中華蜜蜂DnaJB6 的生物信息學分析與功能預測

趙 航，張文豹，張淑欣，何學梅，梁 麗

（曲阜師范大學生命科學學院，山東 曲阜 273165）

昆蟲授粉是一項重要的生態(tài)系統(tǒng)服務，不僅在野生植物的發(fā)育與繁衍中發(fā)揮重要作用，而且保證了農作物的產量和品質[1]。據(jù)統(tǒng)計，大約有65%的被子植物和86%的農作物需要昆蟲授粉[2]。蜜蜂是最主要的授粉昆蟲，大約有40%的昆蟲授粉由蜜蜂完成。蜜蜂授粉可以大幅提升農作物收益，我國每年由蜜蜂授粉促進的農作物增產產值超過500 億[3,4]。蜜蜂種類繁多，其中意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica） 和中華蜜蜂（Apis cerana cerana） 是我國2 個主要養(yǎng)殖品種[5]。中華蜜蜂具有多種優(yōu)良特性，如相較于意大利蜜蜂，中華蜜蜂具有更好的抗螨能力[6]。然而，從1896 年至今，中華蜜蜂種群數(shù)量至少下降了40%[7,8]。近年氣候變化、農藥濫用、病蟲害頻發(fā)是中華蜜蜂種群數(shù)量快速下降的主要驅動力[7,9,10]。

熱激脅迫是環(huán)境脅迫的一種，它不僅擾亂線粒體穩(wěn)態(tài)、破壞細胞功能，導致細胞的氧化損傷[11]。對蜜蜂而言，熱激脅迫雖然很少直接殺死蜜蜂，但是會影響蜜蜂的分布、行為和生理狀態(tài)[12-14]。研究表明，熱激脅迫對蜜蜂的身體形態(tài)、生長發(fā)育和生殖功能產生不利影響[15-18]。同時，熱激脅迫還可以與其它脅迫協(xié)同作用，降低蜜蜂對其它脅迫的耐受能力[12,19]。綜上所述，熱激脅迫對蜜蜂的生命活動產生不可忽視的影響。

在進化過程中，蜜蜂獲得了許多熱激脅迫防御機制，以減輕熱激脅迫對自身的傷害[20]。在行為水平上，當蜂巢溫度過高時，工蜂會煽動翅膀增加散熱。同時，增加負責采水蜜蜂的數(shù)量，并將采集到的水灑在蜂巢上，以降低蜂巢溫度[21-23]。在分子水平上，蜜蜂通過上調多種基因和蛋白的表達來抵御熱激脅迫，如熱激蛋白家族（Heat shock protein，Hsp）、核因子Y（Nuclear factor Y, NF-Y）、乙酰膽堿酯酶1（Acetylcholinesterase 1, AchE1）[24-26]。其 中，Hsp 家族是熱激脅迫誘導表達的一類保守蛋白質，能幫助蛋白質保持正確的構象，防止蛋白質錯誤折疊和聚集[27]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)揮分子伴侶功能的Hsp 家族是蜜蜂抵御熱激脅迫的關鍵蛋白。在熱激脅迫條件下，蜜蜂的sHsp22.6、Hsp60、Hsp70ab、Hsp90 均誘導表達，幫助蜜蜂抵御熱激脅迫[28-30]。這些結果表明Hsp 家族在抵御熱激脅迫中發(fā)揮重要作用。

DnaJ 家族也稱Hsp40 家族，因具有高度保守的J 結構域而得名。蜜蜂DnaJ 家族有二十多個成員，依據(jù)結構特點分為DnaJA、Dna-JB、DnaJC 3 個亞家族[31]。DnaJ 作為輔助伴侶蛋白，激活分子伴侶蛋白Hsp70 的ATP 酶活性，參與蛋白質的翻譯、折疊、去折疊、轉位和降解過程[32]。DnaJB6 是廣泛表達、功能多樣的1 個J 結構域蛋白[34]。它具有3 個保守結構域，分別為N 端的J 結構域、G/F 富集區(qū)和C 端的絲氨酸富集區(qū)域[35,36,37]。由于選擇性剪接，人的DnaJB6 具有2 個不同長度的cDNA，它們編碼2 種不同的蛋白質，分別稱為Dna-JB6a 和DnaJB6b[38]。它們的N 端氨基酸殘基相同，但是DnaJB6a 的C 端有105 個氨基酸殘基而DnaJB6b 的C 端僅有10 個氨基酸殘基[39]。C 端氨基酸的差異使二者具有不同的亞細胞定位。DnaJB6a 具有核定位信號序列，定位于細胞核；DnaJB6b 則缺少核定位信號序列，主要定位于細胞質[40]。在哺乳動物中，DnaJB6 參與多種生命活動，如小鼠胎盤發(fā)育、疾病、神經干細胞的自我更新等[41-45]。但是，作為熱激蛋白家族的成員之一，DnaJB6在中華蜜蜂中的結構以及在熱激脅迫中的作用卻少有報道。

本研究主要對中華蜜蜂DnaJB6 進行生物信息學分析，并檢測其在熱激脅迫下的表達模式，從而闡明DnaJB6 在中華蜜蜂抵御熱激脅迫中的可能作用。本研究可為進一步研究中華蜜蜂DnaJB6 的結構與功能提供理論依據(jù)。同時，還豐富了蜜蜂熱激脅迫響應機制的理論知識，對蜜蜂的育種工作有一定的指導作用。

1 材料與方法

1.1 核酸和氨基酸序列

先前實驗室同學克隆得到的中華蜜蜂DNAJB6 的編碼區(qū)（Coding sequence，CDS）。其他10 種昆蟲的DnaJB6 氨基酸序列是從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載的，它們的登錄號及物種名分 別 為 XP_006564598（Apis mellifera） 、XP_006619442（Apis dorsata）、XP_012342620（Apis florea）、XP_016919326（Apis cerana）、XP_033185595（Bombusvancouverensis nearcticus） 、 XP_012135622（Megachile rotundata） 、 XP_011138491（Harpegnathos saltator）、XP_029665386（Formica exsecta）、XP_035726509（Vespamandarinia） 、XP_015182179（Polistes dominula）。

1.2 生物信息學分析

首先依據(jù)標準密碼子表，計算DnaJB6 的CDS 編碼的氨基酸序列。然后，進入Blastx 分析界面，選擇默認數(shù)據(jù)庫、物種insects(taxid:6960)，對DNAJB6 的CDS 進行比對，尋找與其編碼相似蛋白質的基因，初步預測DnaJB6的功能。再利用多種生物信息學軟件分析DnaJB6 的理化性質、保守結構域、跨膜結構、亞細胞定位、信號序列、蛋白質修飾位點、蛋白質同源性、二級結構、三級結構、相互作用的蛋白。本文使用的各種生物信息學分析軟件詳見表1，未特殊說明的生物信息學軟件，均使用默認參數(shù)進行分析預測。

表1 本文使用的多個生物信息學分析軟件

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析結果

2.1.1 理化性質分析結果

為了確定中華蜜蜂DnaJB6 的各種理化性質，我們利用ProtParam 計算了它的多個參數(shù)，結果如表2 所示。表2 顯示，DnaJB6 相對分子質量為 37.21 kD， 分子式為C1647H2527N479O501S5。在所有氨基酸殘基中，帶負電荷的氨基酸殘基有39 個，帶正電荷的氨基酸殘基54 個，理論等電點為9.71。DnaJB6的不穩(wěn)定系數(shù)為45.83，大于40 表示蛋白質不穩(wěn)定。同時，該蛋白質的脂溶系數(shù)為47.09，總的親水性平均系數(shù)為-0.913。上述結果表明，DnaJB6 是一個帶正電的不穩(wěn)定的親水性蛋白。

表2 中華蜜蜂DnaJB6 的多種理化性質

為了進一步掌握中華蜜蜂DnaJB6 的親水性，我們使用Protscale 進行更加準確的親疏水性分析，結果如圖1 和表3 所示。圖1 和表3 顯示，在所有氨基酸中，疏水性最強的是第160 位的甘氨酸殘基，其得分為1.344；親水性最強的是323 位的賴氨酸殘基，其得分為-3.500。并且該蛋白質83%的氨基酸殘基得分為負數(shù)，負數(shù)表示親水性。該結果進一步驗證了中華蜜蜂DnaJB6 的親水性。

圖1 中華蜜蜂DnaJB6 親疏水性分析結果

表3 中華蜜蜂DnaJB6 的親疏水分析結果

2.1.3 保守結構域分析結果

為了確定中華蜜蜂DnaJB6 的保守結構域，我們利用CD-Search 分析它的氨基酸系列，從而找到保守結構域，結果如圖2 所示。圖2 顯示，DnaJB6 的3-66 位氨基酸構成Pfam 序號為PF00226 的J 結構域。并且HPD基序與其它的5 個氨基酸殘基構成保守的Hsp70 相互作用位點，介導DnaJB6 與Hsp70的相互作用。這結果表明，中華蜜蜂DnaJB6具有保守的J 結構域，屬于DnaJ 超家族。

圖2 中華蜜蜂DnaJB6 保守結構域分析結果

2.1.4 跨膜結構分析結果

為了獲知中華蜜蜂DnaJB6 是否具有跨膜結構，我們使用TMHMMServer v.2.0 分析其氨基酸序列，確定其是否具有可形成跨膜結構的α-螺旋，結果如圖3 所示，DnaJB6 蛋白不僅跨膜螺旋數(shù)為零，而且沒有跨膜信號。由此可推測中華蜜蜂DnaJB6 不具有跨膜結構，不屬于膜蛋白。

圖3 中華蜜蜂DnaJB6 跨膜結構分析結果

2.1.5 亞細胞定位分析結果

為了確定中華蜜蜂DnaJB6 的亞細胞定位，我們采用PSORT II Prediction 預測其亞細胞定位，結果如表4 所示。從表4 可以看出，DnaJB6 有73.9%的可能定位于細胞核，14.4%的可能定位在細胞質，定位線粒體和細胞骨架的概率均為4.3%。通過上述結果可知中華蜜蜂DnaJB6 很可能是定位于細胞核的核蛋白。

表4 中華蜜蜂DnaJB6 亞細胞定位預測結果

2.1.6 信號序列分析結果

為了確定中華蜜蜂DnaJB6 是否具有信號序列。如果有，有的又是哪類信號序列。我們使用SignalP-5.0 Server 分析其是否具有信號肽，結果如表5 所示，DnaJB6 具有信號肽的可能性僅為0.06%，無信號肽的概率為99.94%。由此可斷定,中華蜜蜂DnaJB6 無信號肽。

表5 中華蜜蜂DnaJB6 信號肽分析結果

為了確定中華蜜蜂是否具有核定位信號，我們使用NLStradamus 1.8 分析其可能具有的核定位信號，結果如圖4 所示。圖4 顯示，DnaJB6 有86.7%的可能性具有核定位信號，核定位序列為318-327 位的TKKHDKSKRK。該結果表明，中華蜜蜂DnaJB6 很可能具有核定位信號序列。

圖4 中華蜜蜂DnaJB6 核定位信號序列分析結果

2.1.7 蛋白質修飾位點分析結果

為了解中華蜜蜂DnaJB 的肽鏈合成后加工情況，我們使用NetPhos 3.1 Server 分析磷酸化修飾位點，結果如圖5。圖5 顯示，DnaJB6具有49 個可能的磷酸化修飾位點。在這些磷酸化位點中，絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸位點分別為30、15、4 個。并且，不同位點的氨基酸殘基由不同的蛋白質激酶磷酸化。

圖5 中華蜜蜂DnaJB6 磷酸化修飾位點分析結果

為了解中華蜜蜂DnaJB 的糖基化修飾情況，我們使用NetOGlyc 4.0 Server 分析DnaJB6的糖基化修飾位點，結果如圖6 所示。圖6 顯示，DnaJB6 具有15 個潛在的糖基化修飾位點，分 別 是15、16、74、165、169、172、173、175、177、227、229、240、307、311、318 位氨基酸。在這些糖基化修飾位點中，絲氨酸有11 個、蘇氨酸為4 個。綜合磷酸化修飾位點結果可知，中華蜜蜂DnaJB6 肽鏈合成后，需要進行糖基化和磷酸化修飾才能形成成熟的蛋白質。

圖6 中華蜜蜂DnaJB6 糖基化修飾位點分析結果

2.1.8 蛋白質同源性分析結果

為了研究中華蜜蜂DnaJB6 在進化過程中的保守性，我們下載了中華蜜蜂DnaJB6 的Blastp 序列比對結果中的蜜蜂科6 個物種、蟻科2 個物種和胡蜂科2 個物種的氨基酸序列。在DNAMAN 軟件中，利用全局比對算法進行多序列比對，計算這11 條序列的總體相似度，結果如圖7 所示，黑色標記的是相同的氨基酸位點，粉色標記的是75%相似度以上的氨基酸位點，藍色標記的是50%相似度以上的氨基酸位點，未標記的為50%以下的氨基酸位點，短橫線為插入的空位。這11 條氨基酸的總相似度達到86.73%。由此可知，DnaJB6 在進化過程中較為保守。

圖7 11 種膜翅目昆蟲DnaJB6 的多序列比對結果

為了探究膜翅目DnaJB6 之間的親緣關系，我們使用Mega7 軟件中的最大簡約法構建蜜蜂科中蜜蜂屬的Apis mellifera、Apis dorsata、Apis florea、Apis cerana、Apis cerana cerana、熊蜂屬的Bombus nearcticus、切葉蜂屬的Megachile rotundata； 蟻 科 的Harpegnathos saltator、Formica exsecta和胡蜂科Vespa mandarinia、Polistes dominula的系統(tǒng)進化樹，結果如圖8 所示。從圖8 可以看出，蟻科和胡蜂科聚為一類，再與Megachile rotundata 和Bombus nearcticus聚成大類。在自展檢驗值高于70的分支中，蟻科的兩個物種離中華蜜蜂的遺傳距離最遠，熊蜂屬的Bombus nearcticus遺傳距離最近。由此推測，在膜翅目Dna-JB6 的遺傳進化上，相較于蟻科，中華蜜蜂與胡蜂科親緣關系更近；在蜜蜂科中，熊蜂屬與中華蜜蜂的親緣關系更近，切葉蜂屬較遠。

圖8 最大簡約法構建的DnaJB6 系統(tǒng)進化樹

2.1.9 蛋白質結構預測結果

為了解中華蜜蜂DnaJB6 的二級結構，我們利用Psipred 4.0 預測它的二級結構，結果如圖9 所示。圖9 顯示，DnaJB 的二級結構主要包括7 個α 螺旋（粉紅色）、6 個β 疊片（黃色） 和多個無規(guī)卷曲（灰色）。其中，DnaJB6的4-7、16-30、39-55、59-73 位的4 個α螺旋構成保守J 結構域。并且，第二個和第三個螺旋之間包含一個保守的HPD 基序。由此可知，中華蜜蜂DnaJB6 的二級結構主要為α螺旋、β 折疊和無規(guī)卷曲。

圖9 中華蜜蜂DnaJB6 二級結構預測結果

為了探究中華蜜蜂DnaJB6 的三維結構，我們采用同源建模的方法，對中華蜜蜂Dna-JB6 的三維結構進行預測，結果如表6 和圖10A 所示。表6 和圖10A 顯示，Swiss-model軟件以PDB 數(shù)據(jù)庫中序號為6u3r.1 的蛋白為模板。它與中華蜜蜂DnaJB6 的序列相似度為52.69%。該三維結構預測的GMQE 值為0.4，QMEAN 為-4.13，存在形式為單體。并且，為了更好的展示中華蜜蜂DnaJB6 的三維結構，我們利用Pymol 2.4.1 軟件對其三維結構進行可視化。同時，計算DnaJB6 三維結構的表面靜電勢分布，顯示最保守的HPD 基序的棒狀結構，可視化結果如圖10B 所示。

表6 同源建模結果的參數(shù)

圖10 中華蜜蜂DnaJB6 的三維結構預測及其可視化結果

在A 和B 圖卡通模式的三維結構中，不同顏色代表不同的二級結構。B 圖的表面靜電勢分布圖中的紅色代表負的靜電勢，藍色代表正的靜電勢。

2.1.10 蛋白質互作分析結果

為了研究與中華蜜蜂DnaJB6 相互作用的蛋白質，我們使用String11.0 軟件分析與其相互作用的蛋白質。 String11.0 自動匹配LOC408966 蛋白質作為相似蛋白質，并依此進行蛋白質互作分析，得到的結果如圖11 所示。圖11 顯示，高度可信（得分高于0.7） 的相互作用蛋白質有7 個，其中有4 個Hsc70 蛋白質家 族 蛋 白， 分 別 為 Hsc70-3、 Hsp70cb、Hsc70-4 和Hsc70-5。Hsc70 是Hsp70 家族的成員。這些結果表明，中華蜜蜂DnaJB6 與多種熱激蛋白家族蛋白質相互作用，特別是Hsc70 蛋白家族。并且，很可能作為輔助伴侶分子，與Hsp70 相互作用，從而發(fā)揮生物功能。

圖11 中華蜜蜂DnaJB6 相互作用蛋白質的預測結果

2.2 討論

由于選擇性剪接，DnaJB6 具有多個亞型。在東方蜜蜂中，DnaJB6 具有2 個亞型，分別為長327 bp 的亞型1（XP_016919326） 和290 bp 的亞型2（XP_016919327）[46]。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，克隆得到中華蜜蜂DnaJB6 與東方蜜蜂的DnaJB6 亞型1 完全相同，亞型2 缺少的59-95 位氨基酸殘基。中華蜜蜂DnaJB6 的59-73 位氨基酸構成J 結構域的第四個α-螺旋（圖9）。但是，利用Psipred 4.0 對東方蜜蜂DnaJB6 亞型2 進行二級結構預測卻發(fā)現(xiàn)其59-69 位仍可以形成α- 螺旋，即其仍具有4個α-螺旋組成的J 結構域。盡管在哺乳動物中，DnaJB6 的部分亞型可能會因為缺少C 端的核定位信號序列而分布于細胞質，這可能會造成二者功能上的差異[40]。但同時，也有研究報道，在熱激脅迫條件下，定位于細胞質的亞型可以轉移至細胞核[47]。這些結果表明，由于選擇性剪接形成的中華蜜蜂DnaJB6 的兩個亞型在功能上很可能相同。

蛋白質由20 種常見氨基酸連接而成。由于不同氨基酸側鏈殘基的性質差異，氨基酸的組成、排列賦予了蛋白質特性，如等電點、半衰期、親/疏水性、穩(wěn)定性等。預先掌握蛋白質這些特征參數(shù)，有利于開展后續(xù)的生化實驗。中華蜜蜂DnaJB6 總的親水性平均系數(shù)為-0.913，并且83%的氨基酸表現(xiàn)為親水性（表3 和圖1）。這些結果表明，該蛋白質很可能易溶于水。同時，DnaJB6 含有的帶正電的殘基明顯多于帶負電的殘基，說明中華蜜蜂Dna-JB6 帶正電。

結構域是在二級結構基礎上形成的三級結構局部折疊區(qū)，是相對獨立的穩(wěn)定的緊密球狀實體。在進化過程中，相對保守的結構域稱為保守結構域。并且保守結構域多為蛋白質的功能結構域。DnaJ 蛋白家族的保守結構域為J結構域。并且，J 結構域包含4 個α- 螺旋，其中螺旋Ⅱ和螺旋Ⅲ反向平行，通過含HPD基序的柔性環(huán)相連，兩端的短螺旋Ⅰ、Ⅳ則穩(wěn)定反向平行螺旋間的相互作用[48]。其中的HPD 是DnaJ 蛋白最保守的基序，同時也是激活Hsp70 的ATP 酶活性所必須的[49]。中華蜜蜂DnaJB6 具有較為保守的由4 個α- 螺旋構成的J 結構域（圖9）。并且，具有保守的HPD 基序。DnaJB6 作為DnaJ 蛋白質家族的一員，可能參與蛋白質的翻譯、折疊、去折疊、轉位和降解過程[32]。

蛋白質磷酸化修飾是指肽鏈合成后加工過程中，在各種蛋白激酶的作用下，將ATP 的γ- 磷酸基轉移到蛋白質的Ser、Thr、Tyr 殘基的羥基上的過程，是存在于各類生物中調節(jié)蛋白質活性的一種基本的、普遍的機制。并且，蛋白質的磷酸化修飾也影響蛋白質的高級結構的形成。糖基化修飾能夠改變蛋白質的構象，提高蛋白質的穩(wěn)定性。中華蜜蜂DnaJB6具有15 個糖基化與49 個磷酸化修飾位點（圖5 和圖6）。并且，DnaJB6 蛋白為不穩(wěn)定蛋白（表2）。綜上可推測，磷酸化與糖基化修飾可能是維持DnaJB6 穩(wěn)定的重要原因。

同源建模指在已經通過實驗方法測定三級結構的蛋白質的數(shù)據(jù)庫中，選取與待測蛋白質同源性較高的蛋白質作為模板，再利用計算機模擬和計算預測其三維空間結構。模板與中華蜜蜂DnaJB6 的序列相似度為52.69%。并且，同源建模的GMQE 值為0.4，QMEAN 為-4.13（表6）。這些結果表明，預測獲得的三維結構模型的可信度一般，需要進一步的實驗驗證與調整。