人參皂苷Rg1聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞干預對急性肺損傷肺泡上皮細胞活力的影響

吳云飛，鐘 海,張智慧，梁鴻章，陳旭源，李 想，吳 旭

1)西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院胸外科 四川瀘州 646000 2)寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院心胸血管外科 浙江寧波 315100 3)南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院胸外科 廣州 510000 4)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院胸外科 新疆喀什 844000 5)南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院急診科 廣州 510000

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴重時可引發(fā)急性呼吸窘迫綜合征，目前尚沒有有效的治療方法，中重度ALI病死率為32%～45%[1]。人Ⅱ型肺泡上皮細胞(AEC-Ⅱ)在ALI的發(fā)病中起著核心作用[2]，AEC-Ⅱ凋亡直接加速了ALI的進展。炎癥反應的過度激活可導致肺泡上皮和血管內(nèi)皮損傷，最終導致ALI[3]。此外，氧化應激在ALI的發(fā)展中也起著至關重要的作用，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的過量產(chǎn)生可導致嚴重的細胞內(nèi)氧化損傷[4]。抗炎和抗氧化治療措施有望能夠直接有效治療ALI。而修復受損的肺泡上皮細胞也將是較理想的ALI治療方法[5]。研究[6-7]表明，外源性骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)可以遷移到ALI肺組織并修復肺泡上皮，是移植治療ALI的理想種子細胞。人參皂苷Rg1是一種從中藥人參中分離得到的純化皂苷，具有保護細胞免受氧化應激損傷的作用[8-9]。本研究探討了人參皂苷Rg1聯(lián)合BMSC對H2O2誘導的AEC-Ⅱ細胞活力的影響，以期為ALI的治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑AEC-Ⅱ(中國科學院細胞庫)；人BMSC(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)；人參皂苷Rg1(美國Sigma公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；ROS、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；BCA蛋白定量測定試劑盒、增強的ECL電化學發(fā)光試劑(賽默飛世爾科技有限公司)；鼠抗活化的Caspase-3和PCNA單抗以及山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide orgotein dismutase,SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(上海碧云天研究所)。

1.2 人參皂苷Rg1作用濃度的選擇人BMSC和AEC-Ⅱ細胞均培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細胞貼壁約90%時進行傳代處理。取對數(shù)生長期的BMSC和AEC-Ⅱ細胞分別接種到96孔板中，接種密度為1×103個/孔，于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，24 h后分別更換含不同濃度(0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L)人參皂苷Rg1的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。向各孔細胞中加入20 μL MTT溶液孵育4 h，加入二甲基亞砜180 μL，待沉淀溶解后使用酶標儀測定490 nm處的吸光度(A)，計算細胞增殖活性。以未處理細胞作對照。增殖活性=實驗組A/對照A×100%。選擇對BMSC和AEC-Ⅱ細胞增殖活性影響小的人參皂苷Rg1濃度作為后續(xù)實驗藥物濃度。

1.3 細胞分組處理取生長良好的AEC-Ⅱ細胞用于實驗，實驗分為正常對照組、ALI模型組、Rg1干預組、BMSC干預組、聯(lián)合干預組。正常對照組細胞不處理。ALI模型組細胞參考文獻[10]，采用0.5 mmol/L H2O2刺激3 h，以構建ALI細胞模型。Rg1干預組細胞先用5.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理24 h，再以0.5 mmol/L H2O2刺激3 h。BMSC干預組細胞先用0.5 mmol/L H2O2刺激3 h，再與BMSC以1∶10比例共培養(yǎng)24 h。聯(lián)合干預組細胞先用5.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理24 h，再以0.5 mmol/L H2O2刺激3 h，然后與BMSC以1∶10比例共培養(yǎng)24 h。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活性AEC-Ⅱ細胞以1×104個/孔接種到96孔板中，按照1.3分組處理后，采用MTT法檢測細胞增殖活性，具體操作同1.2。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡AEC-Ⅱ細胞分組處理后，胰蛋白酶消化，收集細胞并制成1×105個/mL的單細胞懸液，分別加入Annexin V-FITC和PI試劑各5 μL，避光反應15 min，上流式細胞儀測定并分析細胞凋亡情況。

1.6 細胞內(nèi)ROS水平檢測AEC-Ⅱ細胞分組處理后，收集細胞，以含10 μmol/L的DCFH-DA的DMEM培養(yǎng)液重懸(1×105個/mL)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育20 min，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞，上流式細胞儀測定熒光強度，以熒光強度反映ROS水平。

1.7 ELISA法檢測IL-1β和TNF-α分泌量AEC-Ⅱ細胞分組處理后，收集細胞培養(yǎng)上清，按照ELISA檢測試劑盒使用說明操作，測定IL-1β和TNF-α含量。

1.8 Western blot法檢測活化的Caspase-3和PCNA蛋白表達AEC-Ⅱ細胞分組處理后，收集細胞，用含100 mmol/L PMSF的400 μL裂解緩沖液裂解30 min，提取總蛋白并使用BCA法確定蛋白濃度，隨后進行SDS-PAGE分離。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下用50 g/L脫脂牛奶封閉1 h，然后將膜與鼠抗活化的Caspase-3和PCNA一抗(1∶1 000稀釋)在4 ℃下孵育過夜，加山羊抗鼠二抗(1∶3 000稀釋)室溫下放置1 h，ECL發(fā)光。使用凝膠圖像分析軟件Image-Pro分析條帶的光密度值，計算目的蛋白表達水平。

1.9 統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學分析。不同濃度人參皂苷Rg1作用后BMSC或AEC-Ⅱ細胞增殖活性的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；正常對照組和ALI模型組各指標的比較采用兩獨立樣本t檢驗；ALI模型組、Rg1干預組、BMSC干預組、聯(lián)合干預組各指標的比較應用2×2析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1對BMSC和AEC-Ⅱ細胞的毒性作用MTT實驗結(jié)果見表1，與0.0 μmol/L組比較，10.0、20.0、40.0 μmol/L人參皂苷Rg1作用24 h后，BMSC和AEC-Ⅱ細胞增殖活性均降低，提示當人參皂苷Rg1濃度小于10.0 μmol/L時對BMSC和AEC-Ⅱ細胞幾乎無毒性作用，因此后續(xù)實驗人參皂苷Rg1的作用濃度為5.0 μmol/L。

表1 不同濃度人參皂苷Rg1作用后BMSC和AEC-Ⅱ細胞的增殖活性(n=3) %

2.2 正常對照組和ALI模型組各指標的比較見表2。ALI模型組細胞活力降低，凋亡率升高，氧化應激水平增高，炎癥因子分泌量增加。

表2 正常對照組和ALI模型組細胞增殖活性、凋亡率、氧化應激指標和炎癥因子分泌量的比較(n=3)

2.3 人參皂苷Rg1和BMSC對ALI模型細胞增殖和凋亡的影響見圖1和表3。人參皂苷Rg1和BMSC均可增強ALI模型細胞的增殖活性和PCNA表達水平，降低凋亡率和活化的Caspase-3表達水平；兩者聯(lián)合具有協(xié)同增效的作用。

1～5：分別為正常對照組、ALI模型組、Rg1干預組、BMSC干預組、聯(lián)合干預組

表3 4組細胞增殖和凋亡指標的比較(n=3)

2.4 人參皂苷Rg1和BMSC對ALI模型細胞氧化應激水平的影響見表4。人參皂苷Rg1和BMSC均可使ALI模型細胞中ROS水平和LDH含量降低，SOD活性升高；兩者聯(lián)合協(xié)同增效。

表4 4組細胞中ROS水平、LDH含量和SOD活性的比較(n=3)

2.5 人參皂苷Rg1和BMSC對ALI模型細胞炎性因子分泌的影響見表5。人參皂苷Rg1和BMSC均可使ALI模型細胞TNF-α和IL-1β分泌量降低，兩者聯(lián)合協(xié)同增效。

表5 4組細胞TNF-α和IL-1β分泌量比較(n=3) ng/L

3 討論

ALI是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，ALI嚴重時可引發(fā)急性呼吸窘迫綜合征[11-12]。H2O2可以觸發(fā)過量ROS產(chǎn)生，從而通過脂質(zhì)過氧化、DNA過氧化等促進氧化損傷。H2O2能夠誘導AEC-Ⅱ細胞發(fā)生過度的氧化應激，從而導致細胞凋亡[13]。本研究采用0.5 mmol/L的H2O2處理AEC-Ⅱ細胞3 h以構建ALI細胞模型。炎癥反應和氧化應激是導致細胞死亡的兩個關鍵細胞事件。炎癥的級聯(lián)激活進一步加重了程序性細胞死亡和組織損傷。本實驗結(jié)果顯示，H2O2處理的AEC-Ⅱ細胞表現(xiàn)出明顯的凋亡，且細胞增殖活性明顯降低，氧化應激水平增高，炎癥因子分泌量增加。

人參皂苷Rg1是一種四環(huán)三萜類化合物，是從人參中提取的生物活性成分之一。多項研究[14-17]表明，人參皂苷具有抗氧化活性并可有效減輕心臟、肝臟和腎臟的纖維化。此外，人參皂苷Rg1可以抑制大鼠肝臟組織中IL-6和TNF-α的表達，并減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥反應[18]。人參皂苷Rg1可以抑制肺上皮細胞凋亡，從而防止ALI并改善肺功能[19]。本實驗結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1能夠減少ALI模型AEC-Ⅱ細胞凋亡，提高細胞增殖活性；降低模型細胞中ROS水平和LDH含量，提高SOD活性；減少炎性因子IL-1β和TNF-α的分泌。提示人參皂苷Rg1預處理可顯著抑制ALI模型細胞的炎癥和氧化應激水平，從而提高細胞活力，有助于改善肺組織狀況。

已有研究[20]證明BMSC能夠減輕脂多糖或活細菌引起的小鼠ALI。BMSC能夠通過減輕炎性因子的分泌減輕ALI[21]。本實驗結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，BMSC能夠減輕H2O2誘導的AEC-Ⅱ細胞炎癥因子IL-1β和TNF-α的分泌，緩解H2O2誘導的氧化應激。并且人參皂苷Rg1聯(lián)合BMSC對H2O2誘導的AEC-Ⅱ細胞損傷保護作用更強。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1和BMSC均能夠減輕H2O2誘導的AEC-Ⅱ細胞損傷，二者聯(lián)合對H2O2誘導的AEC-Ⅱ細胞具有更好的保護作用；人參皂苷Rg1聯(lián)合BMSC有可能為ALI治療提供新思路。