門冬氨酸鳥氨酸聯合奧拉米特對急性肝衰竭大鼠肝功能的影響

李晶晶，張文馨，張 倩，劉艷月，谷紅麗，萬菲菲，王 晶

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科 鄭州 450052

肝衰竭是臨床常見的危重癥之一，病死率高達70%～80%[1]；目前肝衰竭的治療包括去除病因，對癥、支持治療和維護內環(huán)境穩(wěn)定(如人工肝)，干細胞或肝細胞移植，最終部分患者依賴于肝移植?！岸未驌簟睂W說認為體內免疫應答過強、內毒素血癥、細胞因子紊亂等多種因素與肝衰竭發(fā)生有關；肝衰竭時大量肝細胞壞死和凋亡，肝細胞功能受損，“殘存”肝細胞不能滿足身體代謝的需要，引起血氨升高、乳酸中毒、血糖紊亂、吲哚水平增高等一系列代謝紊亂；而繼發(fā)血氨升高可以再次誘導肝細胞損傷[2-5]。氨在體內聚集，還可透過血腦屏障干擾腦能量代謝，從而引起肝性腦病[6-7]。因此如何調整體內代謝途徑(如降低血氨)是目前肝衰竭治療研究的熱點[8]。門冬氨酸鳥氨酸(ornithine aspartate，OA)為常用降血氨藥物[9]。奧拉米特是一種乳清酸鹽，可改善清蛋白、白蛋白及血清總蛋白的水平[10]。血氨代謝通路主要有氨甲酰磷酸合成酶(carbamoyl phosphate synthetase,CPS) Ⅰ途徑和CPS Ⅱ途徑，CPS Ⅰ是血氨代謝通路中尿素循環(huán)的限速酶，CPSⅡ是CPS Ⅰ的同工酶，其主要參與嘧啶合成。人體內氨代謝通過CPS Ⅰ途徑即鳥氨酸循環(huán)將有毒的氨合成尿素由腎臟排出體外。肝衰竭后，CPS Ⅰ途徑受抑制，導致體內血氨蓄積，從而引發(fā)CPSⅡ途徑，合成大量嘧啶，使體內氨濃度進一步增高，加重肝衰竭[11]。本研究中，我們觀察了經OA降血氨及奧拉米特補充乳清酸治療后，急性肝衰竭大鼠血氨、血乳酸濃度、肝功能指標、肝臟病理組織學變化，及肝組織中CPS Ⅰ、Ⅱ蛋白表達情況，探討OA聯合奧拉米特治療肝衰竭的效果及可能機制，為肝衰竭的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器設備清潔級雄性SD大鼠40只，體重(200±20) g，由河南省實驗動物中心提供,動物合格證號:SCXK(豫)2011-0001。OA購自武漢啟瑞藥業(yè)有限公司，奧拉米特購自湖南中南制藥有限責任公司，脂多糖、D-氨基半乳糖購自Sigma-Aldrich(中國)。乳酸測定試劑盒購自上海羅氏制藥有限公司，肝功能生化檢測試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療股份有限公司。羊抗兔CPSⅠ、Ⅱ，鼠抗羊二抗購自美國Abcam公司，HE染色試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。邁瑞B(yǎng)S-820型全自動生化分析儀，BS124S型電子分析天平。

1.2 實驗分組40只雄性SD大鼠中，隨機選取32只腹腔注射D-氨基半乳糖700 mg/kg聯合脂多糖3 μg/kg以建立急性肝衰竭大鼠模型[12]；余8只大鼠腹腔注射生理鹽水5 mL/kg，為正常對照組。造模的32只大鼠，分4組處理，每組8只，分別于造模前24、16、8 h，以及造模后8、16 h灌胃給予生理鹽水5 mL/kg(模型對照組)、OA 1.0 g/kg(OA組)、奧拉米特36 mg/kg(奧拉米特組)、OA+奧拉米特(聯合干預組)。剔除造模過程中死亡大鼠。最后一次灌胃24 h后進行標本的采集及指標檢測。

1.3 血氨、乳酸濃度及肝功能指標的檢測戊巴比妥麻醉大鼠，心臟采血，檢測血氨、乳酸、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TB)、直接膽紅素(DB)、血清白蛋白(ALB)濃度。

1.4 大鼠肝組織病理學觀察及CPSⅠ、CPSⅡ蛋白表達的檢測取肝右葉下部組織，用中性福爾馬林固定，石蠟包埋，3～5 μm厚切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織學形態(tài)。將制備好的大鼠肝組織切片脫蠟脫水后，檸檬酸鈉抗原修復3 min，PBS沖洗后加入體積分數3%H2O2處理10 min，加入山羊血清于濕盒中封閉10 min；加入羊抗兔CPSⅠ和CPSⅡ抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃過夜孵育；次日PBS沖洗后加入二抗室溫孵育10 min，PBS沖洗，DAB染色，蘇木精復染，晾干后封片，光學顯微鏡下觀察。CPSⅠ、CPSⅡ陽性細胞的表現為胞質呈黃褐色顆粒。每只任選5個視野(×400)分別計數CPSⅠ、CPSⅡ陽性細胞，取均值。

1.5 統(tǒng)計學處理實驗數據采用SPSS 17.0進行分析。正常對照組和模型對照組各指標的比較采用兩獨立樣本t檢驗；模型對照組、OA組、奧拉米特組及聯合干預組各指標的分析采用2×2析因設計的方差分析；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 急性肝衰竭大鼠模型的構建與正常對照組相比，模型對照組大鼠肝功能指標均增高，提示急性肝衰竭大鼠模型造模成功。模型對照組大鼠血氨和乳酸濃度均高于正常對照組，提示急性肝衰竭大鼠體內代謝異常。模型對照組大鼠肝組織中CPS Ⅰ蛋白表達水平低于正常對照組，CPS Ⅱ蛋白表達水平高于正常對照組，提示急性肝衰竭大鼠尿素合成途徑受抑制。見表1。

表1 正常對照組和模型對照組各指標的比較

2.2 肝組織病理表現正常對照組大鼠肝臟組織肝小葉結構完整、清晰，肝索呈放射狀排列，無肝細胞變性壞死現象(圖1A)；模型對照組大鼠可見彌漫性肝細胞壞死，肝竇出血，肝小葉結構紊亂，炎癥細胞浸潤(圖1B)；奧拉米特組與模型對照組比較未見明顯差別(圖1D)；OA組(圖1C)及聯合干預組(圖1E)相較于模型對照組，肝臟病變相對較輕，壞死面積較小，可見殘存的肝小葉結構。

A～E:分別為正常對照組、模型對照組、OA組、奧拉米特組、聯合干預組

2.3 模型對照組與各干預組大鼠血氨、乳酸濃度的比較見表2。OA組及聯合干預組血氨和乳酸濃度均較模型對照組降低，聯合干預組降低最為顯著，表明OA可以改善模型大鼠的代謝，奧拉米特可以協調增效OA的改善作用。

表2 4組血氨、乳酸濃度的比較

2.4 模型對照組與各干預組大鼠肝功能指標的比較見表3。OA和奧拉米特均可改善模型大鼠肝功能，兩者聯合，協同增效。

表3 4組肝功能指標的比較

2.5 模型對照組與各干預組大鼠肝組織中CPS Ⅰ、CPS Ⅱ表達的比較見圖2、表4。與模型對照組比較，OA組和聯合干預組大鼠肝組織中CPS Ⅰ表達升高，OA組、奧拉米特組和聯合干預組CPS Ⅱ表達降低，聯合干預組變化更顯著。

A～E:分別為正常對照組、模型對照組、OA組、奧拉米特組、聯合干預組CPS Ⅰ的表達；F～J:分別為正常對照組、模型對照組、OA組、奧拉米特組、聯合干預組CPS Ⅱ的表達

表4 4組大鼠肝組織中CPSⅠ、CPS Ⅱ表達的比較

3 討論

肝衰竭是一個多因素誘發(fā)的，多機制推動的級聯病理過程，誘發(fā)因素以炎癥反應、內毒素血癥和缺血缺氧最為常見，繼而引起體內血氨升高，高血氨嚴重影響急性肝衰竭的預后[6,12-13]。有研究[14]表明，肝衰竭患者血液中含有多種毒素，其中多數來源于腸道細菌的分解產物，包括硫化氫、氨等，這些有毒物質不能被及時代謝，再次被吸收入血，則加重肝細胞的損傷。氨在血液中主要以NH4+離子形式存在，通過NH4+受體進入細胞，最后在線粒體內通過尿素循環(huán)以尿素形式排出體外。血氨代謝通路主要有CPS Ⅰ及CPS Ⅱ途徑。CPS Ⅰ是尿素循環(huán)的限速酶，N-乙酰谷氨酸是其正調節(jié)物，N-乙酰谷氨酸缺乏時CPS Ⅰ幾乎沒有活性。CPS Ⅱ在細胞質中，與嘧啶核苷酸的合成有關，不受N-乙酰谷氨酸調控。正常人體內血氨代謝以CPS Ⅰ途徑為主，即主要通過鳥氨酸循環(huán)合成尿素由腎臟排出體外[15]。如何調整體內免疫應答，減少內毒素吸收或者改善肝臟缺血缺氧，通過尿素循環(huán)降低體內血氨等都是目前肝衰竭治療研究的熱點[16]。

本研究結果顯示，模型對照組大鼠肝臟酶學指標(ALT、AST)及膽紅素水平(TB、DB)均較正常對照組升高，血氨和乳酸濃度升高，肝組織中CPS Ⅰ蛋白表達水平降低，CPS Ⅱ蛋白表達水平升高。因此推測急性肝衰竭大鼠體內尿素合成途徑受抑制，血氨代謝異常，導致氨在體內蓄積，從而引起一系列肝臟損傷。

OA為常用降血氨藥物，可促進ATP生成[6]。奧拉米特作為一種乳清酸鹽，為嘌呤及嘧啶衍生物前體，可促進核酸代謝平衡，并在體內合成核酸，糾正蛋白質、脂質、葡萄糖的代謝異常，同時有效防止肝細胞壞死和肝纖維化，刺激肝細胞再生，活化肝細胞，改善清蛋白、白蛋白及血清總蛋白的水平[17]。本研究結果顯示，OA可以降低急性肝衰竭模型大鼠血氨和乳酸濃度，改善模型大鼠的代謝功能、肝功能和肝臟病理表現，升高肝組織中CPS Ⅰ的表達，降低CPS Ⅱ表達；奧拉米特單獨作用雖僅可改善模型大鼠的肝功能，但奧拉米特可以協同OA進一步改善模型大鼠的代謝功能、肝功能和肝臟病理表現，升高肝組織中CPS Ⅰ的表達和降低CPS Ⅱ表達。本研究結果提示OA及奧拉米特聯用，可以通過平衡體內代謝、降低血氨濃度，減輕血氨對肝臟的損傷。

由于實驗條件所限，本實驗存在一些不足之處：①本實驗構建的大鼠模型血氨濃度在200 μmol/L左右，而臨床實際中肝衰竭患者血氨水平可能遠遠高于這個水平，所以本研究結論還需要臨床上的進一步驗證。②檢測的指標為常規(guī)生化指標，未從細胞因子、mRNA等水平切入進行深入研究，在機制探討方面仍有很大的不足。

綜上所述，降血氨藥物OA及保肝藥物奧拉米特聯合應用有可能成為重癥肝病治療的有效方法。進一步探討兩者的肝臟保護以及血氨代謝通路調節(jié)的作用機制，將對肝衰竭尤其是肝性腦病的治療提供科學依據及新的思路，具有重要的指導意義。