高壓液相色譜-熒光檢測法檢測蜂王漿中喹諾酮類藥物殘留的方法

王圣義，胡 娟

（1.武漢市華測檢測技術(shù)有限公司，湖北 武漢 430070；2.湖北省揚(yáng)子江蜂業(yè)有限公司，湖北 武漢 430070）

諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星均屬氟喹諾酮類，為喹諾酮類第三代藥物，屬于廣譜抗菌藥[1-3]。在養(yǎng)蜂生產(chǎn)過程中，蜂農(nóng)為了預(yù)防和治療蜂病，有時(shí)要用到藥物，而藥物的來源很混雜，有人用藥和獸用藥，還有的蜂農(nóng)使用了一種含有喹諾酮類藥物成分卻沒有進(jìn)行標(biāo)簽標(biāo)識的藥物，這樣就可能導(dǎo)致生產(chǎn)的蜂王漿中有喹諾酮類藥物殘留。

國內(nèi)外檢測喹諾酮藥物殘留的方法有很多，主要有微生物法[4-6]、酶聯(lián)免疫法[7-9]、高壓液相色譜法[10-13]、液相串聯(lián)質(zhì)譜法[14-16]、毛細(xì)管電泳法[17-18]等。目前在蜂產(chǎn)品行業(yè)，特別是蜂王漿生產(chǎn)企業(yè)，大多以酶聯(lián)免疫方法作為蜂王漿獸藥殘留監(jiān)控的主要手段。酶聯(lián)免疫方法具備快速簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、對設(shè)備要求不高以及檢測成本低等特點(diǎn)，但酶聯(lián)免疫法不能將每種喹諾酮類藥物單獨(dú)檢驗(yàn)而準(zhǔn)確定量。高壓液相色譜儀在一定程度上可以實(shí)現(xiàn)對不同喹諾酮藥物的分離而進(jìn)行單個(gè)定量，這對于蜂王漿生產(chǎn)企業(yè)而言有重要的意義。因此，對蜂王漿中喹諾酮類藥物殘留量的檢測方法進(jìn)行研究，對于豐富獸藥殘留的檢測方法以及增強(qiáng)企業(yè)自檢自控能力非常有意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

DIONEX U3000 高壓液相色譜儀配RF2000 熒光檢測器（美國戴安公司），SHZ-82A 水浴恒溫振蕩器(金壇區(qū)金南儀器廠)，PHS-3G 高精度pH 計(jì)(上海利達(dá)儀器廠)，TGL-16C 臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），固相萃取裝置（安捷倫科技有限公司）。

乙腈（ACN）、甲醇、甲酸均為色譜純，檸檬酸、乙酸銨、乙酸乙酯、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鉀、三乙胺均為分析純，三氟乙酸（TFA） 為化學(xué)純；檸檬酸-乙酸銨混合鹽溶液：分別精確稱取10.507 0 g 檸檬酸、0.770 8 g 乙酸銨，用重蒸餾水溶解并稀釋定容至1 000 mL，用三乙胺調(diào)節(jié)pH 為3.0；諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrensorfer 公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取試樣2 g，精確至0.01 g，置于100 mL塑料瓶中，加入0.2 mol/L 的三氟乙酸溶液10 mL，于漩渦混合器上將樣品分散，然后加入10 mL 乙腈，于康氏振蕩器上振蕩20 min，然后轉(zhuǎn)移至50 mL 的塑料離心管中，以4 000 rpm 離心8 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL 的茄型瓶中，再向沉淀中加入10 mL的0.2 mol/L 的三氟乙酸溶液，于漩渦混合器上將沉淀分散，然后轉(zhuǎn)移至100 mL塑料瓶中，再加入10 mL 乙腈，于康氏振蕩器上振蕩10 min，再以4 000 rpm /min離心8 min，合并兩次的上清液，將上清液于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈，然后將經(jīng)過濃縮的樣液于15 000 rpm/min 離心5 min。上清液備用。

將SCX 固相萃取小柱安裝在固相萃取裝置上，分別先后用1 柱管甲醇和1 柱管水活化柱子。然后將樣品處理得到的上清液轉(zhuǎn)移至SCX 柱上，通過調(diào)節(jié)真空度讓樣液以4 秒1 滴的速度通過柱子。待樣液全部通過柱子后（注意保持柱體濕潤），先用2 柱管水以2～3 秒1滴的速度淋洗柱子，再用1 柱管甲醇和1 柱管水以同樣速度淋洗柱子。最后用4 mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液洗脫柱子，收集洗脫液。向洗脫液中添加200 μL 15%的 檸檬酸，混勻，用0.45 μm 的濾膜過濾，待測。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用十萬分之一電子天平稱取諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品約0.003 00～0.005 00 g 到10 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液2 mL和甲醇5 mL，超聲使之溶解，靜置，用甲醇定容。然后各移取適量溶液至另一容量瓶中，制成濃度為100 μg/mL 貯備液，存放于4℃冰箱中。

移取標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.5 mL，用甲醇稀釋并定容于50 mL容量瓶中，制成濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。使用時(shí)用流動(dòng)相稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作液至所需濃度。

(3)規(guī)劃水平年(2020年、2030年)灌溉保證率50%相比75%，水資源承載能力評分較高，說明可以采用降低保證率灌溉更多耕地的方法以達(dá)到總產(chǎn)值的增加，提高山塘水資源的承載能力。

1.2.3 儀器條件

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱及檢測器、檢測波長的選擇

喹諾酮類物質(zhì)屬于酸堿兩性物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)中的叔胺基和羥基官能團(tuán)能在水中發(fā)生解離，色譜柱固定相表面殘存的硅醇基和金屬離子可以通過氫鍵或離子交換作用強(qiáng)烈吸附喹諾酮類化合物而出現(xiàn)峰形變寬、拖尾以及保留時(shí)間不穩(wěn)定或過長，甚至被保留在色譜柱上，導(dǎo)致峰形異常和分離度下降[19]。因此需選用高純硅膠為基質(zhì)并經(jīng)過封端處理的C18 等反相色譜柱作為分離柱。實(shí)驗(yàn)在所使用的幾款色譜中，發(fā)現(xiàn)美國戴安公司生產(chǎn)的ACCLAIMTM120 C18 柱（5 μm，120 ，4.6 mm（id） ×250 mm） 能將3 種氟喹諾酮類藥物很好分離，并且峰形對稱而且尖銳，該色譜柱耐高壓且能長期使用，完全符合試驗(yàn)要求。

喹諾酮類藥物本身具有較強(qiáng)的熒光吸收，無需進(jìn)行衍生化就能直接進(jìn)行分析，而且檢測靈敏度高，因此實(shí)驗(yàn)選用熒光檢測器。通過熒光波長掃描，以及參考他人研究方法[20]，選擇RF2000 型熒光檢測器，激發(fā)波長280 nm，發(fā)生波長450 nm，可調(diào)節(jié)靈敏度和電信號增益，本次實(shí)驗(yàn)采用的模式為“gain：4，sensitivity：high”。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

喹諾酮類藥物具有可質(zhì)子化的氮原子和離解的羥基，采用反相色譜柱測定此類藥物時(shí)，會(huì)出現(xiàn)峰的拖尾現(xiàn)象，必須在流動(dòng)相中加入離子對試劑。離子對試劑包括磷酸鹽緩沖鹽溶液（三乙胺調(diào)節(jié)pH 值） -乙腈、四丁基溴化銨溶液- 乙腈、乙腈-（檸檬酸、醋酸銨混合溶液） 等。

比較了乙腈-（檸檬酸、醋酸銨混合溶液） 以及0.01 mol/L 四丁基溴化銨溶液（75%磷酸調(diào)節(jié)pH 為3） - 乙腈。發(fā)現(xiàn)采用乙腈-（檸檬酸、醋酸銨混合溶液） 作為流動(dòng)相時(shí)，不能將諾氟沙星和氧氟沙星分開，而采用0.01 mol/L 四丁基溴化銨溶液（75%磷酸調(diào)節(jié)pH 為3） - 乙腈可以將諾氟沙星和氧氟沙星分開，但是氧氟沙星的檢出限偏低，考慮到研究的目的，最終選擇了乙腈-（檸檬酸、醋酸銨混合溶液） 作為流動(dòng)相。結(jié)合使用戴安 公 司 的ACCLAIMTM120 C18 柱（5 μm，120 ，4.6 mm（id） ×250 mm），得到了較好的分離效果以及峰形，見圖4。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4 HPLC Chromat ogram of Mixed St andard QNs

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

由于蜂王漿中成分復(fù)雜，含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等物質(zhì)，而不能通過采用簡單的稀釋處理而直接進(jìn)樣分析。周萍等[21]研究了通過液液提取凈化的方法，由于受凈化方法的影響，通過凈化后的試樣氟喹諾酮類藥物殘留有一定的損失，樣品回收率范圍在46.5%～55.9%，通過采用基質(zhì)標(biāo)樣以及添加內(nèi)標(biāo)的方法對結(jié)果進(jìn)行了校正。Lambardo-Aguei M 等[22]在采用液相串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蜂王漿的QNs 時(shí)為降低基質(zhì)的干擾，通過減少稱樣量的辦法以及應(yīng)用到了固相萃取凈化方法。本研究沒有采用基質(zhì)標(biāo)樣，而是直接采用標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析。在樣品前處理方面，通過采用合適的提取試劑以及利用固相萃取技術(shù)和合適的洗脫方式對樣品進(jìn)行了凈化。

實(shí)驗(yàn)比較了乙酸-乙腈體系、三氟乙酸-乙腈體系、偏磷酸-乙腈體系分別作為提取劑的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用三個(gè)體系都可以將三種氟喹諾酮類藥物從蜂王漿中提取出來。而三氟乙酸-乙腈體系優(yōu)于另外兩種提取體系。

在對三氟乙酸-乙腈體系進(jìn)行研究時(shí)，比較了不同pH 值分別為1.07、3、4.2 的三氟乙酸水溶液與乙腈組成的提取效果與基質(zhì)干擾物的去除效果，結(jié)果表明pH 為3 的提取液基質(zhì)干擾物含量少，最終選擇pH 3.0、0.2 mol/L三氟乙酸和乙腈組成的提取液體系。三者的提取效果（5%氨水甲醇洗脫物） 見圖1。圖中顯示在RT 為8.5 、 9.5、13.0 min 時(shí)，均不同程度存在干擾。在RT=9.5 時(shí)，1#有強(qiáng)干擾物存在。

圖1 不同pH值三氟乙酸- 乙腈對空白樣品基質(zhì)的提取效果比較Fig.1The comparison of ext ract ing effect s on t he mat rix of blank samples by TFA- ACN at different pH value

2.2.2 提取液凈化方法的選擇

通過比較C18 固相萃取小柱、AX 固相萃取小柱以及SCX 小柱對樣品的凈化效果發(fā)現(xiàn)：如果按小柱所提供的說明書操作，一般得到的色譜圖中含有大量的基質(zhì)干擾，見圖2。后來通過對SCX 柱的凈化方法進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)采用5%的氨水甲醇對SCX 小柱進(jìn)行洗脫，只能洗脫目標(biāo)物的30%～50%，而且洗脫液在經(jīng)氮?dú)獯蹈珊蟮膹?fù)溶液經(jīng)過儀器檢測發(fā)現(xiàn)含有大量干擾物質(zhì)，見圖2。為了能將目標(biāo)物從SCX 小柱上完全洗脫下來，實(shí)驗(yàn)研究了不同洗脫液的洗脫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用4mL 0.1mol/L 的氫氧化鈉溶液可以洗脫90%的被吸附的氟喹諾酮類藥物。而采用200 μL 15%的檸檬酸調(diào)節(jié)洗脫液pH 值后，經(jīng)過儀器進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)在藥物色譜保留時(shí)間，空白樣品幾乎沒有基質(zhì)干擾，見圖3。

圖2 三種固相萃取小柱對空白蜂王漿的凈化效果比較Fig.2 Comparison of clean- up effect s on blank royal j elly of t hree kinds of SPE columns

圖3 兩種針對SCX吸附空白蜂王漿基質(zhì)洗脫效果的比較Fig.3 comparison of t wo elut ingeffect s on mat rix of blank royal j ellyabsorbed by SCX SPE column

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法進(jìn)行對標(biāo)準(zhǔn)樣品的測試，記錄色譜峰高。諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星在2～50 μg/kg 范圍內(nèi)線性良好,當(dāng)濃度達(dá)到100 μg/kg 時(shí)，在選定色譜條件下濃度信號值超出了儀器的測定范圍。以諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的峰高對諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星濃度作回歸分析，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1?？瞻追渫鯘{樣品以及空白添加回收色譜見圖5、圖6。

圖6 空白蜂王漿色譜圖Fig.6 HPLC Chromat ogram of blank royal j elly

表1 3 種氟喹諾酮類藥物的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear regressive equat ions and correlat ion coefficient s for t hree FQNs

2.4 方法的回收率和精密度測試

檢出限是指能夠被檢測到的分析物的最小含量，它與所使用的方法和設(shè)備有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究所使用的RF2 000 型熒光檢測器可調(diào)節(jié)靈敏度和電信號增益。本次研究采用的模式為“gain：4，sensitivity：high”，在這種模式下，樣品基質(zhì)的噪音也會(huì)被相應(yīng)放大，但是卻得到了比較好的目標(biāo)分析物信號?；厥章蕦?shí)驗(yàn)按照1 倍、2 倍和10 倍定量限三個(gè)濃度水平進(jìn)行添加標(biāo)準(zhǔn)工作液。測得本實(shí)驗(yàn)方法的檢測限為1μg/kg（S/N=3），定量限為3μg/kg（S/N≈10）。實(shí)驗(yàn)過程中稱取空白蜂王漿2.0 g，分別添加3 種氟喹諾酮類藥物含量為6.0 ng、12.0 ng、60 ng 標(biāo)準(zhǔn)到蜂王漿中，漩渦混合1min，置于暗處放置30 min，然后按本方法進(jìn)行樣品處理和檢測，精密度測試結(jié)果為三種氟喹諾酮藥物殘留含量在各個(gè)水平的RSD 值均低于20%。結(jié)果見表2，回收率和精密度均符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》標(biāo)準(zhǔn)對檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求的規(guī)定。

表2 3 種氟喹諾酮類藥物殘留的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 2 Spiked recoveries and relat ive st andard deviat ions of 3 QNs residues(n=5)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了不同提取液、不同SPE 柱、不同洗脫液對測試結(jié)果的影響，最終建立了以三氟乙酸- 乙腈提取蜂王漿中的3 種氟喹諾酮藥物殘留，提取液經(jīng)過濃縮后，經(jīng)過SCX 固相萃取小柱進(jìn)行樣品凈化，最后用4mL 0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液洗脫，再用15%檸檬酸調(diào)節(jié)pH 值，然后經(jīng)過高壓液相色譜- 熒光檢測器檢測的方法。在該方法中，采用氫氧化鈉洗脫和用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 值的試樣液可以最大限度地降低蜂王漿基質(zhì)的影響。方法具有檢測限低、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，可以作為蜂王漿生產(chǎn)企業(yè)和檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行蜂王漿3 種氟喹諾酮的殘留檢測方法。