氟蟲腈亞砜熒光衍生化、HPLC-FLD檢測方法的建立及應(yīng)用

王 夢，周香菊，聶嘉文，彭大勇，陳繼光，張清峰，唐道邦，劉 佳，尹忠平,

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室/江西省農(nóng)產(chǎn)品加工與安全控制工程實驗室，江西南昌 330045；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室/功能食品重點實驗室，廣東廣州 510610）

氟蟲腈（fipronil），又名銳勁特，是羅納-普朗克公司（Rhone-Poulenc，法國）于1987年研制的一種新型含氯、氟的苯基吡唑類殺蟲劑[1]。該物質(zhì)于1993年作為殺蟲劑投入到市場中，我國于1994年開始將其應(yīng)用于蟲害防治，由于殺蟲效果好、使用劑量低、有效作用時間長，曾在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛地使用，但其自然降解較慢，可通過食物鏈富集，且其對人體有較強(qiáng)的毒性，因此對人類健康和安全有較大的危害[2?4]。氟蟲腈可轉(zhuǎn)化生成其他化合物[5]，如厭氧條件下可轉(zhuǎn)化為氟蟲腈亞砜（fipronil sulfide）[6]，而氟蟲腈亞砜又可光解成氟甲腈，進(jìn)而氧化形成氟蟲腈砜[7]。氟蟲腈亞砜與氟蟲腈均具有較強(qiáng)的毒性，其毒性甚至高于其母體氟蟲腈[8?10]，研究表明，氟蟲腈亞砜經(jīng)代謝可分布于體內(nèi)不同組織和器官中，存留時間較長，可蓄積產(chǎn)生毒性作用[11?13]。因此，對農(nóng)產(chǎn)品中氟蟲腈亞砜殘留進(jìn)行檢測和控制是非常有必要的。

目前在研究或使用的氟蟲腈亞砜檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）以及高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）等。龔震等[14]采用固相萃取-高效液相色譜法對雞蛋中殘留的氟蟲腈亞砜進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示檢出限和定量限分別為60、200 μg/kg；戴盡波等[15]建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS /MS）檢測禽源性食品中氟蟲腈亞砜的方法，其檢測限在0.1~0.2 μg/kg之間，定量限為0.5 μg/kg。吳潔珊等[16]建立了氣相色譜快速測定氟蟲腈亞砜殘留量的分析方法，其檢出限和定量限分別為0.2和0.5 μg/kg；高霞等[17]的報道表明，氣相色譜-負(fù)化學(xué)源電離-質(zhì)譜法（GC-NCI/MS）測定蔬菜中氟蟲腈亞砜殘留量的檢測限在0.2~0.3 μg/kg之間，定量限為1.0 μg/kg。從目前的氟蟲腈亞砜檢測研究報道來看，HPLC法操作簡單易行，但無法滿足痕量檢測的要求；HPLC-MS法雖然具有較高的靈敏度和較低檢測限，但需要高端精密的儀器設(shè)備，成本較高；GC法有一定的靈敏度，但不適用沸點高、遇熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，應(yīng)用范圍受限；GC-MS檢測雖然所需樣品少且快速，但也需要貴重設(shè)備，干擾也較多，同時檢測范圍也受限。因此，探索高靈敏度、低成本、簡便快速的氟蟲腈亞砜痕量檢測方法是很有必要的，對氟蟲腈亞砜殘留檢測與控制有重要意義。

高效液相色譜-熒光檢測方法（HPLC-FLD）靈敏度較高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，是目前研究和應(yīng)用的重要痕量檢測方法。趙文晉等[18]建立了一種測定水樣中苯胺的HPLC-FLD檢測法，檢出限可達(dá)0.022 μg/L，定量限為0.073 μg/L。目前尚未見關(guān)于氟蟲腈亞砜HPLCFLD檢測方法方面的研究報道。本文基于實驗室前期合成的、結(jié)構(gòu)新穎的、高熒光強(qiáng)度的咔唑類熒光衍生試劑L2，建立了氟蟲腈亞砜柱前熒光衍生HPLCFLD檢測方法，以期為雞蛋中氟蟲腈亞砜殘留痕量檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氟蟲腈亞砜（HPLC≥98%） 本實驗室合成；熒光衍生試劑L2（HPLC≥98%） 本實驗室合成；二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、氯化鈉和無水硫酸鈉 分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、4-二甲氨基吡啶和N,N-二環(huán)己基碳酰亞胺（DCC） 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司采購；乙腈 色譜純，美國Tieda試劑有限公司；三乙胺（TEA）和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBOP） 分析純，西寶生物科技（上海）股份有限公司；四氫呋喃 化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜（純度為99%） 上海索來寶科技有限公司；雞蛋樣品市購。

DEAAXO4033高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）、GC-MS5975C質(zhì)譜儀 美國安捷倫科技有限公司；400/500MHZ Advance核磁共振波譜儀 布魯克科技有限公司；MR Hei-End恒溫加熱磁力攪拌器 德國海道夫集團(tuán)；FSH-2A高速勻漿機(jī) 金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；TD4低速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HZQ-2冷凍恒溫振蕩器 金壇市國旺實驗儀器廠；Precision MLG3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國海道夫集團(tuán)；超純水制備儀 美國Milli-Q科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氟蟲腈亞砜柱前熒光衍生化方法

1.2.1.1 柱前熒光衍生化反應(yīng)的原理和操作步驟反應(yīng)原理：熒光衍生試劑L2的羧基與氟蟲腈亞砜的氨基之間進(jìn)行脫水縮合，經(jīng)酰胺化反應(yīng)后生成熒光衍生化產(chǎn)物DX1，反應(yīng)如圖1所示。具體操作步驟如下：向2 mL安瓿瓶中依次加入600 μL二氯甲烷（DCM）、200 μL濃度為0.1 mol/L的1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、200 μL濃度為0.2 mol/L的4-二甲氨基吡啶（DMAP）、50 μL濃度為1.0×10?3mol/L的氟蟲腈亞砜和800 μL濃度為5.0×10?4mol/L的熒光衍生試劑L2，以上溶液均用乙腈溶解，密封；充分混勻后置于45 ℃水浴中振蕩反應(yīng)75 min；隨后取出冷卻至室溫，乙腈定容至10 mL；取樣進(jìn)行HPLC-FLD檢測。

圖1 氟蟲腈亞砜與熒光衍生試劑L2柱前衍生化反應(yīng)方程式Fig.1 Reaction equation of precolumn fluorescence derivatization reaction between L2 and fipronil sulfide

1.2.1.2 熒光衍生化反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化試驗設(shè)計 為了提高衍生效率，以衍生化反應(yīng)后HPLC-FLD檢測所得的衍生產(chǎn)物DX1的峰面積作為衡量指標(biāo)，采用單因素試驗對衍生化反應(yīng)主要條件進(jìn)行了優(yōu)化，試驗梯度水平設(shè)置如下：a.催化劑：選取EDC/DMAP、DCC/DMAP和PyBOP/TEA三種催化劑進(jìn)行試驗，其他試驗條件如下：反應(yīng)時間30 min、反應(yīng)溫度45 ℃、熒光衍生試劑與氟蟲腈亞砜的用量比6:1、反應(yīng)溶劑為乙腈；b.反應(yīng)時間：選取15、30、45、60、75、90、105、120 min不同反應(yīng)時間進(jìn)行試驗，其他試驗條件如下：以EDC/DMAP為催化劑、反應(yīng)溫度45 ℃、熒光衍生試劑與氟蟲腈亞砜的用量比6:1、反應(yīng)溶劑為乙腈；c.反應(yīng)溫度：選取5、15、25、35、45、55、65 ℃不同反應(yīng)溫度進(jìn)行試驗，其他試驗條件如下：以EDC/DMAP為催化劑、反應(yīng)時間為75 min、熒光衍生試劑與氟蟲腈亞砜的用量比6:1、反應(yīng)溶劑為乙腈；d. n（熒光衍生試劑）/n（氟蟲腈亞砜）：選取熒光衍生試劑與氟蟲腈亞砜用量比為1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1進(jìn)行試驗，其他試驗條件如下：以EDC/DMAP為催化劑、反應(yīng)時間為75 min、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)溶劑為乙腈；e.反應(yīng)溶劑：選取DCM、THF、乙腈、DMF、DMSO五種溶劑進(jìn)行試驗，其他試驗條件如下：以EDC/DMAP為催化劑、反應(yīng)時間為75 min、反應(yīng)溫度45 ℃、熒光衍生試劑與氟蟲腈亞砜的用量比8:1。

1.2.2 熒光衍生化反應(yīng)產(chǎn)物分離、純化及表征方法

1.2.2.1 熒光衍生化反應(yīng)產(chǎn)物的分離和純化 以EDC/DMAP為催化縮合劑、二氯甲烷為反應(yīng)溶劑，氟蟲腈亞砜與熒光衍生試劑L2的用量比為1:8，在45 ℃水浴中反應(yīng)75 min；反應(yīng)結(jié)束后，以硅膠柱層析法對衍生產(chǎn)物N-（3-氰基-1-（2,6-二氯-4-（三氟甲基）苯基）-4-（（三氟甲基）硫代）-1H-吡唑-5-基）-4-（2-（9-乙基-9H-咔唑-3-基）-1H-菲并[9,10-d]咪唑-1-基）丁酰胺（DX1）進(jìn)行分離和純化。

1.2.2.2 熒光衍生化反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征 分離、純化后的衍生化產(chǎn)物DX1，采用1H NMR、13C NMR和HRMS等波譜檢測技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定與表征。

1.2.2.3 熒光衍生化反應(yīng)產(chǎn)物的熒光特性表征 以乙腈為溶劑，采用熒光分光光度計對DX1的熒光光譜性質(zhì)進(jìn)行掃描檢測。熒光掃描的狹縫設(shè)置為10 nm/10 nm，以最大吸收波長進(jìn)行激發(fā)，通過掃描獲取發(fā)射波長；同時，根據(jù)所測定的發(fā)射波長與激發(fā)波長計算Stokes位移[19?20]。

1.2.3 雞蛋中殘留氟蟲腈亞砜的提取方法 根據(jù)GB 23200.115-2018 所述的方法，提取雞蛋中殘留的氟蟲腈代謝物-氟蟲腈亞砜和進(jìn)行測前處理[21]。將樣品雞蛋去殼，以勻漿機(jī)充分混合均勻；準(zhǔn)確稱量5 g雞蛋勻漿液（精確至 0.01 g），置于 50 mL 離心管，加入 20 mL 色譜純乙腈溶液；手動振蕩混合1 min，再以恒溫振蕩器振蕩 5 min；隨后向離心管中依次添加2 g 氯化鈉和 6 g 無水硫酸鈉，再手動振蕩混合 1 min；在 4000 r/min 下離心 10 min；取上清液，4 ℃ 冰箱保存、待測。

1.2.4 氟蟲腈亞砜柱前熒光衍生化產(chǎn)物 HPLC-FLD檢測方法 主要檢測條件如下：Symmetry C18色譜柱：4.6×250 mm, 5 μm；柱溫為 40 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為 20 μL；流動相 A：100% 純乙腈；流動相 B：超純水；洗脫方式：等度洗脫，A 相為80%，B 相為 20%；激發(fā)波長和發(fā)射波長：分別為 310和 404 nm。色譜柱在檢測前以流動相平衡 10 min，所有檢測樣品在進(jìn)樣前均以 0.22 μm 濾膜過濾。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 加標(biāo)回收率 準(zhǔn)確稱取5 g新鮮雞蛋勻漿液，分別添加5、1、0.1 μg氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2.3中所述的方法提取雞蛋樣品中的氟蟲腈亞砜，并以L2為熒光衍生試劑按1.2.1所述的方法分別進(jìn)行柱前熒光衍生化反應(yīng)，再按1.2.4中所述的HPLCFLD檢測方法進(jìn)行測定，計算加標(biāo)回收率。

1.2.5.2 檢測限和定量限計算方法 參照賈離離等[22]的方法，以3倍信噪比計算檢測限和10倍信噪比計算定量限，建立檢測回歸方程。

1.2.5.3 精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性評價方法 分別參照Madrera等[23]、Xiong等[24]、于海英等[25]的方法，進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性的評價。精密度：連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行HPLC-FLD檢測，分別記錄衍生化產(chǎn)物DX1的保留時間和峰面積，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。穩(wěn)定性：待測衍生化產(chǎn)物于室溫下放置，分別在第1、2、4、8、24 h進(jìn)行進(jìn)樣檢測，計算衍生產(chǎn)物DX1保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。重現(xiàn)性：按照1.2.2中所述的方法，重復(fù)進(jìn)行6次柱前熒光衍生化反應(yīng)試驗，上樣檢測DX1的保留時間和峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文所有試驗數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，每組樣品設(shè)置3個重復(fù)，分別進(jìn)行3次平行測定，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟蟲腈亞砜柱前熒光衍生化反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 催化劑的優(yōu)選 本文所設(shè)計的氟蟲腈亞砜柱前熒光衍生化反應(yīng)是一種脫水縮合反應(yīng)，熒光衍生試劑L2的羧基與氟蟲腈亞砜的氨基之間進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，脫水縮合形成熒光衍生化產(chǎn)物DX1。根據(jù)已有文獻(xiàn)報道[26?29]，本文選擇“DCC/DMAP”、“EDC/DMAP”和“PyBOP/TEA”三種堿性催化劑來進(jìn)行試驗，以優(yōu)選出高效率的催化劑。試驗結(jié)果（如圖2a）表明，三種催化劑的效果差異非常顯著，以PyBOP/TEA為催化劑，衍生化反應(yīng)基本上不會發(fā)生；DCC/DMAP能促進(jìn)衍生化反應(yīng)，但效率顯著低于EDC/DMAP；在本文所設(shè)定的條件下，EDC/DMAP的催化效率最高。因此，EDC/DMAP為該反應(yīng)的優(yōu)選催化劑。

圖2 催化劑、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、衍生試劑與氟蟲腈亞砜的用量比及反應(yīng)溶劑對氟蟲腈亞砜衍生化效率的影響Fig.2 Influence of catalyzer, reaction time, reaction temperature, ratio of fipronil sulfoxide to fluorescence derivatization reagent, and reaction solvent on the derivatizing efficiency of fipronil

2.1.2 反應(yīng)時間的優(yōu)化 本文設(shè)置了15~105 min六個反應(yīng)時間進(jìn)行單因素實驗，結(jié)果如圖2b所示。在15~75 min內(nèi)，衍生化產(chǎn)物的產(chǎn)量呈現(xiàn)線性、快速上升的趨勢；75 min時產(chǎn)量達(dá)到最大；而后再延長反應(yīng)時間，會導(dǎo)致產(chǎn)量上的小幅下降。因此，確定75 min為優(yōu)選反應(yīng)時間。

2.1.3 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 如圖2c所示，在反應(yīng)時間設(shè)定為75 min時，溫度對衍生化產(chǎn)物的產(chǎn)量有較大的影響。當(dāng)溫度從5 ℃上升到45 ℃時，產(chǎn)量呈上升的趨勢，特別是從35 ℃升到45 ℃時，產(chǎn)量出現(xiàn)了激增；繼續(xù)升溫，產(chǎn)量有下降的趨勢。由此可知，45 ℃為比較合適的衍生化反應(yīng)溫度。

2.1.4 衍生試劑用量的優(yōu)化 衍生試劑的用量對衍生反應(yīng)有重要影響[30]，本文選擇了11個用量進(jìn)行優(yōu)化試驗。由圖2d可知，隨著熒光衍生試劑L2用量的增加，衍生產(chǎn)物DX1的產(chǎn)量持續(xù)增大，在n（熒光衍生試劑）/n（氟蟲腈亞砜）為8:1時，產(chǎn)量達(dá)到峰值；如果繼續(xù)增加用量，產(chǎn)量反應(yīng)會出現(xiàn)明顯的下降。上述結(jié)果表明，衍生化反應(yīng)在n（熒光衍生試劑）/n（氟蟲腈亞砜）等于8:1時效果最佳。

2.1.5 反應(yīng)溶劑的優(yōu)選 本文選取二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、四氫呋喃（THF）、二甲基亞砜（DMSO）以及乙腈五種常用的衍生化反應(yīng)溶劑進(jìn)行單因素實驗，以選擇出合適的反應(yīng)溶劑，結(jié)果如圖2e所示。通過試驗發(fā)現(xiàn)，熒光衍生試劑L2和氟蟲腈亞砜在DCM中反應(yīng)較為完全，目標(biāo)物產(chǎn)量顯著高于其它四種溶劑，其次是乙腈。從結(jié)果來看，THF、DMF和DMSO不適合作為衍生反應(yīng)的溶劑。在DCM中衍生化反應(yīng)效果較好，可能是因為DCM對各反應(yīng)物都具有良好的溶解性，具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。據(jù)此，確定DCM為優(yōu)選衍生化反應(yīng)溶劑。

綜上所述，氟蟲腈亞砜柱前衍生化反應(yīng)的優(yōu)選條件如下：EDC/DMAP為催化劑，反應(yīng)時間和衍生溫度分別為75 min、45 ℃，熒光生試劑用量為n（熒光衍衍生試劑）/n（氟蟲腈亞砜）=8:1，二氯甲烷為反應(yīng)溶劑。

2.2 柱前熒光衍生化產(chǎn)物DX1的結(jié)構(gòu)和熒光特性表征

2.2.1 DX1結(jié)構(gòu)檢測與表征 衍生產(chǎn)物DX1：本文采用熒光衍生試劑L2對氟蟲腈亞砜進(jìn)行柱前衍生化，所設(shè)計的目標(biāo)衍生化產(chǎn)物為N-（3-氰基-1-（2,6-二氯-4-（三氟甲基）苯基）-4-（（三氟甲基）硫代）-1H-吡唑-5-基）-4-（2-（9-乙基-9H-咔 唑-3-基）-1H-菲 并[9,10-d]咪 唑-1-基）丁 酰 胺（N-（3-cyano-1-（2,6-dichloro-4-（trifluoromethyl）phenyl）-4-（（trifluoromethyl）thio）-1H-pyrazol-5-yl）-4-（2-（9-ethyl-9Hcarbazol-3-yl）-1H-phenanthro[9,10-d]imidazol-1-yl）butanamide），命名為DX1。經(jīng)分離、純化和1H NMR、13C NMR和HRMS等檢測分析，確認(rèn)所得的衍生化產(chǎn)物是所設(shè)計的目標(biāo)物。DX1主要結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)如下：

DX1：白色固體，產(chǎn)率76.4%。1H NMR（400 MHz,DMSO）δ13.39（s, 1H）, 9.07（d, J=1.2 Hz, 1H）, 8.87（dd, J=13.2, 8.3 Hz, 2H）, 8.62（dd, J=22.1, 7.7 Hz,2H）, 8.45（dd, J=8.6, 1.5 Hz, 1H）, 8.29（d, J=7.7 Hz,1H）, 7.84（d, J=8.6 Hz, 1H）, 7.76（dt, J=11.0, 7.5 Hz,2H）, 7.71–7.60（m, 3H）, 7.53（t, J=7.3 Hz, 1H）, 7.31（t,J=7.4 Hz, 1H）, 5.56（d, J=7.9 Hz, 2H）, 4.54（q, J=7.1 Hz,2H）, 1.70（dd, J=16.1, 13.0 Hz, 2H）, 1.61（dd, J=9.0,3.8 Hz, 2H）, 1.24（s, 3H）.13C NMR（101 MHz, DMSO）δ156.58, 150.49, 140.07, 127.40, 127.01, 126.22,123.70, 122.47, 121.89, 120.41, 119.34, 118.27,109.49, 47.47, 37.17, 33.31, 25.29, 24.42, 13.77.Calcd for C45H29Cl2F6N7OS: 899.1436, HRMS（ESI）m/z [M+H]+: found 900.1508.

2.2.2 DX1熒光特性檢測與表征 熒光掃描檢測結(jié)果（如圖3所示）表明，衍生化產(chǎn)物DX1與熒光衍生試劑L2的熒光光譜特征基本相同，L2的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為310和398 nm，斯托克斯位移為88 nm；DX1的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為310和404 nm, 斯托克斯位移為94 nm，兩者的最大激發(fā)波長相同，但DX1的最大發(fā)射波長比L2增加6 nm，即Stokes位移增大了6 nm，較大的Stokes位移大大減少了檢測時激發(fā)光對發(fā)射光的干擾，保證了檢測的準(zhǔn)確性。DX1的高熒光強(qiáng)度和較大的Stokes位移，為建立靈敏、準(zhǔn)確、可靠的柱前衍生化HPLC-FLD方法檢測痕量氟蟲腈亞砜殘留提供了保證。

圖3 熒光衍生試劑L2和氟蟲腈亞砜衍生化產(chǎn)物DX1的熒光光譜掃描圖Fig.3 Spectrograms of fluorescence scanning of fluorescent derivatization reagent L2 and its derivative DX1

2.3 氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的建立和評價

2.3.1 氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的線性回歸方程及檢測限和定量限 基于前述柱前衍生化反應(yīng)優(yōu)化條件和氟蟲腈亞砜柱前衍生化產(chǎn)物DX1的HPLC-FLD檢測條件，所建立的氟蟲腈亞砜HPLCFLD檢測方法的線性回歸方程為Y=194.95X?0.0609（如表1），該回歸方程的相關(guān)系數(shù)r達(dá)到了0.9999，展現(xiàn)出了良好的線性相關(guān)性。此外，該方法的檢測限和定量限分別達(dá)到了0.033和0.092 μg/L，具有很高的靈敏度。

表1 氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限Table 1 Linear regression equation, determination coefficient,LOD and LOQ of fipronil sulfide determination by HPLC-FLD

2.3.2 氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和精密度 氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和精密度如表2所示。從表2的數(shù)據(jù)可知，這三個評價指標(biāo)的保留時間的RSD均低于0.07%，峰面積的RSD均低于2.1%。這些方法學(xué)評價數(shù)據(jù)表明，所建立的檢測方法穩(wěn)定、可靠，可應(yīng)用于實際樣品的檢測。

表2 氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性Table 2 Precision, stability and reproducibility of fipronil sulfide determination by HPLC-FLD

2.4 雞蛋中殘留氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的建立和評價

2.4.1 雞蛋中殘留氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的加標(biāo)回收率 由表3可知，本文所建立的雞蛋中殘留氟蟲腈及其代謝物HPLC-FLD檢測方法的加標(biāo)回收率在84.68%~94.50%范圍之內(nèi)，重復(fù)性RSD低于1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.05%~3.65%，表明該方法具有很好的回收率，提取、衍生化和檢測的結(jié)果是比較可靠的。

表3 雞蛋中殘留氟蟲腈亞砜柱前衍生化HPLC-FLD檢測的加標(biāo)回收率Table 3 Recovery rate of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in eggs by pre-column derivatization

2.4.2 雞蛋中殘留氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的檢測限、定量限和靈敏度 方法學(xué)評價結(jié)果表明，本文建立的雞蛋中殘留氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的檢測限和定量限分別達(dá)0.052和0.132 μg/kg（如表4），具有較好的靈敏度。戴盡波等[15]建立了禽源性食品中殘留氟蟲腈亞砜的UPLC-MS/MS檢測方法，檢測限為0.1~0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。根據(jù)高霞等[17]的報道，GC-NCI/MS測定蔬菜中殘留氟蟲腈亞砜的檢出限在0.2~0.3 μg/kg之間，定量限為1.0 μg/kg。從檢測限和定量限這兩個重要的方法學(xué)評價指標(biāo)來看，本文建立的雞蛋中殘留氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法已優(yōu)于HPLC-MS和GC-MS。

表4 雞蛋中殘留氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的檢測限、定量限和靈敏度Table 4 LOD and LOQ of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in eggs by pre-column derivatization

2.4.3 雞蛋中殘留氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性 由表5數(shù)據(jù)可知，本文建立的雞蛋中殘留氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性三個指標(biāo)的保留時間RSD均低于0.04%，峰面積的RSD值均低于2.7%，表明方法穩(wěn)定、可靠。

表5 雞蛋中殘留氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性Table 5 Precision, stability and reproducibility of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in eggs by pre-column derivatization

2.4.4 雞蛋中殘留氟蟲腈亞砜的檢測結(jié)果與分析采用本文所建立的HPLC-FLD檢測方法，對所采集的源自于5個省的25份雞蛋樣品中的殘留氟蟲腈亞砜進(jìn)行了檢測與分析，結(jié)果表明（如表6和圖4），所有的25份樣品中均未檢測出氟蟲腈亞砜，說明本文采樣點產(chǎn)地的雞蛋在氟蟲腈亞砜殘留這個指標(biāo)上是安全的。

圖4 雞蛋樣品中殘留氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測色譜圖Fig.4 Chromatograms of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in sample eggs

表6 五省二十五份雞蛋樣品殘留氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測結(jié)果Table 6 Determination results of residual fipronil sulfide in 25 sample eggs collected from 5 provinces by HPLC-FLD

3 結(jié)論

本文建立并優(yōu)化了氟蟲腈亞砜的柱前熒光衍生化方法，優(yōu)化后的主要反應(yīng)條件如下：催化縮合劑為EDC/DMAP；反應(yīng)溶劑為二氯甲烷；氟蟲腈亞砜與熒光衍生試劑的用量比為1:8；45 ℃水浴中反應(yīng)75 min。衍生化所生成的目標(biāo)產(chǎn)物DX1具有很高的熒光強(qiáng)度?；跓晒庋苌磻?yīng)優(yōu)化條件和產(chǎn)物熒光特征，建立了氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法，其檢測限為0.033 μg/L，定量限為0.092 μg/L。在此基礎(chǔ)上，建立雞蛋殘留氟蟲腈亞砜提取和檢測的HPLC-FLD方法，檢測限和定量限分別達(dá)0.052和0.132 μg/kg，精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性在保留時間和峰面積上的RSD分別小于0.04%和2.7%。上述結(jié)果表明，本文建立的氟蟲腈亞砜HPLC-FLD檢測方法較為靈敏可靠，在雞蛋氟蟲腈亞砜殘留檢測中具有較好的應(yīng)用前景。但氟蟲腈在體內(nèi)的代謝比較復(fù)雜，還有氟甲腈和氟蟲腈砜等代謝物，本文僅對氟蟲腈亞砜建立了檢測方法，后續(xù)還需建立和完善氟蟲腈其它代謝物的檢測方法，為氟蟲腈及其代謝物的檢測與控制提供支撐。