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    Hsa_circ_0000880在阿爾茲海默病患者血漿中的表達及診斷價值

    2021-10-22 13:44:56李婧靜李飛翔李樹強朱洪山劉偉利陳艷艷
    鄭州大學學報(醫(yī)學版) 2021年5期
    關鍵詞:熒光素酶血漿引物

    崔 健,李婧靜,李飛翔,李樹強,朱洪山,朱 寧,聞 君,劉偉利,陳艷艷,吳 睿

    鄭州大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)康復科 鄭州 450014

    阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是世界范圍內(nèi)常見的神經(jīng)退行性疾病,已成為老年人癡呆最常見的病因之一[1]。AD起病隱匿,患者認知和記憶功能持續(xù)惡化,出現(xiàn)行為異常、人格改變及社會行為混亂[2]。該病通常呈進行性加重,患者逐漸喪失獨立生活的能力。AD的致死率和致殘率很高,給家庭和社會帶來了沉重的負擔[3]。雖然AD的診斷和治療已經(jīng)有了一定的進展,但其分子發(fā)病機制仍未闡明[4]。對其潛在機制的進一步研究,可以幫助人們更加深刻地了解AD,以促進有效治療策略的制定。

    環(huán)狀RNA(circRNA)是一類在大腦中富集的特殊單鏈非編碼RNA[5]。circRNA具有共價閉合的連續(xù)環(huán),無5’-3’極性以及poly(A),可特異性吸附微小RNA(miRNA),作為內(nèi)源分子海綿,調控miRNA的表達,發(fā)揮其獨特的生物學效應[6-7]。越來越多的證據(jù)表明,circRNA通過直接吸附miRNA,在包括AD在內(nèi)的許多疾病的發(fā)病中發(fā)揮特殊作用。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡參與了AD的發(fā)病過程。有研究[9]證實circRNA-7是miRNA-7分子海綿,調節(jié)散發(fā)性AD海馬大腦中UBE2A和EGFR的代謝過程。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)miR-214-3p在SAMP8小鼠腦組織顯著下降,與AD的發(fā)病機制有關,miR-214-3p對神經(jīng)元凋亡和自噬有抑制作用。該研究分析了AD患者血漿及人神經(jīng)母細胞瘤細胞中hsa_circ_0000880和miR-214-3p的表達,探討hsa_circ_0000880作為AD診斷的生物標志物的可能性。

    1 材料與方法

    1.1 病例選擇選取2018年5月至2019年5月在鄭州大學第二附屬醫(yī)院就診的AD患者28例(AD組),年齡70~90(78.1±5.6)歲,男18例,女10例,診斷參照IWG-2[11]標準,排除急性心肌梗死、帕金森病、癌癥和多發(fā)性硬化者[12-14]。招募28名健康人作為正常對照(對照組),年齡70~90(77.4±5.9)歲,男18名,女10名。經(jīng)常規(guī)檢查、實驗室檢查、影像學檢查、簡易智力狀態(tài)檢查量表(MMSE)評分、蒙特利爾認知評估(MoCA)評分等,確定對照組的神經(jīng)功能正常[15]。高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高脂血癥均根據(jù)現(xiàn)行臨床標準[16-19]診斷。所有受試者均被告知受試目的并且簽署知情同意書。本試驗方案均經(jīng)鄭州大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

    1.2 血漿hsa_circ_0000880和miR-214-3p水平的qRT-PCR檢測采集AD組及對照組受試者空腹8 h后的外周血2.5 mL,立即4 ℃條件下4 000×g離心15 min。分離后的血漿于-80 ℃保存。使用RNeasy mini kit(德國Qiagen公司)從血漿中提取總RNA。根據(jù)Circbank(http://www.circbank.cn/)獲得的circRNA序列并擴增引物,利用反轉錄酶M-MLV(日本TaKaRa公司)合成第一鏈cDNA。使用SYBR Green qPCR Master Mix(日本TaKaRa公司)進行hsa_circ_0000880檢測。Hsa_circ_0000880上游引物序列5’-TCCGACAGAAAAGAGTGCGA-3’,下游引物序列5’-AATCCATAGCATCGAGCCCC-3’;內(nèi)參GAPDH上游引物序列5’-GGCGATGCTG GCGCTGAGTAC-3’,下游引物序列5’- GAGGCTGT TGTCATACTTCTC-3’。反應體系共20 μL:2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL,上、下游引物及ROX Reference Dye Ⅱ各0.4 μL、DNA模板2 μL,ddH2O 6.8 μL。反應條件:預變性95 ℃ 2 min;變性95 ℃ 30 s, 退火及延伸60 ℃,30 s,共40個循環(huán)。使用Hairpin-it MicroRNAs定量PCR試劑盒(上海Gene Pharma公司產(chǎn)品)進行miR-214-3p檢測。miR-214-3p上游引物序列5’-GCCGAGACAGCAGGCACA-3’,下游引物序列5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’;內(nèi)參U6 上游引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物序列5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應體系:2×Real-time PCR Buffer 10 μL,上、下游引物各0.3 μL,miRNA RT product 2 μL,Tag酶0.2 μL,加雙蒸餾水至20 μL。反應條件:預變性95 ℃ 3 min;變性95 ℃ 12 s,退火/延伸58 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法分析hsa_circ_0000880和miR-214 -3p的相對表達水平。

    1.3 細胞實驗

    1.3.1細胞和主要試劑 人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y和293T細胞購自美國 Type Culture Collection。293T細胞使用含體積分數(shù)15%胎牛血清和青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),SH-SY5Y使用含體積分數(shù)15%胎牛血清及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件均為37 ℃,體積分數(shù)5%CO2及體積分數(shù)95%相對濕度。Hsa_circ_0000880 siRNA(si-Circ)、對照siRNA(si-NC)、miR-214-3p mimic和對照miRNA(miR-NC)均購自中國上海GenePharma公司,雙熒光素酶報告實驗用載體pmirGLO和檢測系統(tǒng)購自Promega(北京)公司,Lipofectamine 3000 購自美國Invitrogen公司。

    1.3.2雙熒光素酶報告實驗 應用PCR法擴增從AD患者血漿中提取的包含miR-214-3p結合位點的的野生型hsa_circ_0000880片段(Circbank數(shù)據(jù)庫預測),并使用重疊擴增PCR法構建并擴增結合位點突變的突變型hsa_circ_0000880片段,然后將野生型或變異型hsa_circ_0000880分別克隆到pmirGLO載體得到pmirGLO-Wt-circ_0000880(Wt-circ_0000880)或pmirGLO-Mut-hsa_circ_0000880(Mut-circ_0000880)。根據(jù)說明書的方法使用Lipofectamine 3000 將載體和miR-214-3p mimic或miR-NC共轉染至293T細胞,孵育24 h后,進行熒光素酶活性檢測。

    1.3.3抑制hsa_circ_0000880表達對SH-SY5Y細胞miR-214-3p表達的影響 SH-SY5Y細胞以每孔4×105個的密度接種于6孔板,分為si-Circ和si-NC組,每組設3個復孔,分別轉染相應siRNA。使用Lipofectamine 3000(Invitrogen公司產(chǎn)品)進行轉染,嚴格按照說明書操作。應用qRT-PCR法(同1.2)進行miR-214-3p表達的檢測。實驗重復3次。

    1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.0分析。兩組臨床特征和血漿hsa_circ_0000880水平、si-Circ和si-NC組SH-SY5Y細胞中miR-214-3p表達的比較采用兩獨立樣本t檢驗或χ2檢驗。采用ROC曲線評估hsa_circ_0000880對AD的診斷價值。AD患者血漿hsa_circ_0000880水平與MMSE、MoCA評分,miR-214-3p的相關關系采用Peason相關性分析。檢驗水準α=0.05。

    2 結果

    2.1 兩組臨床特征比較見表1。AD組MMSE和MoCA評分低于對照組。

    表1 兩組的臨床特征比較

    2.2 兩組血漿hsa_circ_0000880水平比較AD組血漿hsa_circ_0000880水平為(2.967±0.886),較對照組(1.539±0.558)明顯升高(t=7.210,P=0.015)。

    2.3 血漿hsa_circ_0000880對AD診斷的ROC曲線分析ROC曲線見圖1。AUC為0.886,95%CI為0.773~0.999,取截斷值為2.395時,其診斷的敏感度為73.7%,特異度為94.7%。

    圖1 hsa_circ_0000880診斷AD的ROC曲線

    2.4 AD患者血漿hsa_circ_0000880水平與MMSE、MoCA評分相關性AD患者血漿hsa_circ_0000880水平和MMSE、MoCA評分呈負相關(r=-0.646和-0.601,P<0.001)。

    2.5 AD患者血漿miR-214-3p與hsa_circ_0000880水平的相關性AD患者血漿miR-214-3p水平為(0.551±0.192),與hsa_circ_0000880水平呈負相關(r=-0.053,P=0.002)。

    2.6 雙熒光素酶報告實驗結果見表2。

    表2 雙熒光素酶報告實驗結果(n=5)

    2.7 抑制hsa_circ_0000880表達對SH-SY5Y細胞miR-214-3p表達的影響si-Circ組細胞中miR-214-3p相對表達水平為(2.362±0.162),較si-NC組(1.000±0.052)升高(t=17.909,P=0.048)。

    3 討論

    非編碼RNA因其獨特的生物學效應,可能與AD的病理機制(如淀粉樣蛋白沉著病、突觸缺失和神經(jīng)元凋亡)有關[5,20]。Feng等[21]在AD患者血漿中發(fā)現(xiàn)LncRNA BACE1水平升高,BACE1可能成為預測AD的潛在生物標志物。有研究[11]表明經(jīng)Aβ25~35蛋白誘導處理的SH-SY5Y細胞中miR-133b的表達下調,并且miR-133b可以作為特異性的生物標志用于AD的早期診斷,其敏感性高達90.8%。該研究結果顯示AD患者血漿hsa_circ_0000880水平明顯高于對照組。此外,hsa_circ_0000880診斷AD的ROC曲線的AUC為0.886,95%CI為0.773~0.999,截斷值為2.935時,其敏感度為73.7%,特異度為94.7%,提示hsa_circ_0000880在診斷AD方面可能具有較高的價值。

    MMSE和MoCA評分一般用于各類認知障礙和癡呆的初步篩查[22]。臨床上通常聯(lián)合檢測兩者,可提高認知障礙的檢出率,提高認知篩查的準確性。一般來說,MMSE和MoCA得分越低,病情越嚴重[23]。該研究結果表明AD組患者血漿hsa_circ_0000880水平與MMSE/MoCA評分呈負相關,提示隨著AD病情的加重,血漿hsa_circ_0000880水平呈上升趨勢。

    最近的研究表明circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡在AD發(fā)生發(fā)展過程的許多方面起著關鍵作用。最近的研究[9,24]表明,ciRS-7-miRNA-7-ube2a通路在海馬AD大腦組織中存在異常,表明了ciRS-7對miRNA-7的“海綿吸附作用”。Yang等[25]發(fā)現(xiàn)circ_0000950可以通過靶向調控miR-103,增加PTGS2的表達,從而抑制神經(jīng)元增殖,促進神經(jīng)元凋亡。Lu等[26]發(fā)現(xiàn)circHDAC9-miR-138-Sirt1在AD的認知損傷和病理過程中有潛在作用。本研究的雙熒光素酶報告實驗結果表明has_circ_0000880與miR-214-3p有靶向關系。基于以上發(fā)現(xiàn),我們推測hsa_circ_0000880可能通過下調miR-214-3p的表達在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

    綜上所述,AD患者血漿hsa_circ_0000880在水平升高,可能通過直接吸附miR-214-3p,參與AD的病理過程,hsa_circ_0000880可作為AD診斷的生物標志物。

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