藍(lán)靛果中可降解有機(jī)酸的酵母菌株篩選及鑒定

盧思言，曾祥玉，王鑫源，苗曦文，文連奎，賀 陽

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118）

藍(lán)靛果（Lonicera edulis）為忍冬科、忍冬屬植物，又名藍(lán)靛果忍冬，俗稱羊奶子或山茄子，在長白山區(qū)有分布。藍(lán)靛果富含豐富的花青素、有機(jī)酸和礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分，為藥食兩用植物，除提取花青素外，目前多加工果汁、果酒、果醬等產(chǎn)品。因藍(lán)靛果含有較高的有機(jī)酸，影響果酒等產(chǎn)品口感[1?3]，篩選具有降酸作用的微生物十分必要。

果酒降酸方法主要有物理降酸法、化學(xué)降酸法及生物降酸法[4?7]，其中生物降酸是通過微生物發(fā)酵來分解有機(jī)酸以達(dá)到降酸目的，對(duì)果酒質(zhì)量和果酒穩(wěn)定性影響最小，同時(shí)還能增加風(fēng)味，是果酒降酸研究的熱點(diǎn)[8]。目前生物降酸主要是蘋果酸-乳酸發(fā)酵降酸，粟酒裂殖酵母發(fā)酵降酸以及通過基因重組技術(shù)構(gòu)建新型酵母菌株進(jìn)行降酸[9?11]。酵母菌降酸的原理是把有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為酒精和CO2而達(dá)到降酸的目的[12]。郝愛玲等[13]選取篩選自酒莊的菌株東方伊薩酵母M130，降解獼猴桃中的檸檬酸，降酸率達(dá)18.12%，且發(fā)酵結(jié)束后酒體澄清、透明，香氣濃郁。胡小露[14]篩選獲得的鎖擲酵母屬酵母菌可將檸檬酸含量由10.23降至4.66 g/L，同時(shí)可使藍(lán)莓酒中檸檬酸含量由1.14降至0.59 g/L，且總糖、酒精度、花青素幾乎不變。黃鷺強(qiáng)[15]通過對(duì)粟酒裂殖酵母蘋果酸基因克隆，構(gòu)建整合型質(zhì)粒并在產(chǎn)朊假絲酵母中進(jìn)行表達(dá)，使獲得的重組酵母菌株CU-6具有降解蘋果酸的能力，降酸率達(dá)59.56%。楊華等[16]篩選出一株對(duì)紅豆越橘果酒具有明顯降酸效果的二孢接合酵母BY-9，該降酸菌株可以使紅豆越橘果酒的總酸含量下降12.26%，試驗(yàn)結(jié)果表明二孢接合酵母具有良好的降酸能力，同時(shí)對(duì)酒精的耐受體積分?jǐn)?shù)為20%，對(duì)SO2耐受質(zhì)量濃度為300 mg/L。

目前，能夠降解多種有機(jī)酸的菌株研究較少，本文首次從長白山藍(lán)靛果中篩選到能夠同時(shí)降解蘋果酸、檸檬酸、酒石酸的菌株，利用26S rDNA序列分析及生理生化試驗(yàn)對(duì)降酸菌株進(jìn)行鑒定，研究其對(duì)葡萄糖、SO2及酒精的耐受性，降低藍(lán)靛果等長白山野生漿果中有機(jī)酸含量，從而為開發(fā)果酒產(chǎn)品及菌株后續(xù)的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)靛果 2019年6月采于吉林省撫松縣，采摘后用冰袋保存運(yùn)回吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程實(shí)驗(yàn)室備用；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Yeast Peptone Dextrose Agar Medium）、YPD液體培養(yǎng)基（YPD Broth） 青島海博生物科技有限公司；酒石酸、蘋果酸、檸檬酸 分析純，北京化工廠；L-酒石酸、蘋果酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純） 賽默飛世爾有限公司；DNA膠回收試劑盒、真菌基因組DNA抽提試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司；常規(guī)藥品試劑均為國產(chǎn)分析純或優(yōu)級(jí)純。

HZQ-F160生化振蕩培養(yǎng)箱 上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋BXM-30R

上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；低速離心機(jī)LD5-2B 北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；生物顯微鏡LEICA DM1000、Verity 96well 型PCR儀 美國ABI公司；FR-980A型凝膠成像儀 上海復(fù)日科技有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；1200 Series（G1314B VWD)高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；Lambda365紫外分光光度計(jì)PerkinElmer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離純化 將藍(lán)靛果破碎研磨成果漿，用接種環(huán)挑取果漿在平板劃線，在30 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，繼續(xù)挑取酵母菌單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)72 h，重復(fù)平板畫線純化培養(yǎng)[17?18]；配制5 g YPD液體培養(yǎng)基溶于100 mL蒸餾水中，滅菌后選取長勢(shì)優(yōu)良的酵母菌單菌落放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在振蕩培養(yǎng)箱中以30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)72 h，最后進(jìn)行甘油保存并命名[19]。

1.2.2 優(yōu)勢(shì)降酸菌株篩選及降酸進(jìn)程變化 分別配制質(zhì)量濃度為12 g/L的蘋果酸、檸檬酸、酒石酸酸液。由于YPD培養(yǎng)基中有含酸物質(zhì)，故最終有機(jī)酸質(zhì)量濃度分別為13.33、12.53和13.04 g/L。將純化優(yōu)良的菌株分別接種到有機(jī)酸溶液當(dāng)中，在振蕩培養(yǎng)箱中以30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)5 d[20]，按照GB 5009.157-2016采用酸堿滴定法，每天測(cè)定有機(jī)酸總酸含量，重復(fù)3次取平均值，以最終降酸率為指標(biāo)篩選出降酸效果較好的優(yōu)勢(shì)菌株。根據(jù)優(yōu)勢(shì)降酸菌株發(fā)酵5 d內(nèi)有機(jī)酸含量變化，對(duì)降酸效果最優(yōu)的菌株進(jìn)行降酸效果分析。

式中，A0為未加菌液的有機(jī)酸質(zhì)量濃度；A1為加入菌液以后的有機(jī)酸質(zhì)量濃度。

1.2.3 優(yōu)勢(shì)菌株降解藍(lán)靛果汁中有機(jī)酸試驗(yàn) 采用高效液相色譜法測(cè)定藍(lán)靛果樣品中蘋果酸、檸檬酸、酒石酸含量，與經(jīng)過菌株B5按1.2.2方法降酸5 d后的藍(lán)靛果樣品對(duì)比觀察降酸效果，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照有機(jī)酸種類，按峰面積和回歸方程計(jì)算降酸率[21]。

高效液相色譜測(cè)定條件：色譜柱Agilent ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液-甲醇，體積比為97.5:2.5，等度洗脫10 min，然后用較短的時(shí)間梯度讓甲醇相達(dá)到100%并平衡5 min，再將流動(dòng)相調(diào)整為0.1%磷酸溶液-甲醇體積比為97.5:2.5，平衡5 min。流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為40 ℃，檢測(cè)波長為210 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別用超純水溶解配制不同濃度的L-酒石酸、蘋果酸、檸檬酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC測(cè)定，得到有機(jī)酸質(zhì)量濃度（x）和峰面積（y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程及相關(guān)系數(shù)[21]。

樣品處理：降酸前后的藍(lán)靛果樣品分別離心（4000 r/min，15 min），吸取上清液于容量瓶中，用超純水定容，稀釋為適合濃度。用 0.22 μm 濾膜過濾后注入高效液相色譜儀中測(cè)定[22]。

1.2.4 優(yōu)勢(shì)降酸菌株鑒定 菌株形態(tài)學(xué)鑒定：進(jìn)行平板培養(yǎng)，挑取菌落進(jìn)行染色鏡檢，觀察菌落的生長狀況及形態(tài)特征。將酵母菌菌液稀釋涂布于酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃ 培養(yǎng)72 h，觀察其菌落形態(tài)；挑取單菌落于載玻片，經(jīng)美藍(lán)染液染色后，用生物顯微鏡觀察其菌株生長狀況及細(xì)胞形態(tài)特征[23?24]。

菌株生理生化鑒定：參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》進(jìn)行降酸菌株的糖發(fā)酵、同化碳源、同化氮源試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)，30 ℃有氧條件下培養(yǎng)24 h[25]。

分子生物學(xué)鑒定：取篩選獲得降酸效果良好的菌體溶于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（Code No.D304）中變性后離心取上清作為模板（Template DNA），反應(yīng)條件為80 ℃，15 min。

使用2×TransTaq?High Fidelity（HiFi）PCR Super Mix I（TransGen Biotech，Code No：AS131），進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。陰性對(duì)照使用3 μL的 26S-free H2O替代模板DNA；陽性對(duì)照使用3 μL的某已知菌株26S rDNA替代模板DNA。

PCR反應(yīng)體系為：Template DNA 3 μL，F(xiàn)orward primer（10 pmol/μL）1 μL，Reverse primer（10 pmol/μL）1 μL，2×TransTaq? HiFi PCR SuperMix I 25 μL，16Sfree H2O 20 μL，Total 50 μL。

PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1.5 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。

26S rDNA測(cè)序：以NL1和NL4為引物，上游引物NL1：5' -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAA G-3'；下游引物NL4：5' -GGTCCGTGTTTCAAGA CGG-3'。

將上述測(cè)序結(jié)果輸入Genebank中，利用BLAST功能組件將測(cè)得的基因序列與Genebank數(shù)據(jù)庫中26S rDNA 序列進(jìn)行同源性比較。選取BLAST結(jié)果中得分較高的菌的26S rDNA序列，使用MEGA 5.2.1軟件根據(jù)Neighbor-Joining進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析[26]。

1.3 降酸菌株耐受性測(cè)定

在果酒發(fā)酵過程中會(huì)加入二氧化硫殺菌，發(fā)酵底物還原糖及其他成分還會(huì)產(chǎn)生滲透壓，發(fā)酵產(chǎn)物為酒精，故需測(cè)定菌株的耐受性。

1.3.1 葡萄糖耐受性的測(cè)定 將降酸酵母菌株以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種到50、100、150、200、250 g/L的液體培養(yǎng)基中，控制溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，以液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，分別在600 nm處測(cè)定酵母菌懸濁液OD值，平行重復(fù)3次。根據(jù)600 nm處OD 值確定降酸酵母菌株的葡萄糖耐受性[27]，參照國標(biāo)GB4789-17測(cè)定菌落總數(shù)。

1.3.2 酒精耐受性的測(cè)定 將降酸酵母菌株以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種到酒精度為6%vol、9%vol、12%vol、15%vol、18%vol 的YPD液體培養(yǎng)基中，控制溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，以YPD液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，分別在600 nm處測(cè)定酵母菌懸濁液OD值，平行重復(fù)3次。依據(jù)600 nm處OD值確定降酸酵母菌株的酒精耐受性[28]，參照國標(biāo)GB/T 4789.17-2003測(cè)定菌落總數(shù)。

1.3.3 SO2耐受性的測(cè)定 將降酸酵母菌株以體積分?jǐn)?shù)2%接種到100、200、300、400、500 mg/L的SO2液體培養(yǎng)基中，控制溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，以SO2液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，分別在600 nm處測(cè)定酵母菌懸濁液OD值，平行重復(fù)3次。根據(jù)600 nm處OD值確定降酸酵母菌株的SO2耐受性[29]，參照國標(biāo)GB/T 4789.17-2003測(cè)定菌落總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)分別均進(jìn)行三次重復(fù)，結(jié)果以平均值±SD表示。數(shù)據(jù)采用Excel、Origin 8.5、GraphPad Prism6、SPSS24進(jìn)行處理分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢(shì)降酸菌株篩選及降酸效果分析

2.1.1 優(yōu)勢(shì)降酸菌株篩選 將分離出的酵母菌株對(duì)蘋果酸、檸檬酸、酒石酸三種有機(jī)酸進(jìn)行降酸率測(cè)定，結(jié)果如圖1。由圖1可見，共篩選出5株酵母菌株，分別命名B1、B2、B3、B4、B5，其中對(duì)三種主要有機(jī)酸降解能力分析可知，菌株B1降酸率為16.95%±0.36%、1.13%±0.23%、1.87%±0.40%；菌株B2降酸率為2.93%±0.58%、?0.29%±0.71%、12.09%±0.69%；菌株B3降酸率為?1.74%±0.42%、3.12%±0.38%、?0.65%±0.61%；菌株B4降酸率為12.18%±0.72%、7.51%±0.27%、0.66%±0.25%；菌株B5的降酸率為42.60%±0.85%、18.28%±0.80%、13.09%±0.61%；其中菌株B5對(duì)于蘋果酸降酸率最高為42.60%±0.85%，降解蘋果酸效果最好，同時(shí)對(duì)酒石酸和檸檬酸也具有降酸效果，故選取菌株B5為最佳降酸菌株。

圖1 不同菌株對(duì)蘋果酸、檸檬酸、酒石酸的降酸率Fig.1 Acid reducing rates of malic acid, citric acid and tartaric acid by different strains

2.1.2 優(yōu)勢(shì)菌株B5降酸效果分析 經(jīng)篩選獲得的優(yōu)勢(shì)降酸菌株B5在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d的含酸量變化，結(jié)果如圖2。由圖2可得，三種主要有機(jī)酸中蘋果酸含量由13.33±0.13 g/L下降到7.65±0.09 g/L；檸檬酸含量由12.53±0.17 g/L下降到10.24±0.10 g/L；酒石酸含量由13.04±0.06 g/L下降到11.33±0.09 g/L；在發(fā)酵5 d過程中蘋果酸、檸檬酸、酒石酸質(zhì)量濃度均呈持續(xù)下降趨勢(shì)，其中發(fā)酵第1 d三種有機(jī)酸質(zhì)量濃度均無明顯變化，在3~4 d過程中蘋果酸質(zhì)量濃度下降最多，降酸效果最明顯。T檢驗(yàn)得到降酸前后含酸量差異極顯著（P<0.01）。趙玉平等[30]采用畢赤酵母對(duì)山楂汁中的有機(jī)酸進(jìn)行降解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酵母菌株可以降解檸檬酸和蘋果酸，對(duì)其他有機(jī)酸無明顯降酸能力，其中檸檬酸降解速度在0~72 h階段與時(shí)間呈線性關(guān)系，蘋果酸降解則發(fā)生在48~72 h。

圖2 不同時(shí)間菌株B5對(duì)蘋果酸、檸檬酸、酒石酸的降酸率Fig.2 Acid reducing rate of strain B5 on malic acid, citric acid and tartaric acid at different time

2.2 優(yōu)勢(shì)菌株降解藍(lán)靛果汁中有機(jī)酸結(jié)果

蘋果酸、檸檬酸、酒石酸三種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，藍(lán)靛果樣品以及加入菌株B5降酸后的藍(lán)靛果汁樣品有機(jī)酸HPLC色譜圖如圖3（a）~圖3（c） 所示。

由圖3（a）可知有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分離良好，且與圖3（b）~圖3（c）的三種主要有機(jī)酸出峰時(shí)間幾乎對(duì)應(yīng)。圖3（b）為藍(lán)靛果樣品圖，其中蘋果酸含量最高，檸檬酸和酒石酸其次。與加入降酸菌株B5后的藍(lán)靛果樣品圖3（c）相比，三種有機(jī)酸峰面積均有不同程度減小，其中蘋果酸最為明顯，可知酵母菌株B5對(duì)藍(lán)靛果中蘋果酸的降解效果最好，根據(jù)回歸方程得降酸率為36.24%，同酸堿滴定法測(cè)定的降酸趨勢(shì)一致。

圖3 菌株B5對(duì)藍(lán)靛果果汁中有機(jī)酸的降解結(jié)果Fig.3 Degradation of organic acids in Lonicera edulis juice by strain B5

2.3 優(yōu)勢(shì)降酸菌株鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 將菌株B5置酵母菌固體培養(yǎng)基中，在30 ℃ 條件下培養(yǎng)5 d后進(jìn)行形態(tài)觀察。用肉眼觀察可發(fā)現(xiàn)菌株B5菌落為乳白色，球形，表面光滑，質(zhì)地均勻粘稠，中間略有凸起，邊緣整齊。如圖4（a）用生物顯微鏡觀察細(xì)胞呈橢圓形，子囊內(nèi)含有1~4枚光滑的橢圓形子囊孢子。根據(jù)初步觀察可得菌株B5為酵母菌株（圖4（b））。

圖4 菌株B5形態(tài)學(xué)鑒定圖Fig.4 Morphological identification diagram of strain B5

2.3.2 生理生化鑒定結(jié)果與分析 對(duì)菌株B5進(jìn)行酵母菌生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見表1。由表1可知，菌株B5能利用葡萄糖發(fā)酵，而不能利用麥芽糖、蔗糖等其他糖源；菌株B5能同化的碳源有丙三醇，不能同化纖維二糖、菊糖等其他碳源；菌株B5能同化的氮源有硫酸銨，不能同化的氮源有硝酸鹽。

表1 生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical tests

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.3.1 菌株B5 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 對(duì)純化后的酵母菌株B5的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析（圖5），在紫外燈照射下的結(jié)果可知菌株B5的電泳條帶為592 bp。

圖5 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoresis of PCR products

2.3.3.2 菌株B5系統(tǒng)進(jìn)化樹的建立 將測(cè)序結(jié)果輸入Genebank中，利用BLAST功能組件將測(cè)得的基因序列與Genebank數(shù)據(jù)庫中26S rDNA 序列進(jìn)行同源性比較。選取BLAST結(jié)果中得分較高的菌的26S rDNA序列，使用MEGA5.2.1軟件根據(jù)Neighbor-Joining進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建分析，結(jié)果如圖6。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出菌株B5與接合酵母屬（Zygosaccharomyces）遺傳距離最近，同源性最好，結(jié)合菌株B5的形態(tài)學(xué)特征及生理生化試驗(yàn)可以判斷出菌株B5為二孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）。

圖6 菌株B5系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain B5

2.4 優(yōu)勢(shì)降酸菌株耐受性測(cè)定

2.4.1 葡萄糖耐受性的測(cè)定 菌株B5的葡萄糖耐受性能結(jié)果如圖7所示。如圖7所示，隨著葡萄糖濃度的增長，菌體OD值呈先下降后穩(wěn)定的趨勢(shì)，菌株在培養(yǎng)基中長勢(shì)越來越弱，但在250 g/L濃度的高糖濃度下依然能夠存活，吸光度值為0.27±0.04，菌落數(shù)為5.10×104CFU/mL。

圖7 菌株B5葡萄糖耐受性能Fig.7 Glucose tolerance of strain B5

2.4.2 SO2耐受性的測(cè)定 菌株B5的SO2耐受性能結(jié)果如圖8所示。如圖8所示，隨著SO2濃度的增加，OD值呈逐漸下降趨勢(shì)，菌株在培養(yǎng)基中長勢(shì)越來越弱，菌株B5在400 mg/L二氧化硫濃度下的吸光度值為0.14±0.06，雖然長勢(shì)微弱但依然能夠存活，菌落數(shù)為3.30×104CFU/mL；但在500 mg/L SO2濃度下的吸光度值為0.01±0.05，降酸酵母菌株幾乎不能存活。

圖8 菌株B5 SO2 耐受性能Fig.8 SO2 tolerance of strain B5

2.4.3 酒精耐受性的測(cè)定 菌株B5的酒精耐受性能結(jié)果如圖9所示。如圖9所示，隨著酒精濃度的增加，OD值呈逐漸下降趨勢(shì)，菌株在培養(yǎng)基中長勢(shì)越來越弱，菌株B5在18%vol酒精度下的吸光度值為1.21±0.03，降酸酵母菌株依然能夠存活，菌落數(shù)為1.53×105CFU/mL。

圖9 菌株B5酒精耐受性能Fig.9 Ethanol tolerance of strain B5

3 討論

從藍(lán)靛果中篩選出的降酸酵母菌株B5在蘋果酸液體培養(yǎng)基中的降酸率為42.60%±0.85%（13.33±0.13 g/L降為7.65±0.09 g/L），由高效液相色譜顯示藍(lán)靛果中蘋果酸含量最高，為藍(lán)靛果中的主要有機(jī)酸，可通過降解蘋果酸進(jìn)而降低藍(lán)靛果產(chǎn)品總酸。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在菌株B5作用下，藍(lán)靛果中蘋果酸降酸率為36.24%，與蘋果酸液體培養(yǎng)基中的降酸效果相比有所降低，檸檬酸和酒石酸也顯示相同趨勢(shì)。陳思睿等[31]從紅樹莓土壤中篩選獲得降酸酵母菌株T2可將檸檬酸含量從20 g/L降為7.25 g/L，降酸率可達(dá)63.75%；將菌株T2作用于總酸含量為25.16 g/L的紅樹莓果汁中可使果汁總酸含量下降到11.24 g/L，脫酸率為55.32%。由此可見，降酸菌株在實(shí)際應(yīng)用中略低于在培養(yǎng)基中的降酸效果，原因可能是降酸酵母菌株應(yīng)用的產(chǎn)品中除了含有有機(jī)酸外，還含有糖類、蛋白質(zhì)、單寧、果膠等其他成分，對(duì)菌株活性產(chǎn)生影響[32]，此外有機(jī)酸的初始含酸量也可能影響菌株的降酸效果。

目前，對(duì)有機(jī)酸具有降解能力的酵母菌株有多個(gè)屬種，常見的有陸生伊薩酵母、畢赤酵母以及釀酒酵母等，其中絕大部分只具有降解單一有機(jī)酸的能力。劉延嶺等[33]從獼猴桃果園的土壤中篩選出具有蘋果酸降解能力的釀酒酵母菌株ZJ22、PJ34，畢赤酵母ZG13，對(duì)蘋果酸的降解比例分別為28.36%、25.92%和25.68%。本試驗(yàn)經(jīng)篩選獲得的酸酵母菌株B5為接合酵母屬中的二孢接合酵母，首次從長白山野生漿果中篩選出對(duì)蘋果酸、檸檬酸、酒石酸均具有一定降解能力的酵母菌株，使得后續(xù)在野生漿果產(chǎn)品降酸領(lǐng)域應(yīng)用范圍更加廣泛。

對(duì)降酸菌株B5進(jìn)行耐受性試驗(yàn)可以看出，降酸菌株對(duì)葡萄糖、SO2和酒精均具有一定的耐受性，但是隨著葡萄糖、SO2和酒精濃度的增加，降酸酵母菌株B5的生長也逐漸受到抑制，這將不利于產(chǎn)品開發(fā)。為了使降酸酵母菌株能夠更廣泛地應(yīng)用到野生漿果產(chǎn)品當(dāng)中，可通過酵母菌工程技術(shù)對(duì)初篩獲得的原始菌株進(jìn)行改良，使其獲得較原始菌株更強(qiáng)的耐受性能。Cecilia等[34]使用耐低溫酵母菌株S.eubayanusNPCC 1292作為親本菌株，與釀酒酵母菌株雜交獲得的雜交種H20的葡萄糖耐受范圍從120~250 g/L提高到240~300 g/L。雖然降酸酵母菌株B5對(duì)藍(lán)靛果展現(xiàn)出優(yōu)良的降酸能力，但這一特性對(duì)其他長白山野生漿果產(chǎn)品是否均具有普遍意義還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

對(duì)長白山野生藍(lán)靛果果實(shí)中的酵母菌進(jìn)行篩選，得到具有良好降解有機(jī)酸效果的酵母菌株B5，經(jīng)形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)，生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定可知菌株B5為二孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus），其對(duì)蘋果酸、檸檬酸、酒石酸的降酸率分別為42.60%±0.85%、18.28%±0.80%、13.09%±0.61%；其在250 g/L葡萄糖質(zhì)量濃度、400 mg/L SO2質(zhì)量濃度和18%vol酒精度下仍能存活，具有在藍(lán)靛果果汁、果酒等產(chǎn)品開發(fā)中應(yīng)用的潛力。