MiR-421靶向調(diào)控KDM5A基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖和侵襲能力的影響

任 芳，韓 品，李彩瑜，馬源蔚，楊思遠(yuǎn)，溫 靜，孫 怡

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052

卵巢癌是女性癌癥相關(guān)死亡的第五大惡性腫瘤。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，預(yù)計(jì)2021年美國(guó)卵巢癌新確診21 410例，死亡13 770例[1-2]。由于發(fā)病隱匿、篩查手段有限，80%卵巢癌患者在確診時(shí)已處于進(jìn)展期，伴隨腹脹、食欲不振、盆腹腔大量積液等轉(zhuǎn)移癥狀[1]。除了腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)輔以紫杉醇聯(lián)合鉑類化療藥物的傳統(tǒng)綜合治療方案，近幾年分子靶向治療如抗血管生成藥物[3]、PARP抑制劑[4-5]也在臨床上嶄露頭角，但仍有3/4的卵巢癌患者最終面臨著復(fù)發(fā)和耐藥的風(fēng)險(xiǎn)[6]，因此臨床上迫切需要為卵巢癌的診療開發(fā)新的靶點(diǎn)。

微小RNA(miRNA)是非編碼RNA家族的重要組成部分，通過介導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[7]。目前已證實(shí)，miRNA通過影響腫瘤微環(huán)境、細(xì)胞信號(hào)通路等參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[8-9]。有研究[10]認(rèn)為，胰腺癌組織中miR-142-5p表達(dá)下調(diào)，可通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。miR-421可調(diào)控靶基因MTA1的表達(dá)，抑制大腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而有效抑制大腸癌進(jìn)展[11]。組蛋白賴氨酸去甲基化酶(histone lysine demethylase,KDM)可參與表觀修飾，脫去組蛋白N末端賴氨酸殘基上的甲基進(jìn)而參與細(xì)胞多項(xiàng)生命活動(dòng)。其中KDM5A，也稱為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白-2，可通過促進(jìn)血管生成、協(xié)同腫瘤細(xì)胞增殖、激活信號(hào)通路、產(chǎn)生耐藥性等途徑在肺癌、胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的形成和進(jìn)展中發(fā)揮作用[12-15]。

目前關(guān)于miRNA是否參與卵巢癌發(fā)生及其分子機(jī)制的探討尚不充分。本研究通過觀察miR-421過表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響，探討miR-421作為治療卵巢癌候選靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010年3月至2014年12月因卵巢惡性腫瘤行手術(shù)治療并經(jīng)病理學(xué)確診的卵巢癌組織標(biāo)本和因子宮良性疾病要求行子宮雙附件切除的正常卵巢組織標(biāo)本各51例。樣本切除后立即置于-80 ℃液氮中保存。排除術(shù)前接受其他治療者。該研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(倫理號(hào)2020-KY-359)，患者及家屬知情同意。

1.2 主要藥品與試劑OVCAR-8、SKOV3、293T細(xì)胞購自美國(guó)ATCC公司，Trizol試劑購自美國(guó)Invitrogen 公司，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine 3000購自美國(guó)Thermo公司，miR-421 mimic購自上海吉瑪基因有限公司，pMIR-REPORT載體購自美國(guó)Ambion公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Promega公司，DMEM培養(yǎng)基、特級(jí)胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司，DMSO購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.3 卵巢組織中miR-421和KDM5A mRNA表達(dá)檢測(cè)從臨床收集的標(biāo)本中剪取綠豆大小卵巢組織，參照說明書加入Trizol試劑提取細(xì)胞RNA并測(cè)定純度，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以其為模板并參照SYBR Green熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增。KDM5A引物序列：上游5’-CCGTCTTTGAGC CGAGTTG-3’，下游5’-GGACTCTTGGAGTGAAACGAAA-3’；miR-421引物序列：上游5’-CTCACTCA CATCAACAGACATTAATT-3’，下游5’-TATGGTT GTTCTGCTCTCTGTGTC-3’；β-actin引物序列：上游5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游5’-CTC CTTAATGTCACGCACGAT-3’。反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各 0.4 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL，5×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，Nuclease-free H2O 6.8 μL。β-actin為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-421與KDM5A的靶向關(guān)系 TargetScan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-421同KDM5A 3’端非翻譯區(qū)(Untranslated Regions，UTR)存在可結(jié)合序列。將設(shè)計(jì)合成的KDM5A野生型(KDM5A-wt)和突變型(KDM5A-mut)3’UTR雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別連接到pMIR-REPORT載體上，構(gòu)建pMIR-KDM5A-3’UTR和pMIR-KDM5A-MUT-3’UTR。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞接種到24孔板中，分為miR-421組和miR-NC組。接種24 h后采用Lipofectamine 3000將pMIR-KDM5A-3’UTR分別與miR-421和miR-NC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，同法將pMIR-KDM5A-MUT-3’UTR分別與miR-421和miR-NC共轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，參照雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2過表達(dá)miR-421對(duì)細(xì)胞KDM5A mRNA表達(dá)的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SKOV3、OVCAR-8細(xì)胞接種至12孔板中，分為空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染miR-421 mimic的miR-421過表達(dá)組，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。空白對(duì)照組未處理，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，miR-421過表達(dá)組轉(zhuǎn)染40 mmol/L的miR-421 mimic。采用qRT-PCR測(cè)定細(xì)胞中KDM5A mRNA水平。提取細(xì)胞RNA并測(cè)定含量，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系：模板 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTP mix 12.5 μL，dH2O 10.5 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃，1 min，變性95 ℃，5 s，退火60 ℃，10 s，延伸72 ℃，15 s，共40個(gè)循環(huán)。以 β-actin為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3細(xì)胞增殖能力的檢測(cè) 應(yīng)用MTT法檢測(cè)。以細(xì)胞密度2×105個(gè)/mL接種至96孔板，每孔150 μL。分組處理同1.4.2。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，對(duì)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測(cè)。按照20 μL/孔的體積向各組細(xì)胞加入MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，按照150 μL/孔的體積加入二甲基亞砜。將96孔板至于搖床上低速振蕩20 min后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞在492 nm處的吸光度(A)值，用以表示細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè) 采用Transwell小室法。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的OVCAR-8和SKOV3細(xì)胞接種至12孔板，NC組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，miR-421過表達(dá)組轉(zhuǎn)染40 nmol/L miR-421 mimic，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將Matrigel膠按20 μL/孔加入Transwell小室。下室加入500 μL完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清)，調(diào)整生長(zhǎng)細(xì)胞密度至5×105個(gè)/mL，取200 μL于上室接種后密封培養(yǎng)12～24 h。經(jīng)固定、染色、流水浸洗后擦去Matrigel膠和細(xì)胞，風(fēng)干后倒置于顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)并取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理利用GraphPad Prism 5處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。卵巢癌和正常卵巢組織中miR-421和KDM5A mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；各組KDM5A mRNA表達(dá)和A值的比較采用單因素方差分析和Turkey檢驗(yàn)；NC組、miR-421過表達(dá)組侵襲能力的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩種卵巢組織中miR-421和KDM5A mRNA的表達(dá)結(jié)果見表1。

表1 正常卵巢與卵巢癌組織中miR-421和KDM5A mRNA表達(dá)水平的比較

2.2 miR-421和KDM5A的靶向調(diào)控關(guān)系miR-421和KDM5A-wt共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞熒光素酶活性降低(表2)，初步驗(yàn)證了miR-421和KDM5A mRNA的靶向調(diào)控關(guān)系。

表2 雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果(n=3)

2.3 各組卵巢癌細(xì)胞中KDM5A mRNA表達(dá)量比較見表3。

表3 各組卵巢癌細(xì)胞中KDM5A mRNA表達(dá)量比較(n=3)

2.4 各組卵巢癌細(xì)胞增殖及侵襲能力比較結(jié)果見表4、5。

表4 各組卵巢癌細(xì)胞A值(n=3)

表5 各組卵巢癌侵襲細(xì)胞數(shù)比較(n=3) 個(gè)

3 討論

miRNA是一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸、高度保守的單鏈非編碼RNA，可通過與下游目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)結(jié)合調(diào)控其表達(dá)，從而參與生命活動(dòng)。隨著近幾年生物信息學(xué)的發(fā)展，miRNA在解釋發(fā)病機(jī)制尤其是惡性腫瘤的診療方面顯示出巨大了潛能。最新一項(xiàng)研究[16]指出，齊墩果酸衍生物K73-03可使胰腺癌中miR-421表達(dá)上調(diào)，而miR-421又可靶向結(jié)合SPINK1抑制其表達(dá)，誘導(dǎo)線粒體損傷從而引起胰腺癌細(xì)胞自噬和凋亡，為胰腺癌治療提供了新思路；而由EZH2介導(dǎo)的miR-421表觀沉默則通過激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和干細(xì)胞特性驅(qū)動(dòng)了SPINK1陽性的前列腺癌[17]。此外，miR-421在高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平也顯著降低，通過體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型證明，miR-421可靶向調(diào)控MEF2D表達(dá)而抑制膠質(zhì)瘤的細(xì)胞活性、血管生成及放射敏感性[18]。

表觀遺傳學(xué)是指遺傳物質(zhì)的堿基序列不變，基因表達(dá)發(fā)生可遺傳改變，是機(jī)體代謝、免疫應(yīng)答、細(xì)胞分化與衰老、腫瘤發(fā)生發(fā)展及凋亡的重要機(jī)制[19-23]。其中組蛋白修飾是表觀遺傳的重要組成部分。表觀遺傳機(jī)制以及致癌基因和抑癌基因的表達(dá)失衡有可能成為卵巢癌診療的新靶點(diǎn)。Oser等[24]人設(shè)計(jì)小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，KDM5A通過靶向抑制NOTCH2和NOTCH基因，促進(jìn)神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)錄因子ASCL1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)了小細(xì)胞肺癌的神經(jīng)內(nèi)分泌表型并協(xié)同癌細(xì)胞增殖；Cui等[12]發(fā)現(xiàn)KDM5A可靶向結(jié)合線粒體丙酮酸載體-1啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)，通過調(diào)控線粒體丙酮酸代謝最終導(dǎo)致胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和遷移。

本研究結(jié)果表明，卵巢癌組織中KDM5A轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，而miR-421表達(dá)水平明顯下降。我們利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)miR-421與KDM5A可能存在的結(jié)合位點(diǎn)，并利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-421與KDM5A之間確實(shí)存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。本研究結(jié)果亦表明，過表達(dá)miR-421組的KDM5A表達(dá)減少，細(xì)胞增殖及侵襲能力受到明顯抑制，提示miR-421對(duì)卵巢癌細(xì)胞腫瘤活性的抑制可能是通過靶向抑制KDM5A實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，miR-421在卵巢癌組織中表達(dá)水平下降，可能具有抑癌特性； miR-421-KDM5A軸有望為卵巢惡性腫瘤診斷與治療提供新的思路。