發(fā)熱伴血小板減少綜合征患者病情嚴(yán)重程度關(guān)聯(lián)因素分析

王博昊，易志杰，黃雨馨，袁 春，李 懿，賀志權(quán)，田 誠(chéng)，陳艷萍，王海峰，馬紅霞，郭萬(wàn)申，黃學(xué)勇1，

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001 2)加利福尼亞大學(xué)歐文分校公共衛(wèi)生學(xué)院 美國(guó)加利福尼亞州爾灣 92697 3)中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九九〇醫(yī)院感染科 河南信陽(yáng) 464000 4)河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 鄭州 450016

發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是由于感染新布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus，SFTSV)而引起的感染性疾病[1]，其主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、血小板(PLT)減少，并可伴惡心、嘔吐、乏力、納差、腹瀉、肌肉酸痛等，病情危重者可出現(xiàn)皮膚淤斑、肺出血、消化道出血及意識(shí)障礙等，乃至發(fā)生多臟器功能衰竭[2]。目前在我國(guó)河南、山東、遼寧、江蘇等省份均有病例報(bào)告，病死率為12%～30%[3]。針對(duì)該病尚無(wú)特效藥，故常用利巴韋林等抗病毒藥物進(jìn)行對(duì)癥治療[4]；早期診斷及對(duì)癥治療對(duì)改善SFTS預(yù)后有重要意義。本研究旨在分析SFTS患者病情和SFTSV載量與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)之間的關(guān)系，進(jìn)而探索影響病毒載量的因素，為患者疾病嚴(yán)重程度分級(jí)和預(yù)測(cè)患者預(yù)后提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2019年5月、6月中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九九〇醫(yī)院感染科確診的69例SFTS患者為研究對(duì)象，參照《發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南(2010版)》[5]，根據(jù)流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行SFTS的診斷。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：①有發(fā)熱、惡心、疲勞乏力及肌肉酸痛等癥狀。②外周PLT和白細(xì)胞(WBC)降低。③血清SFTSV核酸陽(yáng)性。收集確診的SFTS患者的臨床診斷資料和流行病學(xué)資料，于急性期(發(fā)病1～5 d)采集靜脈血5 mL，分離血清置-40 ℃保存。

1.2 病情嚴(yán)重程度分組參照袁義美等[6]、Deng等[7]的研究，將研究對(duì)象分為輕型、重型及危重型3組。輕型：體溫38 ℃以下，全身不適及肌肉酸痛，有明顯納差、腹瀉、惡心、嘔吐等消化道癥狀，無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及出血癥狀。重型：體溫38.0 ℃及以上，極度乏力，精神萎靡，食欲不振；出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(如下頜、四肢不自主抖動(dòng)，肌張力增加，神志恍惚，昏睡，躁妄等)；老年患者多伴有基礎(chǔ)性疾病，可合并肺部感染。危重型(在重型基礎(chǔ)上符合下列標(biāo)準(zhǔn)之一的)：①急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征。②心力衰竭。③急性腎功能衰竭。④腦炎。⑤休克。⑥敗血癥。⑦彌散性血管內(nèi)凝血。⑧死亡。

1.3 主要試劑及儀器RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；SFTSV RNA檢測(cè)試劑盒(RT-PCR熒光探針?lè)?由河南省疾病預(yù)防控制中心和北京華大吉比愛(ài)生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制，由北京華大吉比愛(ài)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；One-Step RT-ddPCR反應(yīng)試劑盒、微滴發(fā)生油、ddPCR微滴分析油等均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。qRT-PCR儀(美國(guó)ABI公司)，微滴數(shù)字PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，-80 ℃低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.4 SFTSV RNA的One-Step ddPCR檢測(cè)將RNA模板及試劑盒中所需組分融化并置于冰上備用，根據(jù)檢測(cè)樣本數(shù)準(zhǔn)備反應(yīng)液。按照每樣本Supermix 5.0 μL，反轉(zhuǎn)錄酶2.0 μL，DTT 1.0 μL，靶引物1.6 μL，探針0.5 μL，RNase-free water 4.3 μL，總RNA 4.0 μL配制反應(yīng)體系。準(zhǔn)備1.5 mL離心管，將反應(yīng)體系混合振蕩30 s，瞬時(shí)離心5 s，按9.0 μL/管分裝至八聯(lián)反應(yīng)管中。取11.0 μL待測(cè)樣本、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，分別加入到已分裝的反應(yīng)體系中，混勻，瞬時(shí)離心，排除底部氣泡。將混合好的PCR反應(yīng)液加入微滴發(fā)生卡中，加入70.0 μL微滴發(fā)生油，按照儀器說(shuō)明進(jìn)行微滴生成。將生成的微滴轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)，封膜，PCR擴(kuò)增；反應(yīng)條件為48 ℃ 30 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min。使用微滴數(shù)字PCR儀讀取結(jié)果，使用FAM通道讀取信號(hào)。當(dāng)陽(yáng)性微滴>2 copies/反應(yīng)，且微滴總數(shù)不少于10 000個(gè)，判斷為陽(yáng)性；當(dāng)無(wú)陽(yáng)性微滴檢出，且微滴總數(shù)大于10 000個(gè)，結(jié)果為陰性；若陽(yáng)性對(duì)照無(wú)陽(yáng)性微滴檢出或陰性對(duì)照有陽(yáng)性微滴檢出，且微滴總數(shù)大于10 000個(gè)，則進(jìn)行復(fù)檢。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用R 4.0.1和SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)、Fisher 確切概率法、單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)[不滿(mǎn)足正態(tài)分布的資料，用中位數(shù)(四分位數(shù))表示]比較3組患者基本情況及臨床特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)的差異，應(yīng)用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行疾病嚴(yán)重程度相關(guān)因素、病毒載量相關(guān)因素的相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組患者基本情況及臨床特點(diǎn)比較69例患者均為信陽(yáng)市及周邊地區(qū)的中老年農(nóng)民，其中男34例(49.28%)，女35例(50.72%)；年齡16～85(61.2±10.9)歲。既往有高血壓8例，糖尿病5例，慢性阻塞性肺病1例，腦梗死1例；合并肺氣腫、支氣管炎16例。3組患者基本情況及臨床特點(diǎn)詳見(jiàn)表1。由表1可知，3組患者基本情況及臨床特點(diǎn)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 3組患者基本情況及臨床特點(diǎn)比較

2.2 3組患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)比較詳見(jiàn)表2。

表2 3組患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果比較

2.2.1PLT和WBC 有58例(84.1%)患者PLT異常，61例(88.4%)患者WBC異常。

2.2.2肝、腎功能指標(biāo) 有55例(79.7%)患者天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)異常，32例(46.4%)患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)異常，17例(24.6%)患者谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)異常，21例(30.4%)患者肌酐(Cr)異常。

2.2.3心肌酶指標(biāo) 有65例(97.0%)患者肌酸激酶(CK)異常，有57例患者血清乳酸脫氫酶(LDH)異常。

2.2.4SFTSV載量 3組患者間的SFTSV載量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，輕癥組<重癥組<危重癥組(H=21.614，P<0.001)。

2.3 各變量間相關(guān)分析結(jié)果

2.3.1疾病嚴(yán)重程度相關(guān)因素 年齡(rs=0.478，P<0.001)、SFTSV載量(rs=0.532，P<0.001)、AST(rs=0.439，P<0.001)、ALT(rs=0.307，P=0.007)、LDH(rs=0.476，P<0.001)和CK(rs=0.408，P<0.001)與患者疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；PLT(rs=-0.387，P=0.023)和WBC(rs=-0.372，P<0.001)與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)；GGT(rs=0.161，P=0.066)和Cr(rs=0.068，P=0.840)與疾病嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。

2.3.2病毒載量相關(guān)因素 PLT(rs=-0.347，P=0.012)和WBC(rs=-0.307，P=0.014)與SFTSV載量呈負(fù)相關(guān)。LDH(rs=0.353，P=0.008)與SFTSV載量呈正相關(guān)，關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)；其次為AST(rs=0.348，P<0.001)、淋巴結(jié)腫大面積(rs=0.346，P<0.001)、ALT(rs=0.331，P=0.007)和CK(rs=0.329，P=0.008)；年齡與SFTSV載量的關(guān)聯(lián)性較弱，相關(guān)系數(shù)為0.273(P=0.020)。

3 討論

目前針對(duì)SFTS尚無(wú)特效藥物，現(xiàn)有治療手段均為支持性對(duì)癥治療[4]。SFTS患者臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、疲勞乏力并伴有全身酸痛[8]，部分患者還會(huì)出現(xiàn)惡心，疾病初期表現(xiàn)與其他許多病毒感染性疾病表現(xiàn)相似。與其他出血熱類(lèi)似，SFTS還可引起胃腸道癥狀，WBC和PLT減少，組織酶升高，血尿、蛋白尿[9]，這些現(xiàn)象都導(dǎo)致在疾病初期難以鑒別SFTS，給患者的診斷和治療造成困難。在高發(fā)流行地區(qū)，估計(jì)有8.3%的SFTS病例未被診斷[10]。SFTS患者中多為中老年農(nóng)民，重癥患者會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和出血癥狀，甚至?xí)蚨嗯K器衰竭而導(dǎo)致死亡[2]。及時(shí)的干預(yù)及對(duì)癥治療對(duì)患者預(yù)后有重要影響，因此，患者在疾病早期的診斷鑒別就顯得尤為重要。由于確診需要檢測(cè)患者SFTSV RNA，找到疾病嚴(yán)重程度與SFTSV、疾病嚴(yán)重程度與各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系具有重大意義，可為患者嚴(yán)重程度分級(jí)、患者病情發(fā)展預(yù)測(cè)提供重要依據(jù)。

發(fā)熱、PLT減少、WBC減少是SFTS的特征現(xiàn)象[11]，并且臨床醫(yī)生也多將此作為患者初期診斷的臨床診斷依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，確診患者中，輕癥、重癥和危重癥3組間PLT、WBC異常者分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示臨床上根據(jù)PLT減少、WBC減少現(xiàn)象僅能將SFTS患者從人群中識(shí)別出來(lái)，卻難以據(jù)此將患者的疾病嚴(yán)重情況進(jìn)行進(jìn)一步的分級(jí)。本研究結(jié)果還顯示，除GGT、Cr外，其余實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)(WBC、PLT、AST、ALT、CK、LDH和SFTSV載量)在輕癥、重癥和危重癥患者間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明這些變量與患者的疾病嚴(yán)重程度之間存在關(guān)聯(lián)，以此作為患者病情嚴(yán)重程度分級(jí)的依據(jù)具有重要的意義。

通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析可知，SFTSV載量與疾病嚴(yán)重程度關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。周麟玲等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，SFTS患者臟器衰竭或發(fā)生DIC時(shí)血清SFTSV載量持續(xù)較高。同時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、出血傾向、高病毒載量(>1×105copies/mL)是SFTS患者死亡的危險(xiǎn)因素。這些都說(shuō)明病毒載量與患者病情密切相關(guān)。AST、ALT、CK和LDH不僅與患者疾病嚴(yán)重程度存在關(guān)聯(lián)，而且與SFTSV載量之間也存在著相關(guān)關(guān)系。心肌酶譜是心肌損傷的重要實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)，提示心肌、肝臟的損傷情況。而SFTSV感染機(jī)體后，不僅會(huì)造肝臟及腎臟的損傷，而且會(huì)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，致使機(jī)體釋放大量IL-6等促炎因子，進(jìn)一步加重組織器官的損傷[13]。因此AST、ALT、CK和LDH是隨著SFTSV載量的升高而變化，還是由于高病毒載量引起臟器損傷而導(dǎo)致的AST、ALT、CK、LDH等指標(biāo)升高，需要進(jìn)一步探究。

綜上，WBC、PLT、AST、ALT、CK和LDH等實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果與患者疾病嚴(yán)重程度及患者血清SFTSV載量之間均存在著一定聯(lián)系，可以作為將患者病情分級(jí)的重要依據(jù)。同時(shí)，SFTSV載量作為監(jiān)控患者病情發(fā)展及預(yù)測(cè)患者預(yù)后的指標(biāo)具有十分重大的意義，有必要進(jìn)行深度挖掘研究。