IL-6干預(yù)后人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞侵襲能力及MMP-2表達(dá)的變化

劉麗莎，張琳琳，袁恩武，石 瑛，杜紅梅，高峻峻，李 偉，張 展

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052

人類成功的妊娠過程依賴于絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous trophoblasts, EVT)對子宮結(jié)締組織和子宮螺旋動脈的侵襲作用，EVT侵襲能力降低可致母體血液無法充足地供應(yīng)到絨毛間腔，妊娠期的多種不良結(jié)局由此引起[1-2]。已知基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)可參與細(xì)胞侵襲過程[3-4]。Ⅳ型膠原是滋養(yǎng)細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分，又是MMP-2、MMP-9發(fā)揮水解作用的底物，因此MMP-2和MMP-9被認(rèn)為是參與滋養(yǎng)細(xì)胞外基質(zhì)降解從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞侵襲的重要蛋白酶[5-7]。多項(xiàng)研究[8-9]結(jié)果顯示，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3蛋白(STAT3)在乳腺癌和胃癌細(xì)胞中參與調(diào)控下游靶因子MMP-2和MMP-9的表達(dá)。此外，Deshmukh等[10]的研究表明，IL-6可以上調(diào)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)磷酸化STAT3(p-STAT3)的表達(dá)，從而激活STAT3信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。人絨毛膜癌滋養(yǎng)細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)與EVT相似，多數(shù)學(xué)者采用該細(xì)胞系作為研究EVT侵襲功能的模型[11]。本研究中，我們首先觀察了STAT3活性抑制劑對JEG-3細(xì)胞STAT3及MMPs表達(dá)的影響，以驗(yàn)證STAT3的作用通路，然后觀察了IL-6干預(yù)后，JEG-3細(xì)胞侵襲能力、STAT3及MMP-2、MMP-9表達(dá)的變化，旨在探討JEG-3細(xì)胞侵襲能力改變的機(jī)制，進(jìn)一步探索由EVT侵襲能力失調(diào)導(dǎo)致不良妊娠的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源與主要試劑JEG-3細(xì)胞購自中國北京鼎國昌盛公司。DMEM-H培養(yǎng)基購自Genview公司，小牛血清由Sigma公司提供，STAT3活性抑制劑(SD-1008)為R&D公司產(chǎn)品，IL-6購自Peprotech公司，侵襲小室購自康寧公司，熒光定量PCR試劑購自北京康為世紀(jì)公司，STAT3、MMP-9鼠抗人一抗[可同時檢測MMP-9酶原前體蛋白(Pro-MMP-9)和MMP-9活化蛋白(Active-MMP-9)]及p-STAT3兔抗人一抗購自美國CTS公司，MMP-2兔抗人一抗[可同時檢測MMP-2酶原前體蛋白(Pro-MMP-2)及MMP-2活化蛋白(Active-MMP-2)]購自美國Abcam公司,β-actin鼠抗人一抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組JEG-3細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為0.6×106個/mL，接種于6孔板中，每孔加2.5 mL細(xì)胞懸液，繼續(xù)孵育24 h。實(shí)驗(yàn)1分為空白對照組和抑制劑組(5 μmol/L SD-1008)；實(shí)驗(yàn)2分為空白對照組和IL-6組(10 μg/L IL-6)。

1.3 STAT3活性抑制劑對JEG-3細(xì)胞中STAT3、p-STAT3及MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響收集按實(shí)驗(yàn)1分組處理24 h的細(xì)胞[12]，加入蛋白提取液提取總蛋白。吸取80 μg蛋白置于微量EP管內(nèi)進(jìn)行加熱預(yù)變性，之后加入凝膠孔，進(jìn)行電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜。之后在冷庫分別與一抗(β-actin、STAT3、MMP-2、MMP-9抗體按1∶1 000稀釋,p-STAT3抗體按1∶2 000稀釋)孵育12 h。然后洗膜3遍，與HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，再次洗膜后經(jīng)ECL發(fā)光液顯像、膠片曝光定影。采集圖像，經(jīng)Gel Logic 2000系統(tǒng)讀取條帶灰度值。以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值之比為目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

采用熒光定量PCR檢測MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)。用離心管收集按實(shí)驗(yàn)1分組處理24 h的細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。然后按試劑說明書進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增條件：95 ℃10 min；95 ℃15 s；60 ℃1 min；共35個循環(huán)。選擇36B4為內(nèi)參，引物序列見表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。使用2-ΔΔCt法計(jì)算MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

表1 熒光定量PCR的引物及產(chǎn)物長度

1.4 IL-6對JEG-3細(xì)胞增殖能力、侵襲能力以及STAT3、MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響

1.4.1IL-6對JEG-3細(xì)胞增殖能力的影響 收集按實(shí)驗(yàn)2分組處理36 h后的細(xì)胞，加入MTT試劑，繼續(xù)孵育4 h。棄去培養(yǎng)孔中的液體，加入0.2 mL DMSO，在搖床中搖動10 min。用酶標(biāo)儀讀取每孔在490 nm波長處的光密度(OD)值，用以評估細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.4.2IL-6對JEG-3細(xì)胞侵襲能力的影響 采用無血清培養(yǎng)基調(diào)整JEG-3細(xì)胞密度為2.5×105個/mL，按實(shí)驗(yàn)2分組處理后，將200 μL細(xì)胞懸液加至Transwell小室上室，加入750 μL完全培養(yǎng)基，放回溫箱中繼續(xù)孵育36 h。采用PBS溶液洗膜，再經(jīng)固定、透化和染色，最后置于顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。每個小室計(jì)數(shù)8個視野(×200)，取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.4.3IL-6對JEG-3細(xì)胞中STAT3活化的影響 用無血清培養(yǎng)基孵育JEG-3細(xì)胞6 h后，按實(shí)驗(yàn)2分組干預(yù)，干預(yù)后10、30、60 min提取蛋白，檢測JEG-3細(xì)胞中p-STAT3蛋白的表達(dá)[13]，檢測方法同1.3中Western blot實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.4.4IL-6對JEG-3細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響 JEG-3細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)2分組處理36 h后，同1.3中方法分別檢測細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0 分析數(shù)據(jù)。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析空白對照組和抑制劑組細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、MMP-2、MMP-9表達(dá)的差異以及空白對照組和IL-6組細(xì)胞增殖能力、侵襲能力及p-STAT3、MMP-2、MMP-9表達(dá)的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 STAT3活性抑制劑對JEG-3細(xì)胞STAT3、MMPs表達(dá)的影響STAT3活性抑制劑SD-1008干預(yù)24 h，JEG-3細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)量降低，MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)量亦降低(Active-MMP-9條帶灰度值過低，未進(jìn)行數(shù)據(jù)分析)。見圖1、表2。

1、2：空白對照組；3、4：抑制劑組

表2 STAT3活性抑制劑對JEG-3細(xì)胞STAT3、MMPs表達(dá)的影響

2.2 IL-6對JEG-3細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的影響與空白對照組相比，IL-6組JEG-3細(xì)胞增殖能力無明顯變化，但侵襲能力增強(qiáng)。見表3。

表3 IL-6對JEG-3細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的影響

2.3 IL-6對JEG-3細(xì)胞p-STAT3表達(dá)的影響與空白對照組相比，IL-6組JEG-3細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)量在3個時間點(diǎn)均無明顯改變(因p-STAT3蛋白灰度值均過低而未行數(shù)據(jù)分析)(圖2)。

1：空白對照組，2、3、4：分別為IL-6干預(yù)10、30、60 min

2.4 IL-6對JEG-3細(xì)胞MMPs mRNA、蛋白表達(dá)的影響與空白對照組相比，IL-6組細(xì)胞中Active-MMP-2蛋白表達(dá)量增加，但MMP-2、MMP-9 mRNA及Pro-MMP-2、Pro-MMP-9蛋白的表達(dá)量無明顯改變(Active-MMP-9條帶灰度值過低，未進(jìn)行數(shù)據(jù)分析)(圖3、表4)。

1、2：空白對照組；3、4：IL-6組

表4 IL-6對JEG-3細(xì)胞MMPs蛋白、mRNA表達(dá)的影響

3 討論

研究[14-15]顯示，STAT3與非小細(xì)胞肺癌、人結(jié)腸癌的侵襲有關(guān)。STAT3信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲功能的重要途徑之一，通過激活胃癌細(xì)胞中STAT3的磷酸化可以增加細(xì)胞的侵襲能力并上調(diào)細(xì)胞中MMPs的表達(dá)；而抑制乳腺癌細(xì)胞中STAT3介導(dǎo)的信號通路，可下調(diào)MMPs的表達(dá)并降低細(xì)胞的侵襲性[8，16]。有證據(jù)[17]表明，抑制鼠類STAT3基因的轉(zhuǎn)錄及磷酸化，其妊娠過程受到了嚴(yán)重阻礙。SD-1008是一種能直接阻斷JAK/STAT3信號通路的抑制劑[18]。本研究中，采用SD-1008對JEG-3細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞中p-STAT3、MMP-2、MMP-9蛋白及MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)下降，由此推測STAT3可能是EVT中MMP-2和MMP-9的上游調(diào)控因子之一。

白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)和IL-11已被證實(shí)分別通過STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號的級聯(lián)傳遞，從而調(diào)節(jié)EVT和腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[19-20]。IL-6與這些因子都屬于“IL-6細(xì)胞因子超家族”的成員，都以細(xì)胞膜的gp130結(jié)合蛋白作為受體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)外信號的傳遞。本研究探討了外源性IL-6對JEG-3細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)10 μg/L IL-6刺激36 h后，JEG-3細(xì)胞侵襲能力明顯升高。但是，F(xiàn)itzgerald等[21]的研究數(shù)據(jù)表明IL-6對JEG-3細(xì)胞的侵襲能力沒有明顯影響，可能的原因是IL-6濃度以及作用時間不同。本研究中MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 μg/L IL-6對JEG-3細(xì)胞的增殖能力無明顯影響，排除了細(xì)胞增殖能力的改變對侵襲實(shí)驗(yàn)的影響，進(jìn)一步證實(shí)了IL-6可以提高JEG-3細(xì)胞的侵襲性。另外有研究[22-23]發(fā)現(xiàn)，IL-6對其他EVT(如HTR-8/Svneo細(xì)胞系和AC-1M88細(xì)胞系)有著相似的侵襲和趨化能力增強(qiáng)作用。因此我們認(rèn)為，一定濃度的IL-6對維持和增加EVT的侵襲性有著重要的作用。

與預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的是，JEG-3細(xì)胞經(jīng)IL-6干預(yù)后的侵襲能力增加，但是p-STAT3、Pro-MMPs的表達(dá)水平無顯著變化，這說明雖然STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對JEG-3細(xì)胞中MMPs的表達(dá)有重要調(diào)節(jié)作用，但是IL-6并未通過該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)JEG-3細(xì)胞的侵襲能力。同時我們發(fā)現(xiàn)，IL-6干預(yù)后的JEG-3細(xì)胞中活化形式的MMP-2(Active-MMP-2)表達(dá)水平升高，這點(diǎn)讓我們感到意外，因?yàn)镸MPs在合成時多以酶原的形式存在，一般通過從前體形式釋放抑制性前肽域而被激活才能獲得降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的能力[4，24]。另外，F(xiàn)eng等[25]發(fā)現(xiàn)IL-6可以通過Raf-MAPK-ERK1/2通路上調(diào)細(xì)胞內(nèi)MMP14的表達(dá)；而文獻(xiàn)[26]表明MMP-2的活化與細(xì)胞表面MT1-MMP(MMP14)的調(diào)控密切相關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果，我們推測IL-6刺激滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2活化的機(jī)制可能與上調(diào)MT1-MMP有關(guān)，有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，STAT3可能是誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞表達(dá)MMP-2和MMP-9的關(guān)鍵上游調(diào)控因子之一；但是IL-6并未通過該通路調(diào)節(jié)其侵襲能力，而是可能通過其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)細(xì)胞中MMP-2的活化而上調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力。