枇杷炭疽病病原菌鑒定及防治藥劑篩選

王文靜，甘 震，石緒根，宋水林，郭德康，陳麗林，況衛(wèi)剛

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045）

【研究意義】枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）隸屬于薔薇科（Rosaceae）、枇杷屬（Eriobotrya），其栽培歷史已超過2 000年，別名又叫蘆橘、蘆枝、金丸、炎果、焦子。其易于栽培種植，適應(yīng)性較強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)效益高，果實(shí)不僅營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，而且具有潤肺、抗炎、止咳平喘、健胃潤脾等功效，因而深受國內(nèi)外消費(fèi)者喜愛，從而成為了世界性精美果品之一[1]。枇杷在30多個(gè)國家和地區(qū)均有分布和栽培[2-3]，其中我國枇杷的栽培面積和總產(chǎn)量均居于世界首位。枇杷在浙江、福建、江西等地廣泛種植，其中安義枇杷是江西省特產(chǎn)，歷史悠久。由于具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，枇杷逐漸成為栽培區(qū)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)之一。但是，枇杷從種植、采收到果實(shí)的貯存、運(yùn)輸?shù)日麄€(gè)過程中都會(huì)受到各種病害的危害。常見的有灰斑病、輪紋病、炭疽病、葉尖焦枯病、圓斑病等，這些病害會(huì)導(dǎo)致樹勢早衰、果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)下降，成為限制枇杷產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的主要因素[4]。【前人研究進(jìn)展】國內(nèi)外關(guān)于枇杷病害的研究很多，Perell等[5]從培養(yǎng)物及分生孢子形態(tài)特征、致病性測定等方面將阿根廷枇杷灰斑病致病菌鑒定為Pestalotiopsis guepinii。Chen等[6]從中國安徽省涇縣枇杷灰斑病病樣上分離到致病菌，通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)將其鑒定為P. theae。Xiao等[7]研究結(jié)果表明安徽省黃山市枇杷灰斑病的病原為Pestalotiopsis microspora。日本的相關(guān)學(xué)者認(rèn)為P. eriobotryfolia、P. funerea、P. adusta、P. eugeniae、P. longiaristata均可引起枇杷灰斑病[8]。研究學(xué)者對福建[9]、貴州[10]等地枇杷病害研究表明，病原菌Ascochyta eriobotryae可導(dǎo)致枇杷輪紋病。而對于枇杷炭疽病的病原，研究結(jié)果表明Colletotrichum acutatum和C. siamense均可導(dǎo)致枇杷炭疽病的發(fā)生[11]。炭疽菌屬種類多樣，存在多個(gè)復(fù)合種，如C. gloeosporioides復(fù)合種、C. acutatum復(fù)合種和C. magnum復(fù)合種等。這些炭疽菌形態(tài)特征不穩(wěn)定，很難通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定[12]。ITS作為用于真菌鑒定的DNA條形碼，對很多真菌種類鑒定效果較好，但是很難將炭疽菌復(fù)合種區(qū)分開[13]。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，不同的分子標(biāo)記如ACT，TUB2，GPDH和ApMat (APN2/MAT-IGS)等用于炭疽菌的鑒定中，使得鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確[14]。張丹華等[15]研究表明，不同地域枇杷病害的病原菌可能不一致。鑒于炭疽菌種類多樣，寄主范圍廣泛，我國枇杷種植分布又較廣，因而有必要對枇杷上的炭疽病菌種類進(jìn)一步研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，枇杷炭疽病發(fā)生越來越重，但是對于引起江西枇杷炭疽病的病原尚缺乏研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬對對江西省宜春市枇杷炭疽病病原進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步采用菌絲生長速率法分別測定了6種不同藥劑對枇杷炭疽病菌的室內(nèi)毒力，以期為病害的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

枇杷炭疽病病葉采自江西省宜春市上高縣果園。

1.2 供試藥劑

30%苯甲·嘧菌酯懸浮劑（陜西標(biāo)正作物科學(xué)有限公司）；75%戊唑?嘧菌酯水分散性粒劑（上海綠澤生物科技有限責(zé)任公司）；50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑（蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司）；75%肟菌?戊唑醇水分散性粒劑（拜爾股份公司）；400 g/L氟硅唑乳油（江門市大光明農(nóng)化新會(huì)有限公司）；1%申嗦霉素懸浮劑（江蘇好收成韋恩農(nóng)化股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1病原菌分離培養(yǎng)采用組織分離法對病原菌進(jìn)行分離，在超凈工作臺內(nèi)將刀片滅菌后切取病葉病斑交界處組織塊，每片葉片取1～2個(gè)。將病樣組織用體積分?jǐn)?shù)為70%酒精浸泡30 s、0.1%的升汞浸泡2min、無菌水沖洗3次，將消毒后的病樣組織置于滅菌的濾紙上晾干，置于PDA培養(yǎng)基上，在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察，待病樣組織中長出菌絲后及時(shí)純化，保存4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2病原菌鑒定將經(jīng)過純化處理的病原菌進(jìn)一步培養(yǎng)，等菌絲長出后，拍照記錄菌落正反面形態(tài)。同時(shí)制作臨時(shí)玻片，在顯微鏡下察看其分生孢子形態(tài)特征，并測量其大小。

將純化后的真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，采用生工生物真菌DNA提取試劑盒（貨號B518259）提取其基因組。選取炭疽菌ApMat引物CgDL_F6（5'-AGTGGAGGTGCGGGACGTT-3'）和CgMAT1_F2（5'-TGATGTATCCCGACTACCG-3'）[16]對真菌的ApMat區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：基因組DNA 2 μL，CgDL_F6 1 μL，CgMAT1 F2 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物之后，將PCR產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行序列測定。將測序獲得的結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，得到鑒定結(jié)果。

1.3.3室內(nèi)毒力測定本研究選取生產(chǎn)上常用的防治炭疽病菌的藥劑，苯甲·嘧菌酯、戊唑·嘧菌酯、咪鮮胺錳鹽、肟菌·戊唑醇、氟硅唑、申嗦霉素，進(jìn)行各藥劑室內(nèi)毒力測定。用菌絲生長速率法測定不同殺菌劑對枇杷炭疽病病原菌菌絲生長的影響。將藥劑推薦的使用濃度作為初始濃度，用無菌水將各殺菌劑10倍梯度稀釋，配置成6個(gè)不同溶度的母液。用移液器吸取2 mL的不同濃度的供試藥劑母液，分別加入到18 mL滅菌的PDA培養(yǎng)基，充分混勻后倒入培養(yǎng)皿中，配制成不同濃度的含藥培養(yǎng)基。用無菌打孔器在枇杷炭疽病菌菌落邊緣處打孔取5 mm的菌餅，接種在含藥PDA平板的中央，以未加入藥劑的PDA培養(yǎng)基為對照，每個(gè)處理重復(fù)3次。接種后置于24 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，待對照組菌餅長至整個(gè)培養(yǎng)皿的2/3時(shí)，用十字交叉法測量供試菌株在不同濃度藥劑平板上的菌落直徑，按照下列公式計(jì)算供試藥劑在不同藥劑濃度下的菌絲生長抑制率。

利用SPSS軟件求出抑制率機(jī)率值（y）與濃度對數(shù)（x）之間的毒力回歸方程、抑制中濃度EC50值及相關(guān)系數(shù)（r）。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷炭疽病癥狀

炭疽病在枇杷整個(gè)生長期都可以發(fā)生，主要危害葉片和果實(shí)，在果實(shí)儲(chǔ)藏運(yùn)輸期間也可發(fā)生。本研究通過田間對葉片癥狀進(jìn)行了觀察，葉片受害初期病斑呈褐色，圓形或近圓形，后期病斑邊緣呈現(xiàn)暗褐色，中央變?yōu)榛野咨?，田間受害癥狀如圖1。

圖1 枇杷炭疽病葉片發(fā)病癥狀

2.2 病原菌鑒定

對分離到的真菌進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其菌落呈現(xiàn)灰白色，隨后顏色逐漸加深，在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃、黑暗環(huán)境條件下培養(yǎng)7 d后，菌絲長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，后期菌落上出現(xiàn)桔紅色的分生孢子團(tuán)（圖2）。顯微鏡觀察到該菌分生孢子單胞、卵圓形、透明，兩端鈍圓，大小為（13.6～16.5）μm×（5.8～7.1）μm。通過查詢相關(guān)文獻(xiàn)，認(rèn)為該真菌形態(tài)特征與果生炭疽菌一致[17]。

圖2 枇杷炭疽病菌菌落特征和分生孢子形態(tài)

對所獲得的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，所得的電泳條帶明亮且單一，與Marker 2000比較，擴(kuò)增獲得的片段大小約在750～1 000 bp（圖3）。利用CgDL_F6和CgMAT1_F2引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，經(jīng)NCBI比對，結(jié)果顯示其序列與果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）的相似性和一致性均為100%。

圖3 供試菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 幾種殺菌劑對枇杷炭疽病菌的室內(nèi)毒力比較

由表1可見，6種殺菌劑對枇杷炭疽病菌均表現(xiàn)出一定的抑制效果，但對菌絲生長的抑制效果不同，毒力差異較大。從藥劑的EC50來看1%申嗦霉素SC抑菌效果最強(qiáng)，其EC50為0.014 mg/L；其次是30%苯甲·嘧菌酯SC、50%咪鮮胺錳鹽WP和400 g/L氟硅唑EC，也表現(xiàn)出較好的抑制效果，EC50分別為0.020，0.021，0.026 mg/L；而75%戊唑·嘧菌酯WDG和75%肟菌·戊唑醇WDG表現(xiàn)出的抑菌活性一般，其EC50分別為0.560 mg/L和0.405 mg/L。

表1 6種殺菌劑對枇杷炭疽病菌的毒力

3 討論與結(jié)論

炭疽菌屬（Colletotrichum）真菌可以危害200多種植物，是重要的植物病原真菌。該真菌在自然界分布普遍，國內(nèi)外有關(guān)炭疽病菌危害的報(bào)道屢見不鮮。由炭疽菌屬引起的枇杷炭疽病危害嚴(yán)重，制約枇杷產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展。研究表明引起枇杷炭疽病的病原菌種類多樣，Cao等[18]研究表明Colletotrichum acutatum能夠引起枇杷采后果實(shí)炭疽病，李小霞等[19]基于ITS序列分析，認(rèn)為引起貴州枇杷炭疽病的病原為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），Wu等[20]基于多基因序列分析結(jié)果表明，成都枇杷果實(shí)炭疽病病原為C. nymphaeae。本研究通過對江西省宜春市上高縣枇杷炭疽病進(jìn)行調(diào)查取樣，基于ApMat基因序列分析，結(jié)果表明病原菌為果生炭疽菌（C. fructicola）。

為了篩選合適的藥劑用于田間枇杷炭疽病菌的防治，本研究利用生產(chǎn)上常用的6種殺菌劑對分離獲得的枇杷炭疽病菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測定。結(jié)果表明，6種殺菌劑對病原菌的生長均有一定程度的抑制效果。1%申嗦霉素抑菌效果最好，其次為30%苯甲·嘧菌酯、50%咪鮮胺錳鹽、400 g/L氟硅唑。申嗪霉素是由熒光假單胞菌M18分泌的一種抗菌素，同時(shí)具有廣譜抑制植物病原菌并促進(jìn)植物生長作用的雙重功能的殺菌劑，具有廣譜、高效的特點(diǎn)，對多種病原真菌、細(xì)菌具有較好的抑制效果，尤其是在跟其它藥劑配比時(shí)表現(xiàn)出良好的增效作用[21]。苯甲·嘧菌酯、咪鮮胺錳鹽和氟硅唑是生產(chǎn)上用于防治炭疽病較好的藥劑，具有很好的應(yīng)用潛力。后續(xù)需要進(jìn)一步對這幾種藥劑的田間效果進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)在田間生產(chǎn)使用過程中進(jìn)行藥劑輪換使用，以避免產(chǎn)生抗藥性。