綠肥腐解液中有機(jī)酸組成對(duì)鋁磷和鐵磷活化能力的影響

顧熾明，李 越，李銀水，謝立華，沈欣杰，李小勇，秦 璐，廖 星

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430062）

磷是植物生長(zhǎng)必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素之一。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用磷肥能顯著提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，對(duì)世界糧食增產(chǎn)起到重要作用[1]。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，由于磷素容易被土壤固定，形成難溶性的磷酸鹽，導(dǎo)致其生物有效性降低，作物對(duì)磷肥的利用率降低[2]，我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中磷肥的利用率大約為15%左右[3]。為了滿足日益增長(zhǎng)的人口對(duì)糧食的需求，生產(chǎn)中常通過(guò)多施肥來(lái)解決土壤缺磷和提高作物單產(chǎn)。但大量施用磷肥，不但增加了生產(chǎn)成本，而且長(zhǎng)期施用磷肥，使得PO43-離子與土壤中的Fe、Al 等金屬離子結(jié)合，形成不能被植物吸收的絡(luò)合物，這既降低了磷肥的利用率，又容易造成環(huán)境污染[4]。

中國(guó)農(nóng)田土壤全磷含量不低，但有效磷含量偏低，農(nóng)田土壤生物有效態(tài)磷素缺乏現(xiàn)象十分普遍[5]。磷在土壤中的大量累積與其生物有效性低是土壤磷素養(yǎng)分的主要特征，已成為限制土壤生產(chǎn)力及威脅水體環(huán)境安全的主要因子之一。如何提高磷素的有效性進(jìn)而促進(jìn)作物對(duì)磷素的吸收利用效率，是我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展面臨的重大科學(xué)問(wèn)題[6-8]。近年來(lái)我國(guó)冬閑田的面積逐年增加，化肥使用導(dǎo)致的環(huán)境問(wèn)題以及耕地質(zhì)量下降問(wèn)題日益突出，綠肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣和應(yīng)用受到越來(lái)越多的關(guān)注[9]。種植符合輪作制度習(xí)慣的冬季綠肥，不僅可以緩解南方部分省份“稻-稻-油”三熟制帶來(lái)的季節(jié)緊張，降低冬閑田面積，有效利用冬閑田的光、溫、水、土資源，同時(shí)生產(chǎn)大量?jī)?yōu)質(zhì)有機(jī)肥，翻壓還田后還可達(dá)到改善土壤磷素養(yǎng)分的生物有效性，增強(qiáng)土壤磷素供應(yīng)能力的目的。

研究表明應(yīng)用綠肥可以顯著提高作物對(duì)土壤磷素養(yǎng)分的吸收利用。這主要是因?yàn)榫G肥腐解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量有機(jī)酸陰離子，有機(jī)酸陰離子一方面可以促進(jìn)土壤礦物風(fēng)化和土壤形成，另一方面降低土壤對(duì)磷素的固持，提高土壤養(yǎng)分的溶解度和有效性，對(duì)土壤難溶性磷素的活化有很好的促進(jìn)作用[10-13]。莊正等[14]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸陰離子如草酸陰離子可有效提高紅壤中磷素的生物有效性。有機(jī)酸對(duì)難溶性磷酸鹽的影響與其對(duì)各種金屬的絡(luò)合能力有關(guān)[15]，有機(jī)酸陰離子廣泛存在于土壤中，對(duì)土壤的結(jié)構(gòu)肥效和營(yíng)養(yǎng)元素的生物可利用性起到了決定性作用[16]。綠肥還田后腐解，植物根系的分泌物或土壤有機(jī)質(zhì)分解和微生物代謝的產(chǎn)物中均含有多種有機(jī)酸陰離子。同時(shí)，由于綠肥腐解過(guò)程中為微生物提供大量的碳源和氮源，使得微生物活性較高，微生物群落結(jié)構(gòu)也較豐富，因此對(duì)土壤磷素的生物活化作用也很強(qiáng)烈，進(jìn)而提高土壤磷素有效性。Egle等[17]研究發(fā)現(xiàn)羽扇豆在不同缺磷條件下根系釋放的有機(jī)酸陰離子主要為蘋(píng)果酸和琥珀酸陰離子。Zhang等[18]的研究表明肥田蘿卜在缺磷條件下蘋(píng)果酸和琥珀酸陰離子的釋放量分別增加了15和60倍。此外，缺磷脅迫還能促進(jìn)紫云英分泌蘋(píng)果酸、草酸和琥珀酸等有機(jī)酸陰離子，顯著增加對(duì)難溶性磷的活化效果[19]。然而，目前有關(guān)綠肥影響土壤磷素有效性的研究，多集中在上述研究綠肥根系分泌有機(jī)酸陰離子對(duì)土壤磷素有效性的影響，關(guān)于不同綠肥翻壓腐解過(guò)程中對(duì)土壤中難溶態(tài)磷 (磷酸鋁和磷酸鐵) 活化的影響差異及其影響機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)選取常見(jiàn)的6種綠肥作物為供試材料，通過(guò)室內(nèi)模擬試驗(yàn)方法，研究綠肥翻壓還田后腐解過(guò)程釋放的有機(jī)酸組分差異，同時(shí)對(duì)不同綠肥腐解液對(duì)酸性土壤難溶性磷素(磷酸鋁和磷酸鐵) 的活化能力進(jìn)行了定量化分析，并分析了不同綠肥腐解液有機(jī)酸組分差異與其磷活化能力高低之間的相關(guān)關(guān)系，本研究可為綠肥在我國(guó)的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為6種綠肥作物，包括雙低甘藍(lán)型油菜綠肥 (品種為自主選育品種‘中油肥1號(hào)’，簡(jiǎn)稱雙低甘，DLR)，雙高甘藍(lán)型油菜綠肥 (品種為自主選育品系，簡(jiǎn)稱雙高甘，DHR)，芥菜型油菜綠肥(品種為自主選育品系，簡(jiǎn)稱芥油，BJ)，紫云英 (品種為‘余江大葉’，MV)，二月蘭 (品種為市售種，OV)，肥田蘿卜 (品種為自主選育品系‘RS003’，簡(jiǎn)稱肥蘿，R)。所有試驗(yàn)材料均來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所江西省進(jìn)賢試驗(yàn)基地稻綠肥輪作試驗(yàn)的綠肥小區(qū)，所有綠肥作物的施肥水平和管理措施一致，于3月底在不同綠肥作物盛花期取全株樣。供試磷酸鋁 (A l P O4，A l-P) 和磷酸鐵(FePO4·2H2O，F(xiàn)e-P) 均為分析純化學(xué)試劑，生產(chǎn)廠家為上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 土壤浸提液的制備 土壤浸提液制備所用的土壤取自綠肥作物取樣地的冬閑小區(qū)0—20 cm土層，土壤類(lèi)型為磚紅壤。取10 g新鮮土壤于燒杯中，加入50 mL純水，用玻璃棒攪拌5 min 過(guò)濾取上清液，現(xiàn)制現(xiàn)用。

1.2.2 綠肥作物腐解液的制備及有機(jī)酸組分的檢測(cè) 將新鮮綠肥植株樣品用去離子水洗凈，切成1～3 cm的小段，混勻后取100 g裝入1 L廣口玻璃瓶中。向每個(gè)瓶中加1 mL土壤浸提液，然后放置于背陰室外環(huán)境中進(jìn)行腐解。統(tǒng)一腐解45天后，加入1000 mL去離子水，并加入適量百里酚 (0.1 g/L) 抑制微生物活動(dòng)，震蕩5 min后過(guò)濾得到100 g/L的腐解液，腐解液經(jīng)低溫 (溫度控制在10℃) 干燥儀濃縮至100 mL (濃縮10倍)，放置超低溫冰箱保存以供進(jìn)行Al-P 和Fe-P 活化試驗(yàn)和有機(jī)酸檢測(cè)。

取5 mL上述濃縮腐解液于10 mL離心管中，在10000 r/min離心5 min，除去菌絲體，取稀釋適當(dāng)倍數(shù)的上清液1 mL于離心管中，加入0. 05 mL 硫酸 (72%) 酸解 30 min，10000 r/min離心3 min除去硫酸鈣，上清液過(guò)0. 22 μm濾膜即得含有游離酸的待測(cè)液。用安捷倫1260高效液相色譜儀，配制二極管陣列檢測(cè)器，測(cè)定腐解液濃縮液中10種有機(jī)酸組分的含量 (草酸、酒石酸、乙酸、丙二酸、蘋(píng)果酸、乳酸、馬來(lái)酸、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸)。色譜條件：Spursil C18 色譜柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)。流速：0.8 mL/min；上樣量：20 μL。流動(dòng)相：25 mmol/L磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH=2.5。檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm[20]。

1.2.3 綠肥腐解液對(duì)難溶性磷的活化 難溶性磷的活化試驗(yàn)參考蘭忠明等[19]的方法，稱取0.0500 g磷酸鋁AlPO4、磷酸鐵FePO4·2H2O分別放入50 mL塑料離心管中，用純水淋洗3次AlPO4和FePO4·2H2O，以去除AlPO4和FePO4·2H2O表面附著的易溶態(tài)磷。然后加入濃縮腐解液6 mL，連續(xù)震蕩2 h后過(guò)濾，采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定上清液磷濃度 (P1)，以去離子水、不加難溶性磷酸鹽的腐解液為對(duì)照，同樣條件下進(jìn)行震蕩、過(guò)濾后采用鉬銻抗比色法測(cè)定濾液中磷素含量 (CK)。以P1值減去腐解液磷素含量，再減去CK值即為綠肥腐解物質(zhì)對(duì)難溶性磷酸鹽的活化量。根據(jù)試驗(yàn)中100 g綠肥制得的腐解液對(duì)Al-P、Fe-P的活化量換算得出1 t該綠肥腐解產(chǎn)生的腐解液對(duì)Al-P和Fe-P的活化量，活化量計(jì)量的物質(zhì)形態(tài)是P2O5。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖采用 Microsoft Excel 2016 和R語(yǔ)言 (version 3.4.2) 軟件，方差分析采用SPSS Statistics 17，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以4次重復(fù)的平均值表示，采用 LSD 法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同綠肥作物腐解液中有機(jī)酸組分差異

綠肥腐解后會(huì)產(chǎn)生多種有機(jī)酸陰離子，不同綠肥作物腐解產(chǎn)生的有機(jī)酸組分存在差異。本研究中6種綠肥腐解液中的有機(jī)酸組分含量如表1所示。二月蘭腐解液中10種有機(jī)酸組分總量最高，其次為肥田蘿卜、雙低甘藍(lán)型油菜和芥菜型油菜，雙高甘藍(lán)型油菜和紫云英腐解后腐解液中較低。從有機(jī)酸組分種類(lèi)來(lái)看，酒石酸和丙二酸在供試綠肥腐解液中的含量較高，檸檬酸、琥珀酸和蘋(píng)果酸陰離子的含量居中，馬來(lái)酸和富馬酸的含量偏低。

表1 綠肥腐解液中各有機(jī)酸組分含量 (μg/L)Table 1 The contents of organic acids in the decomposed liquids of green manure crops

供試6種綠肥腐解液中各有機(jī)酸組分占10種有機(jī)酸組分總量的比例差異明顯 (表2)，在6種綠肥腐解液中，酒石酸和丙二酸均占有較高的比重，占到10種主要有機(jī)酸總量的15%以上，馬來(lái)酸和富馬酸占比最低，不到10種主要有機(jī)酸總量的1%。另外，不同綠肥間比較發(fā)現(xiàn)芥菜型油菜腐解液中檸檬酸和蘋(píng)果酸占比較高，甘藍(lán)型雙高油菜的草酸和檸檬酸占比較高，甘藍(lán)型雙低油菜的乳酸和琥珀酸占比較高；二月蘭的蘋(píng)果酸和乳酸占比較高，草酸較低；肥田蘿卜的酒石酸占比較高，檸檬酸、琥珀酸占比居中，乙酸占比較低；紫云英的檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸的占比較高。

表2 不同綠肥作物腐解液中的有機(jī)酸組分占總和比例 (%)Table 2 The proportion of organic acid components in the decomposed liquid of different green manure crops

2.2 綠肥腐解液對(duì)難溶性磷的活化效果

綠肥腐解液對(duì)難溶性P (Al-P、Fe-P) 的活化量如圖1所示。肥田蘿卜腐解液對(duì)Fe-P的活化能力強(qiáng)于對(duì)Al-P，而其他綠肥活化Al-P的能力強(qiáng)于Fe-P。芥菜型油菜、雙高甘藍(lán)型油菜和紫云英腐解液對(duì)Al-P的活化能力強(qiáng)于雙低甘藍(lán)型油菜、肥田蘿卜和二月蘭。6種綠肥作物中肥田蘿卜活化Fe-P的能力最強(qiáng)，二月蘭最弱，其他綠肥對(duì)Fe-P的活化能力差異不顯著。肥田蘿卜、芥菜型油菜和紫云英對(duì)難溶性磷素的活化總量均高于其他綠肥。供試綠肥作物中肥田蘿卜對(duì)難溶性磷組分Al-P和Fe-P的活化總量最高，理論上可達(dá)到0.6～1.2 kg/t，芥菜型油菜和紫云英次之，約為0.6～1.0 kg/t，二月蘭的活化總量最低，約為0.2～0.6 kg/t。

圖1 綠肥腐解液對(duì)Al-P和Fe-P的活化能力Fig. 1 Activation of Al-P and Fe-P by decomposed liquids of green manure crops

2.3 綠肥腐解液中不同有機(jī)酸組分含量與難溶性磷素活化能力的相關(guān)性

綠肥作物腐解液中有機(jī)酸組分含量與其對(duì)難溶性磷活化能力的相關(guān)性分析結(jié)果(圖2)顯示，Al-P的活化量與綠肥作物植株腐解液中檸檬酸、蘋(píng)果酸、草酸含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在2018和2019年分別達(dá)到 0.50、0.86、0.82 和 0.86、0.61、0.81；與綠肥腐解液中丙二酸含量均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與其他有機(jī)酸相關(guān)性不顯著。Fe-P的活化量與綠肥腐解液中酒石酸含量呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在2018和2019年分別達(dá)到0.60和0.79，與其他有機(jī)酸組分的相關(guān)性不顯著。

圖2 綠肥腐解液中有機(jī)酸組分含量與其對(duì)難溶性磷活化能力的相關(guān)性分析Fig. 2 Correlation analysis between the organic acid contents in the decomposed liquid of different green manures and its ability to activate insoluble phosphorus

3 討論

3.1 不同綠肥腐解液中有機(jī)酸組分的差異

有機(jī)殘?bào)w腐解釋放的相對(duì)分子質(zhì)量 ＜ 500的含羧基化合物，如檸檬酸、草酸、蘋(píng)果酸、酒石酸等有機(jī)酸陰離子，這些有機(jī)酸陰離子是土壤中廣泛存在的一類(lèi)非?；顫姷奈镔|(zhì)。植物殘?bào)w腐爛或植物分泌的草酸和蘋(píng)果酸等有機(jī)酸是土壤磷素活化的關(guān)鍵因素之一[10,16,21]，綠肥翻壓還田后的腐解過(guò)程中會(huì)向土壤中釋放有機(jī)酸陰離子，主要包括腐殖酸和低分子量有機(jī)酸陰離子兩部分[22-24]。目前關(guān)于有機(jī)酸組分種類(lèi)的相關(guān)研究主要集中在不同植物根系分泌物中有機(jī)酸組分差異方面，直接對(duì)不同綠肥腐解產(chǎn)生有機(jī)酸陰離子差異的研究還很少見(jiàn)，且少量有關(guān)綠肥作物的應(yīng)用過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)土壤難溶性磷素的活化方面的研究，大多停留在定性描述階段。非洲酸性低磷土壤上的研究結(jié)果表明，磷高效基因型大豆與玉米輪作并翻壓，通過(guò)大豆殘?bào)w中的磷吸收再利用以及豆科綠肥根系分泌的有機(jī)酸陰離子，尤其是檸檬酸，能夠解吸土壤固持的磷，使之成為有效態(tài)磷供作物吸收利用，因此顯著提高了玉米產(chǎn)量和磷素吸收量[11,25]。一般在缺磷環(huán)境中植物根系會(huì)分泌有機(jī)酸陰離子，且不同植物分泌的有機(jī)酸種類(lèi)不同。羽扇豆在不同缺磷條件下可通過(guò)根系釋放的蘋(píng)果酸和琥珀酸活化土壤難溶性磷素[17]；紫云英和蘿卜通過(guò)根系分泌蘋(píng)果酸、草酸和琥珀酸等有機(jī)酸陰離子，顯著增加對(duì)難溶性磷的活化效果[18-19]。

微生物在分解植物殘?bào)w時(shí)會(huì)分泌有機(jī)酸陰離子，不同綠肥腐解產(chǎn)生的有機(jī)酸種類(lèi)和量存在差異的主要原因是不同綠肥碳氮比存在差異，微生物獲得的碳源和氮源存在差異，從而影響了微生物分泌有機(jī)酸陰離子的過(guò)程，包括菌根菌的侵染、微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)等[26-29]。另外，不同綠肥腐解產(chǎn)生有機(jī)酸的過(guò)程中發(fā)揮主要功能的微生物群組和功能基因的調(diào)控有所差異[30]，導(dǎo)致了綠肥腐解過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)組分種類(lèi)或量的差異[31]。目前針對(duì)相關(guān)微生物功能基因表達(dá)及微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究還較少，需要進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究。

3.2 不同綠肥腐解產(chǎn)生的有機(jī)酸差異與其磷活化能力間的關(guān)系

我國(guó)南方紅壤一般偏酸性，且含有大量Al2+、Fe3+，磷肥施入土壤后很快以Al-P、Fe-P的形式被固定，從而導(dǎo)致紅壤供磷能力較低[32]。大量研究表明，在酸性土壤中施用有機(jī)肥可以提高土壤中有機(jī)酸陰離子含量，從而減少土壤對(duì)磷素的吸附和固持，同時(shí)還能降低土壤對(duì)磷素的吸附K值[33-34]，提高土壤磷素水平，促進(jìn)作物對(duì)磷的吸收利用，進(jìn)而增加作物產(chǎn)量[11-13]，而且這一現(xiàn)象與其腐解過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸有關(guān)[25]。綠肥在翻壓后腐解的過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸通過(guò)絡(luò)合溶解、還原、酸溶等作用，將土壤中難以被植物利用的無(wú)效態(tài)磷素活化為有效態(tài)磷素[35-37]。因此，綠肥腐解過(guò)程產(chǎn)生的有機(jī)酸種類(lèi)和量會(huì)直接影響土壤磷素含量以及供磷能力。本研究中不同綠肥對(duì)難溶性磷素的活化能力存在差異，其中肥田蘿卜、芥菜型油菜和紫云英對(duì)難溶性磷素Al-P和Fe-P的活化能力較強(qiáng)。兩種難溶性磷素活化總量大小依次為肥田蘿卜 ＞ 芥菜型油菜、紫云英 ＞ 雙高甘藍(lán)型油菜 ＞ 雙低甘藍(lán)型油菜 ＞ 二月蘭，這與不同綠肥腐解后腐解液中的有機(jī)酸組分差異有關(guān)。

不同種類(lèi)有機(jī)酸陰離子對(duì)土壤中難溶性磷素的活化能力不同，因而不同綠肥翻壓還田對(duì)土壤中難溶性磷素的活化效果不同。在有機(jī)酸陰離子濃度較低的條件下，檸檬酸和草酸對(duì)磷礦粉的解磷效果最好，由于綠肥腐解釋放到土壤中或植物根際中有機(jī)酸濃度較低，所以有機(jī)酸對(duì)難溶性磷的解磷效果主要受到有機(jī)酸陰離子種類(lèi)的限制[5]。低分子量有機(jī)酸陰離子對(duì)土壤無(wú)機(jī)磷的活化，主要是促進(jìn)了土壤中有效性低的無(wú)機(jī)磷形態(tài)向有效性較高的形態(tài)轉(zhuǎn)化，并且這個(gè)過(guò)程與有機(jī)酸的種類(lèi)密切相關(guān)[38]。Bloan等[39]對(duì)蘋(píng)果酸、檸檬酸等7種有機(jī)酸陰離子的研究結(jié)果表明，活化土壤難溶性磷素的能力依次為檸檬酸 ＞草酸 ＞ 酒石酸 ＞ 蘋(píng)果酸 ＞ 乙酸、琥珀酸、乳酸。本研究中通過(guò)對(duì)不同綠肥作物腐解液對(duì)難溶性磷素的活化量進(jìn)行換算后發(fā)現(xiàn)，理論上1 t肥田蘿卜、紫云英、芥菜型油菜、雙高甘藍(lán)型油菜、雙低甘藍(lán)型油菜和二月蘭綠肥經(jīng)過(guò)1個(gè)月的腐解，產(chǎn)生的腐解液活化Al-P和Fe-P可分別產(chǎn)生約為0.9、0.8、0.8、0.7、0.5和0.4 kg生物有效態(tài)磷素。6種綠肥作物中肥田蘿卜植株腐解液對(duì)Al-P、Fe-P的活化總量最大，其次為紫云英和芥菜型油菜綠肥。分析供試綠肥腐解液對(duì)難溶性磷活化能力與其腐解液中不同有機(jī)酸組分含量的相關(guān)性，結(jié)果表明綠肥作物腐解液活化磷素能力高低與其腐解產(chǎn)生的檸檬酸、蘋(píng)果酸、草酸和酒石酸陰離子存在正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明綠肥腐解液對(duì)難溶性磷素的活化作用主要取決于有機(jī)酸組分中的某幾種組分，而非這些有機(jī)酸組分總和的高低。這一結(jié)果與上述研究中的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

與Al-P和Fe-P的活化密切相關(guān)的是有機(jī)酸中含有較高的檸檬酸、草酸、蘋(píng)果酸和酒石酸。供試6種綠肥作物的腐解液分泌的10種有機(jī)酸的總含量及各有機(jī)酸組分的占比差異很大，二月蘭雖然有機(jī)酸總量高，但是檸檬酸、草酸和酒石酸比例均較低。肥田蘿卜腐解液中的酒石酸含量及其占比高于其他綠肥，且檸檬酸和琥珀酸占比較高，對(duì)Fe-P的活化能力強(qiáng)。芥菜型油菜和紫云英腐解液中草酸、檸檬酸和琥珀酸占比高于其他綠肥，對(duì)Al-P的活化能力強(qiáng)。供試6種綠肥中以肥田蘿卜腐解液的活化能力最強(qiáng)，芥菜型油菜和紫云英的活化能力次之。