密封；散裝有機(jī)肥和有機(jī)肥原料取樣方法是在每個(gè)堆垛點(diǎn)，自下而上每20 cm取樣一次，每次約500 g，采用四分法取樣1 kg，裝入樣品袋密封 (NY/T 3442—2019)。樣品冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室，粉碎后過(guò)0.5 mm篩用于測(cè)定。

1.2 樣品測(cè)定指標(biāo)與測(cè)定方法

樣品經(jīng)Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇 (1∶1) 提取，上清液氮?dú)獯抵烈话塍w積，依次用水和甲醇-超純水進(jìn)行凈化處理，草酸-甲醇溶液洗脫，調(diào)pH為5～6，氮?dú)獯蹈珊蠹铀芙獠⒂?.22 μm濾膜過(guò)濾，高效液相色譜紫外檢測(cè)器檢測(cè)OTC、TTC、CTC及DXC的含量。測(cè)定條件：C18色譜柱 (2.7 μm，4.6 mm×100 mm) 進(jìn)行分離，0.01 mol/L草酸∶乙腈∶甲醇 (76∶16∶8) 等度洗脫，流速1 mL/min，柱溫30℃。進(jìn)樣20 μL，355 nm處檢測(cè)，采樣時(shí)間25 min(GB/T32951—2016)。OTC、TTC、CTC及DXC的檢出限及回收率分別為0.75 mg/kg和92.45%、0.75 mg/kg和92.18%、1.0 mg/kg和92.69%及0.75 mg/kg和96.18%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2007、SPSS 23.0及Origin 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 畜禽糞便原料及商品有機(jī)肥中4種四環(huán)素類抗生素總檢出率

由圖1可知，有機(jī)肥原料及商品有機(jī)肥樣品檢出抗生素的比率分別為35.00%和16.39%，總計(jì)24.29%，原料檢出率約是商品有機(jī)肥的1倍。檢出1～2種抗生素的樣品占總樣品數(shù)的80.58%，其中檢出1～2種抗生素的商品有機(jī)肥比例高達(dá)92.50%，而有機(jī)肥原料檢出1～2種抗生素的樣品占73.02%，商品有機(jī)肥檢出1～2種抗生素的比例高于有機(jī)肥原料，這是因?yàn)檫x擇1種或2種抗生素的畜禽養(yǎng)殖企業(yè)較多，但在商品有機(jī)肥生產(chǎn)過(guò)程中添加多種畜禽糞便所致。

圖1 樣品抗生素檢出率及抗生素檢出種類的占比Fig. 1 Detection rate of tetracycline antibiotics and the proportion of the types of tetracycline antibiotics detected

由表1可知，以畜禽糞便為主的有機(jī)肥原料，豬糞、雞糞、牛糞及羊糞4種抗生素的檢出率最高，分別為83.33%、66.67%、30.77%及24.42%，說(shuō)明在雞、豬、牛及羊的養(yǎng)殖中抗生素的使用頻率較高；鴨糞、菇渣及骨粉原料中有也4種抗生素的檢出 (因其取樣數(shù)量較少，其檢出率無(wú)代表性)，說(shuō)明在蘑菇生產(chǎn)或生產(chǎn)菌肥的菌渣中也有4種抗生素的使用。商品有機(jī)肥中，則以雞糞、豬糞、牛糞及羊糞為主要原料的4種抗生素的檢出率最高，分別為31.67%、25.00%、14.63%及9.59%，雖然秸稈、油餅及酵母渣原料中未檢出4種抗生素，但以其為主要原料的商品有機(jī)肥仍檢出抗生素，其可能是在有機(jī)肥生產(chǎn)過(guò)程中，摻入部分含4種抗生素的原料所致。

表1 畜禽糞便原料及其商品有機(jī)肥產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素的檢出率(%)Table 1 Detection rate of tetracycline antibiotics in the raw materials and their commercial products

2.2 畜禽糞便原料及生產(chǎn)的有機(jī)肥中土霉素檢出率及含量

商品有機(jī)肥和原料中土霉素 (OTC) 的檢出率分別為6.56%和25.00%，平均檢出率和含量分別為14.39% 和2.49 mg/kg (表2)。從原料檢出率來(lái)看，雞糞、牛糞、豬糞、菇渣及羊糞檢出率較高，分別占各自取樣量的28.89%、18.75%、11.54%、11.11%及8.81%，骨粉及生產(chǎn)菌肥的秸稈中也有土霉素的檢出。從含量來(lái)看，以牛糞、豬糞、羊糞 (去掉一個(gè)異常值) 及雞糞中較高，分別達(dá)2.75、2.61、2.22及0.66 mg/kg，檢出率及含量都以畜禽糞便原料最高，分別為25.00%和3.01 mg/kg；從肥料生產(chǎn)企業(yè)所在地域來(lái)看，北京、甘肅 (去掉一個(gè)異常值)、云南、四川及湖南地區(qū)含量較高，分別為5.13、5.11、1.13、0.69及0.40 mg/kg，安徽、河北、江西及內(nèi)蒙古地區(qū)也有檢出 (圖2)。

圖2 不同原料及其商品有機(jī)肥中土霉素含量Fig. 2 Oxytetracycline content in different raw materials and their commercial products

表2 畜禽糞便原料及有機(jī)肥土霉素檢出率及含量Table 2 Detection rate and content of oxytetracycline in organic fertilizer raw materials and commercial products

2.3 畜禽糞便原料及生產(chǎn)的有機(jī)肥中四環(huán)素檢出率及含量

畜禽糞便原料及商品有機(jī)肥四環(huán)素 (TTC) 檢出率分別為11.11%和2.46%，平均檢出率和含量分別為6.13%和1.74 mg/kg (表3)。羊糞、牛糞、豬糞及雞糞中檢測(cè)出了TTC，檢出率占各自樣品數(shù)的比例分別為8.17%、8.75%、11.54%、3.33%，含量分別為2.94、0.81、0.32、0.11 mg/kg。從肥料生產(chǎn)企業(yè)所在地域來(lái)看，內(nèi)蒙古、甘肅、云南、河北、北京(去掉一個(gè)異常值) 及湖北6省有檢出，其平均含量分別為1.35、0.46、0.23、0.14、0.12及0.08 mg/kg(圖3)。

圖3 不同原料及其商品有機(jī)肥中四環(huán)素含量狀況Fig. 3 Tetracycline content in the raw materials and their commercial products

表3 畜禽糞便原料及其生產(chǎn)的有機(jī)肥中四環(huán)素檢出率及含量Table 3 Detection rate and content of tetracycline in the raw materials and their commercial products

2.4 畜禽糞便原料及生產(chǎn)的有機(jī)肥中金霉素檢出率及含量

畜禽糞便原料和商品有機(jī)肥金霉素 (CTC) 檢出率分別為13.33%和5.74%，平均檢出率和含量分別為8.96%和22.11 mg/kg (表4)。雞糞、牛糞、豬糞及羊糞中CTC的檢出率比較相近，分別為10.00%、10.00%、11.54%及9.43%，骨粉、酵母渣及油餅中也有CTC的檢出。從含量來(lái)看，羊糞和牛糞較高，分別達(dá)15.60 (去掉一個(gè)異常值) 和9.06 mg/kg，豬糞及雞糞中較低，分別為2.37和0.34 mg/kg。從肥料生產(chǎn)企業(yè)所在地域來(lái)看，內(nèi)蒙古、甘肅、河北、云南、湖北、湖南及四川的平均含量分別為19.18、1.84、0.94、0.42、0.42、0.31 及 0.17 mg/kg，而北京地區(qū)只有一個(gè)肥料企業(yè)的羊糞原料中檢出CTC，且其含量高達(dá)538.38 mg/kg (圖4)。

圖4 不同原料及其商品有機(jī)肥中金霉素含量Fig. 4 Chlortetracycline concentration in the raw materials and their commercial products

表4 畜禽糞便原料及其商品有機(jī)肥中金霉素檢出率及含量Table 4 Detection rate and content of chlortetracycline in organic fertilizer raw and commercial products

2.5 畜禽糞便原料及生產(chǎn)的有機(jī)肥中強(qiáng)力霉素檢出率及含量

畜禽糞便原料和商品有機(jī)肥強(qiáng)力霉素 (DXC) 檢出率分別為13.33%和9.43%，平均檢出率和含量分別為11.08%和0.71 mg/kg (表5)。DXC在豬糞、雞糞及鴨糞中檢出率較高，分別為30.77%、30.0%及16.67%，羊糞及牛糞中檢出率較低，只有3.14%和2.5%，菇渣、油餅及骨粉中也有檢出。從含量來(lái)看，豬糞、雞糞、羊糞、鴨糞及牛糞中相對(duì)較高，分別為1.10、0.82、0.42、0.16及0.14 mg/kg，從肥料生產(chǎn)企業(yè)所在地域來(lái)看，內(nèi)蒙古、河北、北京、甘肅、云南、四川、湖南、湖北及安徽地區(qū)均有檢出，其平均含量分別為1.58、1.28、0.87、0.76、0.64、0.48、0.24、0.19及0.06 mg/kg，但大部分省區(qū)均有DXC含量較高的肥料 (圖5)。

圖5 不同原料及其商品有機(jī)肥中強(qiáng)力霉素含量Fig. 5 Doxycycline content in organic fertilizer raw materials and commercial products from different regions

表5 畜禽糞便原料及其商品有機(jī)肥中強(qiáng)力霉素檢出率及含量Table 5 Detection rate and content of doxycycline in the raw materials and their commercial products

2.6 有機(jī)肥生產(chǎn)對(duì)畜禽糞便原料TCs的去除率

對(duì)81份同時(shí)采集原料及利用該原料生產(chǎn)的商品有機(jī)肥，進(jìn)行有機(jī)肥生產(chǎn)過(guò)程4種TCs的去除率分析 (圖6) 可知，商品有機(jī)肥生產(chǎn)不能完全去除4種TCs，去除率為62.80%～77.81%，4種TCs的去除率由大到小順序?yàn)镺TC (77.81%) ＞CTC (75.02%) ＞TTC (72.84%) ＞DXC (62.80%)，基本與原料中4種TCs的含量順序一致 (除CTC與OTC的順序互換)。與張樹清等[15]的研究結(jié)果不一致，其原因可能與有機(jī)肥原料種類及含量有關(guān)。不同肥料企業(yè)商品有機(jī)肥4種TCs去除率差異較大，可能與有機(jī)肥生產(chǎn)過(guò)程中的發(fā)酵次數(shù)、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度等有關(guān)。OTC、TTC、CTC及DXD的去除率分別為71.43%～97.08%、50.00%～99.54%、68.64%～83.35%及21.21%～98.20%。

圖6 有機(jī)肥生產(chǎn)過(guò)程對(duì)4類TCs的去除率Fig. 6 Removal rate of tetracycline antibiotics during productive process of organic fertilizer

3 討論

有機(jī)肥是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的肥料品種。隨著我國(guó)果菜茶有機(jī)肥替代化肥、主要農(nóng)作物化肥農(nóng)藥減施增效等項(xiàng)目的推進(jìn)，有機(jī)肥需求量的迅速增加及生產(chǎn)的低門檻，導(dǎo)致有機(jī)肥市場(chǎng)魚龍混雜，企業(yè)送檢樣品和市場(chǎng)銷售肥料的不一致說(shuō)明企業(yè)規(guī)避政府管理的動(dòng)向明顯。

不同畜禽糞便原料4種TCs檢出率有較大差異，雞糞中OTC和DXC、牛糞中OTC及豬糞中DXC的檢出率高于其它TCs，說(shuō)明在不同畜禽養(yǎng)殖中對(duì)TCs的選擇有明顯區(qū)別；4種TCs的檢出含量以CTC顯著高于其他3種TCs，說(shuō)明在畜禽養(yǎng)殖中CTC使用更為普遍且使用量也顯著高于其他TCs。

畜禽糞便原料4種TCs的檢出率因畜禽糞便種類不同差異較大，檢出率高的豬糞和雞糞基本為集約化程度和空間密集度高的牲畜品種，需要較多的抗生素以預(yù)防病菌的傳染；以雞糞、豬糞、牛糞和羊糞為原料生產(chǎn)的商品有機(jī)肥仍有31.67%、25.00%、14.63%和9.59%的4種TCs檢出率，且有機(jī)肥的堆肥化過(guò)程只能去除畜禽糞便原料TCs的62.80%～77.81%，表明有機(jī)肥的堆肥或生產(chǎn)過(guò)程并不能完全去除四環(huán)素類抗生素，與前期報(bào)道[15-16]的研究結(jié)果一致，也說(shuō)明減少畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的使用才是畜禽糞便商品有機(jī)肥化的質(zhì)量保證。

巨大體積及數(shù)量的畜禽糞便是有機(jī)肥生產(chǎn)的主要原料。在集約化畜禽養(yǎng)殖中常使用抗生素以控制感染疾病，我國(guó)每年有一半以上的抗生素作為飼料添加劑用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，其中約30%隨畜禽糞便排出體外成為重要的抗生素污染源。本研究結(jié)果也表明，畜禽糞便原料確實(shí)是有機(jī)肥抗生素含量增加的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。我國(guó)于2016年出臺(tái)了《有機(jī)肥料中土霉素、四環(huán)素、金霉素與強(qiáng)力霉素的含量測(cè)定高效液相色譜法》 (GB/T32951—2016)，為有機(jī)類肥料產(chǎn)品TCs殘留檢測(cè)提供了檢測(cè)方法，但新修訂的有機(jī)肥料農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 525—2021并未涉及到抗生素。本研究結(jié)果表明有機(jī)肥的堆肥或生產(chǎn)過(guò)程并不能完全降解抗生素, 畜禽糞便原料及畜禽糞便為原料生產(chǎn)的商品有機(jī)肥，仍部分殘留抗生素。建議在有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)中納入常用抗生素的含量限量標(biāo)準(zhǔn)。

有機(jī)肥生產(chǎn)企業(yè)對(duì)樣品采集的不配合，說(shuō)明企業(yè)也深知其原料可能存在著安全性風(fēng)險(xiǎn)，建議加大對(duì)有機(jī)肥生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品的監(jiān)管力度，建立有機(jī)肥料分類管理目錄，要求企業(yè)在有機(jī)肥料產(chǎn)品登記時(shí)，提供畜禽糞便生產(chǎn)有機(jī)肥料時(shí)生產(chǎn)原料配比、原料及有機(jī)肥產(chǎn)品抗生素含量第三方檢測(cè)報(bào)告。加強(qiáng)對(duì)畜禽糞便生產(chǎn)有機(jī)肥料的監(jiān)督抽查，引導(dǎo)有機(jī)肥生產(chǎn)企業(yè)建立原料進(jìn)廠檢測(cè)和產(chǎn)品出廠檢測(cè)制度，優(yōu)化工藝參數(shù)，有效控制有機(jī)肥料中抗生素含量。加強(qiáng)有機(jī)肥抗生素檢測(cè)儀器和檢測(cè)技術(shù)研發(fā)，開發(fā)簡(jiǎn)便易行、價(jià)格低廉的抗生素檢測(cè)方法，有效降低抗生素檢測(cè)費(fèi)用，降低檢測(cè)門檻，提高檢測(cè)覆蓋率。

4 結(jié)論

1) 有機(jī)肥原料及商品有機(jī)肥中均含有一定的四環(huán)素類抗生素，4種常用四環(huán)素類抗生素的檢出率分別為35.00%和16.39%，總檢出率為24.29%，商品有機(jī)肥的檢出率低于生產(chǎn)原料。近80%的畜禽糞便原料及商品有機(jī)肥中只檢出1～2種抗生素，檢出率表現(xiàn)為：OTC (14.39%) ＞ DXC (11.08%) ＞ CTC(8.96%) ＞ TTC (6.13%)。

2) 畜禽糞便中4種四環(huán)素類抗生素的檢出率由大到小表現(xiàn)為：豬糞 (83.33%) ＞雞糞 (66.67%) ＞牛糞(30.77%) ＞羊糞 (24.42%)，以畜禽糞便為主要原料生產(chǎn)的商品有機(jī)肥4種TCs檢出率由大到小表現(xiàn)為：雞糞 (31.67%) ＞豬糞 (25.00%) ＞牛糞 (14.63%) ＞羊糞(9.59%)。在鴨糞、菇渣及骨粉原料中也有檢出，說(shuō)明TCs除了在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中使用普遍，目前已延伸到蘑菇種植、動(dòng)物源食品業(yè)的下腳料等，但其檢出率及含量還有待研究。

3) 有機(jī)肥的堆肥化過(guò)程能去除畜禽糞便原料4種TCs的62.80%～77.81%，去除率由大到小表現(xiàn)為 OTC ＞CTC＞TTC＞DXC。