抑制磷脂酰肌醇3激酶/心肌素信號(hào)通路對(duì)血管平滑肌瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

崔明哲，王 恒，翟水亭，劉 恒，李衛(wèi)校，徐如濤

河南省人民醫(yī)院(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院) 華中阜外醫(yī)院血管外科 鄭州 450003

平滑肌瘤是發(fā)生于平滑肌的良性腫瘤，可分為實(shí)性平滑肌瘤、上皮樣平滑肌母細(xì)胞瘤以及血管平滑肌瘤(angiomyoma，AM)3個(gè)亞型[1]。其中AM是指發(fā)生于皮下或真皮深部的良性腫瘤，是血管平滑肌較為常見的病理變化之一[2]。AM可發(fā)生于人體多個(gè)組織器官，如子宮、肺、鼻腔、耳廓以及跟腱等[3]。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是細(xì)胞膜受體酪氨酸激酶的下游介質(zhì)，近年來，已有大量臨床研究[4-5]表明，PI3K與蛋白激酶B相結(jié)合可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。心肌素(myocardin，MYOCD)主要存在于心臟和平滑肌組織，與多種病變密切相關(guān)，如心力衰竭、急性血管疾病和糖尿病等[6-7]。PI3K/MYOCD信號(hào)通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制信號(hào)通路，有研究[8]推測激活該信號(hào)通路可能有抑制部分腫瘤細(xì)胞增殖的作用。本研究通過檢測抑制PI3K/MYOCD信號(hào)通路表達(dá)的AM細(xì)胞增殖和侵襲能力的變化，探討PI3K/MYOCD信號(hào)通路在AM發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與主要試劑AM細(xì)胞和DMEM培養(yǎng)基(南京生航生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(上海賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品)；PI3K、MYOCD siRNA,PI3K、MYOCD以及內(nèi)參U6的引物(上海生工生物工程公司產(chǎn)品)；PI3K、MYOCD、AKT、Bcl-2蛋白一抗和二抗(英國博歐特公司產(chǎn)品)。PCR檢測試劑盒(上海研生實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品)、CCK8試劑盒(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司產(chǎn)品)、Transwell小室(上海艾研生物科技有限公司產(chǎn)品)、Trizol試劑和反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒均(美國默克公司產(chǎn)品)、PCR儀及實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國 Bio-Rad公司產(chǎn)品)。

1.2 AM細(xì)胞的培養(yǎng)與分組AM細(xì)胞應(yīng)用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/mL，分別接種至6孔板。培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞分為2組，每組3個(gè)復(fù)孔，PI3K/MYOCD siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染PI3K和MYOCD siRNA，嚴(yán)格按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作，對(duì)照組未行轉(zhuǎn)染。

1.3 AM細(xì)胞PI3K 、MYOCD mRNA表達(dá)的檢測采用qRT-PCR進(jìn)行。采用Trizol提取細(xì)胞中的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄酶和寡核苷酸合成cDNA。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μL)：緩沖液4 μL，反轉(zhuǎn)錄酶2 μL，總RNA 2 μL，去RNA酶水12 μL；反應(yīng)條件：42 ℃水浴1 h，95 ℃水浴5 min。以U6作為內(nèi)參，根據(jù)操作說明進(jìn)行PI3K mRNA、MYOCD mRNA表達(dá)的檢測。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：上、下游引物各0.4 μL、miR 0.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃10 s，94 ℃5 s，52 ℃30 s退火，72 ℃15 s，然后40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.4 AM細(xì)胞增殖和遷移的檢測轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，利用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力，用光密度(OD)值表示。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的體外侵襲力，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 AM細(xì)胞PI3K、MYOCD、AKT、Bcl-2蛋白表達(dá)的檢測采用Western blot法檢測。取兩組AM細(xì)胞，勻漿器充分研磨后加入裂解液裂解并提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)目標(biāo)蛋白大小配置適合濃度的凝膠、分離膠和濃縮膠。電泳加壓轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉封閉1 h。加入PI3K、MYOCD、AKT、Bcl-2蛋白一抗(按照1∶1 000稀釋)，以β-actin(按1∶5 000稀釋)作為內(nèi)參。除去一抗，洗滌后加入二抗。室溫孵育2 h，漂洗、化學(xué)發(fā)光法顯影，采用Image J軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值代表目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行分析。兩組AM細(xì)胞增殖和侵襲能力，PI3K和MYOCD mRNA表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，PI3K/MYOCD siRNA組AM細(xì)胞PI3K、MYOCD、AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組AM細(xì)胞PI3K、MYOCD mRNA表達(dá)水平比較見表2。

表2 兩組AM細(xì)胞PI3K和MYOCD mRNA水平比較

2.2 兩組AM細(xì)胞增殖和侵襲能力比較見表3。

表3 兩組AM細(xì)胞增殖和侵襲能力表達(dá)水平比較

2.3 兩組AM細(xì)胞PI3K、MYOCD、AKT、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較與對(duì)照組相比，PI3K/MYOCD siRNA組AM細(xì)胞的PI3K、MYOCD、AKT蛋白水平降低，而Bcl-2蛋白水平升高，見表4。

表4 兩組AM細(xì)胞PI3K、MYOCD、AKT、Bcl-2蛋白水平比較

2.4 PI3K/MYOCD siRNA組AM細(xì)胞的PI3K、MYOCD、AKT、Bcl-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性PI3K/MYOCD siRNA組AM細(xì)胞的PI3K蛋白與MYOCD、AKT蛋白呈正相關(guān)，與Bcl-2蛋白呈負(fù)相關(guān)(r=0.736、0.721、-0.693，P<0.001)，而MYOCD蛋白與AKT蛋白呈正相關(guān)，與Bcl-2蛋白呈負(fù)相關(guān)(r=0.748、-0.687，P<0.001)。

3 討論

AM是臨床上較為常見的良性腫瘤之一，可發(fā)病于任何年齡段人群以及身體任何部位[9-11]。目前臨床主要采取鎮(zhèn)痛藥對(duì)AM患者進(jìn)行治療，尚缺乏有效抑制AM細(xì)胞生長的藥物。

PI3K是參與細(xì)胞生長、增殖、代謝、運(yùn)動(dòng)、存活和凋亡等正常細(xì)胞過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。PI3K作為一種激酶，能夠磷酸化磷脂酰肌醇環(huán)的羥基。PI3K由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：催化結(jié)構(gòu)域P110和調(diào)控結(jié)構(gòu)域P85[12]。PI3K通常是通過與激活受體結(jié)合的調(diào)節(jié)亞基直接被激活或通過適配器分子間接被激活。PI3K也可以被GTP結(jié)合的RAS蛋白激活[13]。MYOCD已被證實(shí)在部分疾病中表達(dá)會(huì)升高[14]，但目前尚未完全明確其作用機(jī)制。

PI3K/MYOCD信號(hào)通路是促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖的重要途徑。過度激活這一信號(hào)通路可過度刺激細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，并最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PI3K通路異常在腫瘤疾病中非常常見，并在腫瘤轉(zhuǎn)化中起作用。PI3K是一個(gè)常見的突變激活靶點(diǎn)，PIK3基因有兩種突變，一是基因拷貝數(shù)異常，二是點(diǎn)突變導(dǎo)致PI3K持續(xù)激活[15]。MYOCD基因的常見突變是基因拷貝數(shù)的異常丟失和失活點(diǎn)突變[16]。

有研究[17]發(fā)現(xiàn)PI3K mRNA過表達(dá)的AM細(xì)胞的增殖能力明顯加強(qiáng)，PI3K在AM病情發(fā)展中具有正向促進(jìn)作用。Zhao等[18]研究結(jié)果顯示抑制MYOCD mRNA表達(dá)的AM細(xì)胞增殖能力下降。本研究結(jié)果顯示，抑制PI3K/MYOCD mRNA表達(dá)的AM細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯受抑。

有研究[19]表明，PI3K常與AKT相互作用，促進(jìn)各種腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展。AKT可降低凋亡蛋白活性，提高細(xì)胞的生存，AKT對(duì)Bcl-2家族成員、Bax蛋白和Bim蛋白的水平均具有反向調(diào)節(jié)作用，還可通過影響FOXO和p53等轉(zhuǎn)錄因子，降低BH3蛋白的表達(dá)[20-21]。本研究結(jié)果顯示，PI3K/MYOCD siRNA組細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高；AKT蛋白與PI3K、MYOCD蛋白呈正相關(guān)，而Bcl-2蛋白與PI3K、MYOCD蛋白呈負(fù)相關(guān)，提示下調(diào)PI3K以及MYOCD蛋白表達(dá)可能通過正向調(diào)控AKT蛋白、負(fù)向調(diào)控Bcl-2蛋白水平，抑制AM細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述，抑制PI3K/MYOCD信號(hào)通路可能通過調(diào)控AKT、Bcl-2等蛋白，抑制AM細(xì)胞的增殖和侵襲，這可成為AM臨床靶向治療的研究新思路。