美沙西汀-甲氧基-13C及其類似物的合成

陳 凱，代德勝，王春玲，魏翠雯，卿 晶，沈桂富

(深圳市中核海得威生物科技有限公司，廣東 深圳 518057)

呼氣試驗(yàn)是指呼氣成分直接測(cè)定或測(cè)定攝入特定化合物后呼氣中的標(biāo)志氣體，實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體生理、病理狀態(tài)的非侵入性判斷。呼氣試驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)單、方便，受檢者依從性好、容易操作，可完成一般方法難以進(jìn)行的診斷[1]。目前已經(jīng)應(yīng)用的臨床技術(shù)包括一氧化氮呼氣檢測(cè)哮喘[2]、13/14C-尿素呼氣試驗(yàn)診斷幽門螺桿菌感染[3]、呼氣試驗(yàn)測(cè)定紅細(xì)胞壽命、13C-螺旋藻診斷胃排空功能障礙[4]等。其中13/14C-尿素呼氣試驗(yàn)已經(jīng)成為幽門螺桿菌感染診斷應(yīng)用最廣泛的方案，產(chǎn)業(yè)規(guī)模在中國(guó)已超過(guò)20億每年。

肝臟是人體最重要的代謝器官之一，擔(dān)負(fù)著解毒、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成、膽汁分泌等重要的生化功能，肝臟功能的準(zhǔn)確性測(cè)定有重要的臨床意義。目前常用的檢測(cè)方法包括血液生化檢查、藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)和代謝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)等。鑒于13/14C-尿素呼氣試驗(yàn)診斷幽門螺桿菌準(zhǔn)確度高、市場(chǎng)推廣好，13C-標(biāo)記化合物呼氣試驗(yàn)檢測(cè)肝部功能成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。例如：13C-氨基比林[5]、L-[1-13C]-苯丙氨酸[6]、咖啡因[3-甲基-13C][7]、美沙西汀-甲氧基-13C[8-9]、D-半乳糖-1-13C[10]等，其中美沙西汀-甲氧基-13C較其他的標(biāo)記化合物具有用量小、幾乎無(wú)毒、代謝快、適用性廣等優(yōu)點(diǎn)，是研究最活躍的肝功能呼氣試驗(yàn)底物[11-12]。

鑒于美沙西汀-甲氧基-13C呼氣試驗(yàn)的特點(diǎn)，近些年關(guān)于美沙西汀-甲氧基-13C評(píng)估肝功能、診斷肝硬化和肝移植患者術(shù)前與術(shù)后的功能評(píng)價(jià)[13]等方面的呼氣診斷臨床研究很多，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)處于臨床Ⅱ期和臨床Ⅲ期。目前一般以碘甲烷-13C為標(biāo)記原料，收率高，是一種常用的合成方法。由于碘甲烷-13C毒性大，運(yùn)輸、儲(chǔ)存管理要求非常嚴(yán)格，且每摩爾碘甲烷-13C的價(jià)格遠(yuǎn)高于甲醇-13C，通過(guò)甲醇-13C合成美沙西汀-甲氧基-13C得到更多關(guān)注[14-15]。

對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C是美沙西汀-甲氧基-13C的類似物，可作為藥物、防腐劑以及香料等穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)試劑的重要中間體。對(duì)甲氧基苯甲酸常見的合成方法以硫酸二甲酯為甲基化試劑，該合成方案無(wú)法直接應(yīng)用于對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的合成。2018年，上海穩(wěn)定同位素工程技術(shù)研究中心的王偉[16]以尼鉑金乙酯、碘甲烷-13C為原料，通過(guò)酚羥基甲基化、水解乙酯兩步反應(yīng)得到對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C，其中碘甲烷-13C的利用率為79.32%。

本文以Mitsunobu反應(yīng)作為關(guān)鍵反應(yīng)，配合簡(jiǎn)單的官能團(tuán)轉(zhuǎn)化，以甲醇-13C為標(biāo)記試劑，合成美沙西汀-甲氧基-13C和對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C，擬為呼氣檢測(cè)肝功能研究的開展提供參考。

1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑

氧羰酰-4-羥基苯胺(純度>98%)、三苯基膦(純度>98%)、偶氮二甲酸二乙酯(純度>98%)、偶氮二甲酸二異丙酯(純度>98%)、三氟乙酸(純度>99%)、三乙胺(純度>99.5%)、乙酰氯(純度>98%)：薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；尼泊金甲酯(純度>98%)：上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；甲醇-13C(純度>98%，同位素豐度為99%13C)、美沙西汀-甲氧基-13C(純度98.7%，同位素豐度為99%13C，對(duì)照品)：劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室；對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C(純度98%，同位素豐度為99%13C，對(duì)照品)：武漢紐瑞德特種氣體有限公司；乙腈(色譜純)：默克股份兩合公司；乙酸乙酯(EA，分析純)、正己烷(HEX，分析純)、乙醇(分析純)、碳酸鈉(分析純)、氯化鈉(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、無(wú)水硫酸鈉(分析純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；柱層析硅膠：精制型，200～300目，青島海洋化工有限公司；除特別說(shuō)明外，所有試劑均直接使用。

1.2 主要儀器

XPE303S型電子天平：梅特勒-托利多；MS7-H550-Pro數(shù)顯加熱磁力攪拌器恒溫磁力攪拌器：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司；EYELA東京理化旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 N-1300系列：東京理化器械株式會(huì)社；SHK-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HB-20耐腐蝕隔膜真空泵：上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；核磁共振氫譜(布魯克400M核磁AVANCE-Ⅲ)檢測(cè)和高分辨質(zhì)譜(賽默飛高分辨質(zhì)譜Q Exactive Focus)檢測(cè)由北京大學(xué)深圳研究生院化學(xué)生物學(xué)和生物技術(shù)學(xué)院協(xié)助完成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 反應(yīng)機(jī)理

Mitsunobu 反應(yīng)[17]是一種涉及醇羥基活化的親核取代反應(yīng)，其反應(yīng)機(jī)理示于圖1。醇在偶氮二甲酸二乙酯和三苯基膦的作用下形成活性中間體，該活性中間體被親核試劑進(jìn)攻之后碳氧鍵會(huì)發(fā)生斷裂。依據(jù)上述反應(yīng)原理，甲醇-13C的碳氧鍵可以被偶氮二甲酸二乙酯、三苯基膦活化，之后酚羥基進(jìn)攻活化中間體即可完成美沙西汀-甲氧基-13C中醚鍵的構(gòu)建。

2.2 路線優(yōu)化

本研究采用對(duì)乙酰氨基酚、甲醇-13C為原料，通過(guò)Mitsunobu反應(yīng)得到美沙西汀-甲氧基-13C(圖2)。由于美沙西汀-甲氧基-13C與反應(yīng)的副產(chǎn)物三苯基氧化膦極性接近，分離困難，不適于進(jìn)行放大研究。通過(guò)優(yōu)化，將反應(yīng)原料對(duì)乙酰氨基酚更換為極性更小的氧羰酰-4-羥基苯胺。

以氧羰酰-4-羥基苯胺、甲醇-13C為起始原料，首先通過(guò)Mitsunobu反應(yīng)得到化合物3，由于化合物3極性小，很容易與副產(chǎn)物三苯基氧化膦分離。

2.3 美沙西汀-甲氧基-13C合成

美沙西汀-甲氧基-13C的合成路線示于圖2。將100 mL乙腈加至250 mL圓底燒瓶中，再依次加入4.18 g氧羰酰-4-羥基苯胺、0.81 mL甲醇-13C和6.28 g三苯基膦，冷卻至0 ℃。將4.40 mL偶氮二甲酸二異丙酯緩慢加入反應(yīng)體系，隨后在室溫條件下攪拌4 h。體系用30 mL飽和碳酸鈉水溶液淬滅，用200 mL乙酸乙酯萃取2次，合并有機(jī)相。有機(jī)相使用30 mL飽和食鹽水清洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后減壓濃縮。剩余物用柱層析色譜(200～300目，洗脫劑為乙酸乙酯∶正己烷=1∶4)純化，真空干燥后得到白色固體3.12 g。將白色固體溶于60 mL二氯甲烷中，冷卻至0 ℃，向反應(yīng)體系中加入10 mL三氟乙酸。室溫?cái)嚢? h，減壓蒸餾除去體系中的溶劑和三氟乙酸。隨后將濃縮物溶于80 mL二氯甲烷中，冷卻至0 ℃，向反應(yīng)體系中依次加入4.16 mL三乙胺、1.78 mL乙酰氯，室溫反應(yīng)2 h。使用10 mL飽和氯化銨淬滅反應(yīng)；反應(yīng)液用乙酸乙酯100 mL萃取3次，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水20 mL洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥；過(guò)濾、旋干溶劑后用乙醇重結(jié)晶，得到固體2.10 g，即為美沙西汀-甲氧基-13C。

圖2 美沙西汀-甲氧基-13C的合成路線Fig.2 Synthetic route of of methacetin-methoxy-13C

2.4 對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C合成

對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C合成路線示于圖3。將100 mL乙腈加至250 mL圓底燒瓶中，再依次加入3.04 g尼泊金甲酯、0.81 mL甲醇-13C和6.28 g三苯基膦，冷卻至0 ℃。將4.40 mL偶氮二甲酸二異丙酯緩慢加入反應(yīng)體系，隨后在室溫條件下攪拌4 h。體系用30 mL飽和碳酸鈉水溶液淬滅，用200 mL乙酸乙酯萃取2次，合并有機(jī)相。有機(jī)相使用30 mL飽和食鹽水清洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后減壓濃縮。剩余物用柱層析色譜(200～300目，洗脫劑為乙酸乙酯∶正己烷=1∶8)純化，真空干燥后得到白色固體2.65 g。白色固體溶于80 mL乙腈/水中，冷卻至0 ℃，加入1.60 g氫氧化鈉。室溫反應(yīng)12 h，冷卻至0 ℃，使用6 mol/L的鹽酸酸化至體系pH為1。使用200 mL乙酸乙酯萃取反應(yīng)液3次，有機(jī)相使用30 mL飽和食鹽水清洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后減壓濃縮。濃縮后的固體用80 ℃的乙醇溶解，冷卻至2～8 ℃結(jié)晶。過(guò)濾干燥后得到產(chǎn)品2.26 g，即為對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C。

圖3 對(duì)甲氧基苯甲酸-13C的合成路線Fig.3 Synthetic route of 4-methoxybenzoic acid-methoxy-13C

3 結(jié)果與討論

3.1 條件優(yōu)化

溶劑和活化試劑對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率的影響結(jié)果列于表1，由表1可以看出，乙腈作為反應(yīng)溶劑時(shí)收率高于用四氫呋喃和二氯甲烷，偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD)的反應(yīng)效果好于偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)。表1中各實(shí)例中反應(yīng)液濃度均為0.25 mmol/mL，反應(yīng)時(shí)間均為4 h。使用三氟乙酸脫除叔丁氧羰基，最后在堿性條件下對(duì)氨基乙?；纯傻玫矫郎澄魍?甲氧基-13C。該合成方案可放大，操作簡(jiǎn)單，可作為合成美沙西汀-甲氧基-13C工藝化的方案。

表1 Mitsunobu反應(yīng)條件優(yōu)化Table 1 Optimization of Mitsunobu reaction conditions

在美沙西汀-甲氧基-13C合成研究的基礎(chǔ)上，以尼泊金甲酯、甲醇-13C為原料，通過(guò)Mitsunobu反應(yīng)、水解甲酯兩步反應(yīng)得到對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C。相比以碘甲烷-13C作為標(biāo)記原料的合成方法，本方法降低了成本。

3.2 美沙西汀-甲氧基-13C的結(jié)構(gòu)表征和含量測(cè)定

美沙西汀-甲氧基-13C合成樣品的核磁共振氫譜示于圖4。1H NMR(400 MHz, Acetone-d6)δ9.02(s,1H),7.60-7.45(m,2H),6.92-6.75(m,2H),3.92(s,2H),3.56(s,2H),2.03(s,3H)。美沙西汀-甲氧基-13C的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)為ESI-MS:[M+H]+=167.089 6，[M+Na]+=189.071 6，結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)與對(duì)照品一致。

圖4 美沙西汀-甲氧基-13C的核磁共振氫譜Fig.4 1H NMR of methacetin-methoxy-13C

在合成樣品純度測(cè)定方面，本文以純度為98.7%的美沙西汀-甲氧基-13C樣品作為對(duì)照品。通過(guò)分析對(duì)照品和合成樣品的高效液相數(shù)據(jù)(表2)，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算出合成樣品的純度為99.3%。經(jīng)高分辨質(zhì)譜檢測(cè)美沙西汀-甲氧基-13C合成樣品的同位素豐度為99.2%13C，符合標(biāo)記化合物豐度和純度的要求。

表2 美沙西汀-甲氧基-13C的高效液相色譜分析Table 2 HPLC data of methacetin-methoxy-13C

3.3 對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的結(jié)構(gòu)表征和含量測(cè)定

對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C合成樣品的核磁共振氫譜示于圖5。1H NMR(400 MHz, Acetone-d6)δ8.04-7.92(m, 2H),7.07-6.92(m,2H),4.06(s,1.5H),3.70(s,1.5H)。美沙西汀-甲氧基-13C的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)為ESI-MS:[M-H]+=152.042 2(負(fù)離子質(zhì)譜)，結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)與對(duì)照品一致。

圖5 對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的核磁共振氫譜Fig.5 1H NMR of 4-methoxybenzoic acid-methoxy-13C

在產(chǎn)物純度測(cè)定方面，本文以純度為98%的對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C樣品作為對(duì)照品。通過(guò)對(duì)照品和合成樣品的高效液相色譜分析(表3)，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算出對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C合成樣品的純度為101.0%，符合純度要求。

表3 對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的高效液相色譜分析Table 3 HPLC data of 4-methoxybenzoic acid-methoxy-13C

4 結(jié)論

本研究通過(guò)Mitsunobu反應(yīng)、官能團(tuán)轉(zhuǎn)化合成了美沙西汀-甲氧基-13C及其類似物對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C。美沙西汀-甲氧基-13C合成樣品的純度為99.2%，同位素豐度為99.2%13C，以甲醇-13C計(jì)算收率為63%。對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C合成樣品的純度為101.0%，同位素豐度為99.2%13C，以甲醇-13C計(jì)算收率為67%。美沙西汀-甲氧基-13C和對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的同位素豐度相對(duì)于標(biāo)記原料甲醇-13C未發(fā)生明顯降低。美沙西汀-甲氧基-13C的合成為進(jìn)一步的呼氣試驗(yàn)研究提供了基礎(chǔ)，同時(shí)該方法還可應(yīng)用于其他芳基醚類標(biāo)記化合物如非那西汀-乙氧基-1-13C等。