一株雞源莢膜A型多殺性巴氏桿菌分離鑒定及耐藥性分析

鐘敏，邱光忠，胡艷，林小翠，郭小波，成笛，鐘如意，劉瑞平

（贛州市畜牧水產(chǎn)研究所，江西贛州341000）

禽多殺性巴氏桿菌病又名禽霍亂，是由多殺性巴氏桿菌引起的出血性敗血癥，各個日齡的雞都可感染，其中以成年雞的易感性最高，但幼齡雞感染后病死率高，臨床癥狀通常以急性禽霍亂為主,病雞精神抑郁、羽毛蓬松、發(fā)燒、厭食、劇烈腹瀉，發(fā)生敗血癥，最后發(fā)生衰竭，猝死，極大地危害家禽養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展，慢性病例主要發(fā)生肺炎、關(guān)節(jié)炎，且肉髯、雞冠出現(xiàn)水腫等[1]。

1880年P(guān)asteur首次研制出禽霍亂的弱毒疫苗以來，世界各國學者相繼進行了大量的科學研究工作，在禽霍亂的免疫防制中發(fā)揮了重要作用，雖然這些疫苗對防治禽霍亂的發(fā)生起到積極作用，但仍有免疫失敗的問題，主要是因為多殺性巴氏桿菌血清型繁多、疫苗免疫譜窄和保護期較短等多種原因。藥物防治仍是目前臨床上采用比較多的方法，但由于抗生素濫用，多殺性巴氏桿菌產(chǎn)生了耐藥性，未經(jīng)藥敏試驗的盲目用藥導致藥物治療效果不理想，致使本病仍未得到有效的控制。本試驗采用16SrRNA方法對疑似禽霍亂死亡雞進行了細菌鑒定，并對其血清型、耐藥性進行檢測，為臨床該病的防治提供參考。

1 材料

1.1 病料

75日齡死亡寧都黃雞，剖檢可見皮下組織、腹膜以及腹部脂肪存在不同大小出血點，心外膜以及心冠脂肪出血，肝臟腫大呈棕紅色，表面散布針尖大的黃白色壞死點，脾臟腫大如球狀，腸道出血嚴重，腸內(nèi)容物血樣，黏膜充血出血，疑似多殺性巴氏桿菌感染。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、微量生化發(fā)酵管購自海博生物技術(shù)有限公司；2×pro Taq PCR Master-Mix、DL2000 DNA Marker等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液、藥敏紙片購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.3 標準菌株

大腸埃希氏菌ATCC25922由福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所提供。

2 方法

2.1 細菌分離培養(yǎng)

無菌采集病死雞肝臟和脾臟，劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h，待平板上長出肉眼可見的菌落后，對分離菌進行純化培養(yǎng)。根據(jù)菌落的形態(tài)挑取疑似多殺性巴氏桿菌的單菌落進行革蘭氏染色鏡檢，染色方法參照獸醫(yī)微生物學方法進行[2]。

2.2 細菌生化鑒定

將純化后的細菌按常規(guī)方法接種于生化反應管和微量發(fā)酵管等，按常規(guī)生化試驗進行，具體操作步驟按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版方法進行，按說明進行判定[3]。

2.3 分離株16SrRNA鑒定

采用熱裂解法提取細菌DNA為模板，以16Sr-RNA通用引物(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT)對目的基因進行PCR擴增。PCR反應體系25μL：2×pro Taq PCR MasterMix 12.5μL,上下游引物各1μL，DNA模板2μL，補充ddH2O至25μL。PCR反應條件：94℃預 變 性5 min,94℃變 性30s，55℃退 火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收PCR產(chǎn)物，送至上海生工生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果遞交NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對。

2.4 分離株血清型鑒定

合成用于檢測多殺性巴氏桿菌種屬特異性的Kmt基因引物(F:ATCCGCTATTTACCCAGTGG;R:GCTGTAAACGAACTCGCCAC)和A型莢膜的引物（F:TGCCAAAATCGCAGTCAG；R:TTGCCATCATTGT CAGTG），采用熱裂解法制備細菌DNA模板，對目的基因進行PCR擴增，PCR反應體系25μL:2×pro Taq PCR MasterMix12.5μL,Kmt基因上下游引物、莢膜上、下游引物各0.5μL，DNA模板2μL，補充ddH2O至25μL。PCR反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min,共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.5 分離株耐藥性分析

采用Kirby-Baner（KB）紙片擴散法對分離菌株進行藥敏試驗。以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，量取抑菌圈直徑，并根據(jù)CLSI標準對試驗結(jié)果進行判定[4]。

3 結(jié)果

3.1 細菌分離培養(yǎng)及生化鑒定

無菌采集病死雞肝臟和脾臟組織接種于TSA培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，可見大小、形態(tài)一致的灰白色圓形菌落，邊緣整齊，半透明樣，經(jīng)革蘭氏染色形態(tài)為革蘭氏陰性短小桿菌，兩端鈍圓，單個或成雙排列（圖1）。將純化后的細菌進行生化鑒定，結(jié)果顯示分離株能分解葡萄糖和蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，可形成靛基質(zhì)，產(chǎn)生硫化氫，甲基紅和VP試驗均為陰性，符合多殺性巴氏桿菌生化特征。

圖1 分離株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

3.2 分離株16SrRNA鑒定

采用細菌16SrRNA通用引物對分離株進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，大小約為1 500bp（圖2），將PCR產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司測序，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中參考菌株16SrRNA進行BLAST同源性對比。果顯示，分離株與多殺性巴氏桿菌參考株同源性大于99%。結(jié)合細菌形態(tài)觀察、生化特性和16SrRNA基因序列分析，可判定分離株為多殺性巴氏桿菌。

圖2 分離株16SrRNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

3.3 分離株血清型鑒定

以分離株的核酸為模板，采用多殺性巴氏桿菌種屬特異性Kmt基因引物和A型莢膜引物對目的基因進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3，如圖所示擴增出片段大小為460bp和1 000bp左右的目的條帶，表明分離株為莢膜血清A型的多殺性巴氏桿菌。

圖3 分離株Kmt基因和A型莢膜基因雙重PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

3.4 分離株耐藥性分析

采用紙片擴散法對分離株進行藥物敏感性測定，結(jié)果顯示分離株對氨芐青霉素、頭孢噻肟、恩諾沙星、多粘菌素敏感，對青霉素G、鏈霉素、四環(huán)素、氟苯尼考高度耐受。

表1 分離菌株耐藥性檢測結(jié)果

4 討論

多殺性巴氏桿菌是一種革蘭氏陰性短小桿菌，有莢膜，無鞭毛，不形成芽孢、不運動，可感染多種動物以及人，引起禽霍亂、豬肺疫等多種傳染病。1955年Carter運用間接血凝試驗依據(jù)莢膜抗原的差別，將多殺性巴氏桿菌分成A、B、D、E、F5種血清型[5]，引起禽多殺性巴氏桿菌血清型大多數(shù)是血清A型[6],如陶婭從江蘇暴發(fā)禽霍亂病例中分離出的12株多殺性巴氏桿菌[7]，莢膜血清型鑒定結(jié)果顯示皆為莢膜A型；唐沙從貴州發(fā)病雞分離的多殺性巴氏桿菌[8]，采用5對分型引物進行基因分型檢測，結(jié)果僅有A型引物擴增到大小1 050bp的目的基因片段,表明分離菌為A型多殺性巴氏桿菌；李偉杰從湖南某雞場分離的多殺性巴氏桿菌[9]，經(jīng)PCR鑒定為A型。本試驗從江西贛南地區(qū)寧都黃雞養(yǎng)殖場分離的多殺性巴氏桿菌也為莢膜A型，表明目前流行我國的雞源的多殺性巴氏桿菌，其莢膜血清型沒有發(fā)生變化，仍以A型為主。

仇桂玲從廣東分離的多殺性巴氏桿菌對丁胺卡那霉素、氟苯尼考和多粘菌素B均敏感[10]，但對卡那霉素、鏈霉素和強力霉素等表現(xiàn)出不同程度的耐藥性；丁成接從廣西產(chǎn)蛋雞分離的多殺性巴氏桿菌[11]，藥敏藥敏試驗結(jié)果表明,分離菌對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、痢特靈、氧氟沙星敏感，對鏈霉素、新霉素、強力霉素、阿莫西林等藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。從中可以看出，不同地區(qū)流行的雞源多殺性巴氏桿菌，耐藥性也會呈現(xiàn)不同結(jié)果，可能與實際生產(chǎn)中使用抗生素情況不一致有關(guān)。而同一地區(qū)，不同時間、不同養(yǎng)殖場流行的雞源多殺性巴氏桿菌對藥物的敏感性也不相同，比如，同樣是從江西分離的雞源多殺性巴氏桿菌，黃萃2019年從江西南昌烏雞源分離的多殺性巴氏桿菌對氨芐西林、丁胺卡那、多西環(huán)素和恩諾沙星敏感[12]，對頭孢曲松、卡那霉素、氟苯尼考、紅霉素、林可霉素和諾氟沙星耐藥；殷貴虎從江西南昌某規(guī)?；B(yǎng)雞場分離的多殺性巴氏桿菌對恩諾沙星、青霉素、頭孢噻肟、阿莫西林、氧氟沙星和頭孢曲松高度敏感[13]，對氨芐西林、復方新諾明、氟苯尼考、土霉素、丁胺卡那耐藥。本試驗與以上學者分離的雞源多殺性巴氏桿菌對藥物的耐藥性也存在一定差異，分離株對氨芐青霉素、頭孢噻肟、恩諾沙星、多粘菌素敏感，對青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氟苯尼考高度耐受，表明本試驗結(jié)果對其他地區(qū)多殺性巴氏桿菌病防治不太適用，具體防治措施還得根據(jù)當?shù)亓餍星闆r和耐藥性檢測結(jié)果制定。本試驗結(jié)果提示，近期在江西贛州市寧都黃雞養(yǎng)殖場治療禽霍亂時，優(yōu)先選用氨芐青霉素、頭孢噻肟、恩諾沙星、多粘菌素等藥物，同時應注意交叉和輪換用藥，避免耐藥菌株產(chǎn)生。

多殺性巴氏桿菌為條件致病菌，正常情況下，寄生在宿主的上呼吸道黏膜以及下泌尿道黏膜上，并不使宿主感染致病。在高溫、潮濕、多雨的夏、秋季節(jié)，以及氣候多變的春季最容易發(fā)生，溫度忽高忽低造成宿主的免疫力下降時，多殺性巴氏桿菌就很容易侵入機體，在局部大量繁殖，突破局部的防御體系進入血液引起菌血癥和敗血癥的表現(xiàn)，造成疫病快速流行，發(fā)病率可高達100%，嚴重影響動物生長和畜產(chǎn)品安全，給養(yǎng)殖戶造成重大經(jīng)濟損失。因此在平時的生產(chǎn)中，還需加強免疫預防和飼養(yǎng)管理，適時給雞群接種禽霍亂弱毒活菌苗或者氫氧化鋁疫苗，使機體形成免疫力，預防發(fā)病。雞場最好堅持自繁自養(yǎng)，盡可能減少到外地引進雞，并采取全進全出的飼養(yǎng)方式,制定合理的飼養(yǎng)管理制度和衛(wèi)生防疫制度，保持舍內(nèi)通風換氣良好，定期進行消毒，在氣候突變時加強防寒保暖，避免發(fā)生應激，減少發(fā)病。