腐植酸產(chǎn)品特性及其對真菌和植物生長的影響

Muhammad Yaqub Asif Naeem 著

董心亮2 管天玉2 林啟美2* 譯

(1 巴基斯坦農(nóng)業(yè)與生物核能研究所 費薩拉巴德 009241 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 北京 100193)

貧瘠土壤可以通過施用化肥或有機肥來提高土壤肥力。土壤微生物尤其是真菌，通過有機物的分解和轉(zhuǎn)化，可以釋放出植物必需的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，真菌在改善土壤肥力，提高土壤生產(chǎn)力過程中起到重要作用。在微生物降解產(chǎn)物中，腐殖物質(zhì)極其重要。腐殖物質(zhì)具有多種功能，如保持與提高土壤肥力，促進土壤生物和植物生長等。大量研究證實，有機質(zhì)特別是腐殖物質(zhì)，對土壤—植物系統(tǒng)具有有益作用。

腐殖物質(zhì)或腐植酸鹽是微生物合成的物質(zhì)。但是，埋在深層土壤下的植物，經(jīng)過數(shù)百萬年的物理化學(xué)變化，也可形成腐殖物質(zhì)，如世界各地豐富的褐煤。在巴基斯坦的塔爾地區(qū)，褐煤儲量超過1700億噸。在過去的幾十年里，這些地區(qū)的天然腐植酸資源被大量開發(fā)，并廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，目前市場上有許多腐植酸產(chǎn)品，如純腐植酸鹽及其衍生物等。然而，由于形成腐殖質(zhì)的植物種類繁多，致使腐植酸的化學(xué)和物理性質(zhì)差異很大。因此，評價不同腐植酸產(chǎn)品在農(nóng)業(yè)應(yīng)用上的效果是非常必要的。目前應(yīng)用評價腐植酸產(chǎn)品的方法很多，其中，較為常用的方法之一就是比較腐植酸在改善微生物生長、繁殖、提高微生物活性以及促進土壤和堆肥過程中有機物質(zhì)分解與轉(zhuǎn)化等方面的作用。但這種方法并不完善，還有待進一步研究。

巴基斯坦地區(qū)土壤有機質(zhì)含量非常低，有機碳含量0.52%～1.38%。其中，大部分土壤有機碳含量低于1%，且10%為堿溶性的腐殖質(zhì)。其土壤有機質(zhì)含量低的主要原因：一是低投入，二是有機物分解較快，這主要是由耕作制度引起的，如水稻—小麥輪作。目前主要采用補充營養(yǎng)的方法來提高土壤肥力，如種植綠肥可提高土壤有機質(zhì)含量，增強土壤生物活性，施用廄肥也可達(dá)到此目的。對于花卉，一般都通過施用有機肥料以提高和維持土壤肥力及生物活性。有機肥料大多是農(nóng)家肥，或綠葉植物殘體經(jīng)過8～12周堆制自然腐熟而成，質(zhì)量一般較好，通過人為接種微生物等措施，可將堆肥時間縮短到兩周，也可采取其他措施，加快微生物生長繁殖，進一步改進堆制工藝。但是，人們幾乎忽略了腐植酸的作用。腐植酸對微生物尤其是真菌的生長有顯著的影響，而真菌在有機質(zhì)分解和腐質(zhì)化過程中起主要作用。一些研究結(jié)果表明，腐殖物質(zhì)能夠促進多種有益微生物生長和繁殖。Chen和Wang提出，腐殖物質(zhì)絡(luò)合微量元素(如鐵)，提高其移動性，可到達(dá)微生物細(xì)胞表面，有助于微生物吸收利用。

根據(jù)市場上銷售的腐植酸肥料情況，本研究比較了4種不同廠商生產(chǎn)的腐植酸肥料的理化性質(zhì)(如pH值、電導(dǎo)率、水溶性、密度)，光學(xué)性質(zhì)(消光系數(shù))，碳和氮含量，對4種真菌生長的影響，以及對小麥、玉米、綠豆和田菁屬種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。

1 材料與方法

1.1 腐植酸含量和光學(xué)性質(zhì)

市場銷售的腐植酸大多是經(jīng)過堿處理的褐煤，含有腐植酸和黃腐酸。從市場購買的4種腐植酸肥料樣品編號為：A、B、C和D。量取50 mL腐植酸肥料稱重，計算其密度。

相對溶解度測定：稱取10 g樣品3份，溶于500 mL去離子水中，旋轉(zhuǎn)振蕩 60 min后，室溫下4000 rpm/min離心30 min，用50 mL去離子水洗滌殘渣2次。收集洗滌液，測定洗滌液和原液的pH值和電導(dǎo)率。

腐植酸光學(xué)性質(zhì)、碳和氮含量測定：向2%腐植酸肥料溶液加入0.1 mol/L NaOH溶液，旋轉(zhuǎn)振蕩1 h后，室溫下4000 rpm/min離心30 min。取上清液，用濃硫酸調(diào)節(jié)pH值至1.5～2.0，在90 ℃下恒溫30 min，冷卻至室溫后，離心，得到殘渣，即腐植酸餾分。將所得的腐植酸餾分再次用0.1 mol/L NaOH溶解，吸取一定量腐植酸溶液和離心前的上清液，分別采用消化—比色法和微量凱氏法測定碳含量和氮含量。腐植酸溶液稀釋50倍后，分別在400 nm、465 nm、500 nm、600 nm、665 nm和700 nm下比色，計算消光系數(shù)(E465/E665)。

1.2 腐植酸對真菌菌落生長的影響

從堆肥中分離出4種真菌Alternaria alternnata，A.citri，Trichoderma harzianum 和T.hamatum，在麥芽瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，保存?zhèn)溆?。為了進一步研究腐植酸對菌落生長的影響，將真菌接種在麥芽瓊脂平板上，然后從菌落生長活躍的地方，切下一個直徑5 mm的圓盤作為接種材料。向麥芽瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)加入系列腐植酸肥A，其含量分別為0.015%，0.025%，0.04%和0.05%，腐植酸肥A是培養(yǎng)基中唯一的碳源。將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.6，此時腐植酸肥A的活性最高。先將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，然后把切下的接種材料放在培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)7天后，測量菌落直徑。

1.3 腐植酸對植物種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

稱取200 g酸洗砂于培養(yǎng)皿中(Φ10 cm)，分別將其加入到0，0.015%，0.025%和0.035%的4種腐植酸肥料溶液中(加入酸洗砂之前，用稀硫酸調(diào)節(jié)pH至7)，調(diào)節(jié)濕度至25%。每個培養(yǎng)皿分別放入10粒小麥(栽培品種Sehr)、綠豆(綠豆-54)、玉米(C-12)和田菁種子，每個處理3次重復(fù)。記錄種子萌發(fā)率，10天后測定根長、芽長及芽干物質(zhì)含量。

1.4 統(tǒng)計分析

使用MSTAT軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，均值進行Duncan多重比較，顯著性水平為P=0.05。

2 結(jié)果與討論

4種腐植酸肥料性狀有顯著性差異，見表1。腐植酸肥的外觀多樣，從細(xì)晶體狀到稠膏狀各不相同，見圖1。含水量從52%～71.1%不等，其中，由于腐植酸肥C為稠膏狀，因此含水量最高。4中腐植酸肥料的溶解度為30%～98%不等，水溶液顏色也有差異，從淺褐色到中褐色(表1、圖2)。大多外銷或進口的腐植酸肥稱其溶解度達(dá)到100%，實際上未必。巴基斯坦并沒有腐植酸肥質(zhì)量控制措施，一般是用8%～10%的NaOH或KOH處理褐煤，混合物烘干、包裝即為腐植酸肥料，因此，這些產(chǎn)品含有不同比例的礦物質(zhì)，而這些礦物質(zhì)大多沒有很好地去除。腐植酸肥料密度(1.67～4.17 g/cm3)差異很大，這可能是由于原料礦物質(zhì)含量差異所致，例如不同地區(qū)的褐煤，礦物質(zhì)含量有很大差異。

表1 腐植酸A，B，C，D的物理化學(xué)特征Tab.1 Some physico-chemical characteristics of humates A, B, C, and D

圖1 不同腐植酸肥料的外觀Fig.1 Physical appearance of different humates

圖2 不同腐植酸肥2%水溶液的顏色變化Fig.2 Color variation of 2% aqueous solution of different humates

4種腐植酸肥料的pH值范圍在5.39～10.11之間，電導(dǎo)率變化范圍在1.14～3.14 mS/cm之間(表1)。很顯然，4種腐植酸肥差異很大，腐植酸肥A的物理化學(xué)性質(zhì)(溶解度、pH、EC和HA-C)好于其他3種肥料，其溶液的pH更接近中性，因此，選取腐植酸肥A來研究其對真菌生長的影響。

4種腐植酸肥料碳含量在22.95%～36.56%之間波動，而氮含量在0.658%～1.183%之間波動，碳氮比(C/N)在30.90～44.14波動，腐植酸肥D的氮含量最低，見表2。上述結(jié)果與大多數(shù)研究者報道的結(jié)果不一致，Campitelli等和Fasurova等報道，腐植酸碳含量約為50%，而氮含量則大于3%，C/N在10～15之間；Ku?erik等報道來源于褐煤的9種腐植酸肥，碳含量約57%，氮含量1.3%左右，C/N約為40；2003年，Ku?erik和Klucakova等研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)生產(chǎn)腐植酸肥料使用原料為褐煤，其碳、氮含量分別為73%和1%。

將4種腐植酸肥樣品溶于0.1 mol/L的NaOH溶液中，分離得到腐植酸(HA)和黃腐酸(FA)，腐植酸中碳含量(HA-C)占總碳含量的40.3%～77.5%，黃腐酸碳(FA-C)占總碳含量的22.5%～59.7%，HA-C/FA-C比值為0.68～3.45(表2)。腐植酸肥A的HA/FA比值最高，而腐植酸肥C的HA/FA比值最低。這與Fasurova和Pospisilova報道的HA/FA比值為0.5～3.0基本相一致，他們在后來的研究中還發(fā)現(xiàn)，HA/FA比值越高，表示其腐殖化程度越高。本試驗選用的4種腐植酸肥中，腐植酸肥C的HA/FA最低，表明其腐殖化程度最低，也是最年輕的褐煤。

表2 腐植酸碳和氮含量分析Tab.2 Carbon and Nitrogen analysis of humates

光學(xué)密度可以用來區(qū)分腐植酸肥樣品中的腐植酸和黃腐酸。未知樣品，如褐煤、泥炭、有機土壤等，可以通過測定吸光度和E4/E6值，與標(biāo)準(zhǔn)樣品進行比較，從而鑒別腐植酸和黃腐酸含量。E4/E6值與腐植酸平均分子量呈負(fù)相關(guān)，黃腐酸E4/E6值(>8)遠(yuǎn)大于腐植酸E4/E6值(3～5)，任何腐植酸樣品的E4/E6值可以作為一個很好的生物活性指標(biāo)。

圖3結(jié)果表明，在400 nm～700 nm范圍內(nèi)，0.1 mol/L NaOH腐植酸溶液的吸光度，僅有腐植酸肥C變化不大，其余3種腐植酸肥的變化接近，都是隨著波長的增加而降低。Ku?erik和Klucakova以及Fasurova和Pospisilova的報道中也得到了相似的結(jié)果。

腐植酸的消光系數(shù)E4/E6(也稱為腐殖化指數(shù))為3.64～5.48，見圖4。腐植酸肥C的E4/E6最小，為3.64，而腐植酸肥B的E4/E6最大，為5.48。其他波長計算的比值與E4/E6比值趨勢相似，相關(guān)系數(shù)大于0.92。2003年，Ku?erik和Klucakova等報道該值為3.9，與本研究的結(jié)果相近，但2006年Campitelli等從3種土壤中提取的腐植酸的E4/E6平均值為5.1，F(xiàn)asurova和Pospisilova報道的E4/E6值則為5.2～9.1，很顯然，這與腐植酸的相對腐殖質(zhì)化程度有關(guān)，E4/E6值越高，腐殖化程度越低。

關(guān)于Alternaria sp.和Trichoderma harzianum sp.降解纖維素能力的報道很多，其在堆肥過程中具有十分重要的作用。

圖3 0.1 mol/L NaOH溶解的腐植酸在400 nm、500 nm、600 nm和700 nm下的吸光度Fig.3 Optical density of humic acid dissolved in 0.1 N NaOH at 400 nm, 500 nm, 600 nm and 700 nm

圖4 400nm、500 nm、600 nm和700 nm波長下的消光系數(shù)Fig.4 Extinction ratios for wavelength 400 nm, 500 nm,600 nm and 700 nm

本試驗4個供試真菌中，Trichoderma harzianum, Alternaria alternata和A.citrae在0.025%的腐植酸培養(yǎng)基生長最快，菌落直徑如圖5和圖6所示。高濃度腐植酸會抑制菌落生長，但0.05%的腐植酸會促進T.hamatum的生長。此外，2010年，Prakash等研究發(fā)現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象，木霉屬的真菌如T.viridae既可溶解褐煤，又可釋放腐殖物質(zhì)。大量研究表明，在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的腐植酸，可促使微生物生長更快。Gryndler等也證實了腐植酸能夠刺激真菌(如菌根)生長。本研究發(fā)現(xiàn)，0.2%腐植酸溶液能夠促進菌落生長，而Prakash等的研究發(fā)現(xiàn)，大于0.5%則會抑制菌落生長。

圖5 4種真菌在添加0.00, 0.015%, 0.025%,0.040% 和0.050%腐植酸A的瓊脂培養(yǎng)基上的菌落直徑Fig.5 Colony diameter of four fungi grown on agar medium supplemented with 0.00, 0.015%, 0.025%, 0.040% and 0.050 % humic Acid “A”

圖6 4種真菌在添加不同濃度(0.00，0.015%，0.025%，0.040%和0.050%，分別用C0-C4表示)腐植酸A的培養(yǎng)基中菌落生長情況Fig.6 Colony growth of different fungi on growth medium supplemented with 0.00, 0.015%, 0.025%, 0.040% and 0.050% of humate “A” (C0 - C4, respectively)

不同植物對腐植酸的響應(yīng)存在差異。以小麥、玉米、綠豆、田菁4種植物為例，腐植酸僅提高了田菁種子萌發(fā)率(與對照相比，提高了4.71%～16.7%)，而不同濃度腐植酸對于根和芽生長的影響沒有特定的規(guī)律,見表3。小麥和玉米的根和芽最長，田菁的根和芽則最小，而小麥的根重最重。腐植酸促使小麥和玉米的根長和芽的干物質(zhì)重量明顯增加，但對綠豆和田菁無顯著影響。這與一些報道結(jié)果不一致，如施用腐植酸肥可以提高種子萌發(fā)率，增強幼苗活力，大幅度提高植物生產(chǎn)力等。研究表明，在根培養(yǎng)基中加入腐植酸，可以提高種子萌發(fā)率和幼苗活力，但在以萵苣和番茄為材料進行試驗時，腐植酸沒有提高這兩種植物種子萌發(fā)率，僅對提高幼苗活力具有促進作用。分析產(chǎn)生這些差異的原因，可能是由于腐植酸肥的原料及化學(xué)組成不同所致。很顯然，巴基斯坦銷售的腐植酸肥，由于在生產(chǎn)中缺乏適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量管理，可能導(dǎo)致了不可預(yù)知的結(jié)果。

表3 培養(yǎng)基中添加不同的腐植酸肥對4種植物種子萌發(fā)和生長情況的影響Tab.3 Seed germination and seedling growth in wheat, maize, mung bean and sesbania as affected by supplementation of growth medium with humates

3 結(jié)論

綜上所述，市場上銷售的腐植酸肥料在很多方面差異顯著，包括對微生物和植物的影響。因此，希望有關(guān)部門加大對腐植酸肥料質(zhì)量的監(jiān)控，這樣才能更好地發(fā)揮腐植酸在農(nóng)業(yè)上的重要作用，有利于促進巴基斯坦腐植酸肥料行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。很顯然，在腐植酸肥料產(chǎn)品上僅標(biāo)明腐植酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還需要給出更詳盡的參數(shù)，包括標(biāo)記巴基斯坦不同地區(qū)的褐煤來源。

略)

譯自：Soil Environment,2013,32(1):63～70。