Circ_0000739調(diào)控miR-337-3p／JAK2軸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響

蕭金豐，賀軻，向國(guó)安，黃睿，段小鵬

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma cells，HCC）是世界上第四大與死亡相關(guān)的惡性腫瘤［1］。雖然肝移植和分子靶向藥物治療在HCC治療上取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，但是HCC患者的預(yù)后依舊非常差［2］。腫瘤切除后的5年復(fù)發(fā)率保持在70%以上，肝移植后仍保持15%至30%［3］。因此進(jìn)一步研究HCC的分子機(jī)制，可能給HCC治療尋找新的分子靶點(diǎn)與治療方向。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是具有共價(jià)閉合結(jié)構(gòu)的一類(lèi)新穎的非編碼RNA，其特征是沒(méi)有游離的5′或3′極性結(jié)構(gòu)［4］。已有研究表明，circRNA參與細(xì)胞的多個(gè)生命過(guò)程，包括人類(lèi)腫瘤的形成和進(jìn)展［5］。例如circ_0001361通過(guò)上調(diào)MMP9從而促進(jìn)膀胱癌的轉(zhuǎn)移［6］。circ_0000285可通過(guò)正向調(diào)控FUS的表達(dá)從而促進(jìn)宮頸癌的增殖和轉(zhuǎn)移［7］。然而，作為circRNA家族成員的重要成員之一，circ_0000739在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)及功能尚不清楚。

微小RNA（microRNA，miRNA）是長(zhǎng)度約為22個(gè)的非編碼單鏈RNA分子，通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的惡性表型［8－9］。例如miR-129-5p通過(guò)靶向PAX6并通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K／AKT信號(hào)通路抑制成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［10］。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-337-3p在HCC中低表達(dá)，這提示miR-337-3p在HCC中發(fā)揮抑癌作用［2］。然而引起miR-337-3p低表達(dá)的上游機(jī)制仍然需進(jìn)一步研究。

Janus kinase 2（JAK2）是Janus非受體蛋白酪氨酸激酶家族的成員，并通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、免疫和造血等多種生理過(guò)程［11］。此外JAK2參與signal transducer and activator of transcription 3（STAT 3）的磷酸化過(guò)程［12］。但JAK2／STAT 3軸在HCC中異常激活的機(jī)制尚不明確。

本研究受到circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控軸啟發(fā)，在探究circ_0000739在HCC患者組織及細(xì)胞系的表達(dá)水平基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討circ_0000739調(diào)控miR-337-3p／JAK2的機(jī)制及對(duì)HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，為HCC治療尋求新的理論依據(jù)和有效的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

所有參與的患者術(shù)前均簽署知情同意書(shū)且臨床資料完整。本研究經(jīng)廣東省第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在2015年3月至2018年3月期間，從廣東省第二人民醫(yī)院接受肝切除術(shù)的HCC患者中，共獲得50例匹配的HCC患者病理組織標(biāo)本及鄰近正常組織。切除后立即置于液氮中速凍并－80℃保存。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。

1.2 細(xì)胞株，主要試劑及儀器

人HCC細(xì)胞系（Focus、HepG2和SMMC7721細(xì)胞）和人正常肝細(xì)胞系（QSG7701細(xì)胞）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所（the Shanghai Institute of Cell Biology，Chinese Academy of Sciences）。10%胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基、0.25% 胰酶購(gòu)自于中國(guó)上海賽默飛世爾科技公司。過(guò)表達(dá)circ_0000739質(zhì)粒、空載質(zhì)粒、miR-337-3p模擬物及其陰性對(duì)照物購(gòu)于GenePharma（Shanghai，China）公司。CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司。TRIzol，LipofectamineTM2000，雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒和報(bào)告基因載體均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。PCR試劑盒購(gòu)于Takara生物有限公司。一抗Rabbit Anti-JAK2 antibody（ab108596，1∶1 000）和二抗Goat Anti-Rabbit IgG H＆L（HRP）ab205718（1∶1 000）均購(gòu)于Abcam公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

所有細(xì)胞均置于含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素鏈霉素DMEM培養(yǎng)液中，并在37℃、含5%體積分?jǐn)?shù)的CO2的加濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用0.25%胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化傳代。根據(jù)lipofectamineTM2000操作說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后用qRT-PCR或者Western blot檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效度。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)

收集HCC組織及轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞系，使用TRIzol試劑從腫瘤標(biāo)本和細(xì)胞系中提取總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行cDNA合成。根據(jù)制造商說(shuō)明，在ABI 7900HT系統(tǒng)中，用SYBR Premix Ex TaqII進(jìn)行qRT-PCR。GAPDH和U6分別用作mRNA和miRNA的內(nèi)源對(duì)照。擴(kuò)增程序是在95℃下初始變性10 min，然后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，即95℃變性10 s，60℃退火30 s，85℃延伸20 s。以下引物用于qRT-PCR檢測(cè)：circ_0000739（F：5′-GCAGACACCCACTAACGTGAT-3′；R：5′TGTTGTGTTGGGCTTAACAAG-3′）；miR-337-3p（F：5′-CGCAGCTTCTTTCCGTAGT-3′；R：5′-GGTCCAGTTTTTTTTTT TTTTTGAG-3′）；JAK2：（F：5′-GGGAGGTGGTCGCTGTAAAA-3′；R：5′-ACCAGCACTGTAGCACACTC-3′）；GAPDH（F：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′；R：5′-TGTGGGCATCAATG GATTTGG-3′）和U6（F：5′-TTGGTCTGATCTGGCACATATAC-3′；R：5′-AAAAATATGGAGCGCTTCACG-3′）。我們使用2－ΔΔCT方法計(jì)算分子的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 CCK-8試驗(yàn)

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。將細(xì)胞以1×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔含100μL培養(yǎng)基，并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)1、2、3 d。在指定的時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)孔添加10 μL CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在37℃下孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

將HCC細(xì)胞以密度為5×106／孔接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)板時(shí)，用200μL無(wú)菌移液槍管尖端垂直劃線(xiàn)，以中間形成一個(gè)“一”的劃痕。然后，用無(wú)血清培養(yǎng)基輕輕清洗3次。分別在劃痕形成后0 h，24 h，顯微鏡下拍攝并計(jì)錄劃痕寬度。通過(guò)確定劃痕愈合比例來(lái)評(píng)估細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，測(cè)量三次。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

在侵襲實(shí)驗(yàn)中，將稀釋好的Matrigel基質(zhì)膠取40μL加入預(yù)冷的Transwell小室中，37℃孵育2 h使其凝固。取HCC細(xì)胞制成懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104／mL。分別在Transwell小室上室加入含0.1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液稀釋的細(xì)胞懸液200μL，下室加入500μL含20%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基。37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，甲醇固定下室中的細(xì)胞并用0.1%結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡下拍照，顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)中間及四周5個(gè)高倍鏡下視野細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)，除在Transwell小室內(nèi)未加入Matrigel外，其他步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.8 Western blot

細(xì)胞處理24 h后，收集細(xì)胞裂解液，提取蛋白。BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白質(zhì)上樣，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入1∶1 000的一抗Rabbit Anti-JAK2 antibody（Abcam，ab108596，1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，以辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）連接的二抗Goat Anti-Rabbit IgG H＆L（HRP）ab205718（1∶1 000）于室溫孵育1 h，ECL曝光蛋白條帶并拍照。本研究以GAPDH作為內(nèi)參。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

Circular RNA Interactome（https：／／circinteractome.nia.nih.gov）預(yù)測(cè)了circ_0000739和miR-337-3p的潛在結(jié)合位點(diǎn)。將野生型（WT）或突變型（Mut）circ_0000739的序列分別和miR-337-3p模擬物以及對(duì)照模擬物miR-NC共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后，通過(guò)雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告試劑盒（Promega，Madison，WI，USA）測(cè)試了熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行處理；用Graph-Pad Prism 8繪制相關(guān)圖片。計(jì)量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以%表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_0000739在HCC中高表達(dá)及其臨床意義

qRT-PCR結(jié)果顯示，HCC患者組織中circ_0000739的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（圖1A）。此外，與正常肝細(xì)胞相比，多種HCC細(xì)胞系中circ_0000739的表達(dá)顯著升高（圖1B）。進(jìn)一步，我們以中位數(shù)為分組標(biāo)準(zhǔn)分為circ_0000739高表達(dá)和低表達(dá)組。探討了circ_0000739表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果提示circ_0000739的高表達(dá)水平與HCC患者T分期級(jí)別增加及分化程度低顯著相關(guān)（表1）。這些數(shù)據(jù)提示circ_0000739參與促進(jìn)HCC進(jìn)展。

表1 circ_0000739的表達(dá)與HCC患者臨床特征的相關(guān)性

圖1 采用qRT-PCR檢測(cè)circ_0000739的表達(dá) A：癌旁組織與癌組織中circ_0000739的表達(dá)；B：正常肝細(xì)胞及HCC細(xì)胞系中circ_0000739的表達(dá)。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001與正常肝細(xì)胞相比

2.2 過(guò)表達(dá)circ_0000739促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖，運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移

為了評(píng)估circ_0000739在HCC細(xì)胞惡性表型中的作用，我們將過(guò)表達(dá)circ_0000739質(zhì)粒和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞（圖2A）。CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)circ_0000739顯著促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞活力（圖2B）。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)circ_0000739促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移和侵襲（圖2C-E）。因此，circ_0000739在HCC進(jìn)展中發(fā)揮促癌作用。

圖2 circ_0000739對(duì)HCC細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的影響 A：circ_0000739成功轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞；B：采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖；C：采用劃痕愈合檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；D和E：采用Transwell檢測(cè)遷移和侵襲。*P＜0.05；**P＜0.01；*** P＜0.001與正常細(xì)胞相比

2.3 circ_0000739吸附miR-337-3p

近年來(lái)，circRNA通過(guò)吸附miRNA參與調(diào)節(jié)腫瘤的惡性進(jìn)展成為腫瘤研究的熱門(mén)話(huà)題。受此啟發(fā)，為了探討circ_0000739下游的miRNA，我們利用Circular RNA Interactome（https：／／circinteractome.nia.nih.gov）分析得知circ_0000739和miR-337-3p的結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，我們將野生型circ_0000739（WT）載體或突變型circ_0000739（MUT）和miR-337-3pmimics及其陰性對(duì)照物共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，miR-337-3pmimics可使circ_0000739 WT組熒光素酶活性顯著下降，而對(duì)circ_0000739突變型（MUT）載體的熒光素酶活性無(wú)顯著改變（圖3B）。隨后，我們采用qRT-PCR檢測(cè)HCC患者組織中circ_0000739和miR-337-3p表達(dá)水平，結(jié)果顯示circ_0000739和miR-337-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖3C）。而且，過(guò)表達(dá)circ_0000739顯著抑制miR-337-3p的表達(dá)（圖3D）。綜上，circ_0000739直接靶向并且負(fù)調(diào)控miR-337-3p的表達(dá)。

圖3 circ_0000739對(duì)miR-337-3p的調(diào)控作用 A：采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)circ_0000739和miR-337-3p潛在的結(jié)合位點(diǎn)；B：熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證circ_0000739和miR-337-3p的相互作用；C、D：circ_0000739和miR-337-3p表達(dá)水平相關(guān)性及調(diào)控關(guān)系。***P＜0.001

2.4 circ_0000739／miR-337-3p軸促進(jìn)HCC細(xì)胞的惡性表型

前述結(jié)果表明circ_0000739負(fù)向調(diào)控miR-337-3p的表達(dá)。為了進(jìn)一步探討circ_0000739／miR-337-3p軸對(duì)HCC細(xì)胞惡性表型的影響，我們成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)circ_0000739模型。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)轉(zhuǎn)染miR-337-3p mimics（圖4A）。CCK8結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)circ_0000739組的HCC細(xì)胞的促進(jìn)作用可被miR-337-3p部分削弱（MUT）（圖4B）。miR-337-3pmimics可部分逆轉(zhuǎn)circ_0000739對(duì)HCC細(xì)胞遷移和侵襲的驅(qū)動(dòng)作用。（圖4C，4D）。這些結(jié)果表明circ_0000739／miR-337-3p軸參與促進(jìn)HCC進(jìn)展。

圖4 circ_0000739和miR-337-3p對(duì)HCC細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的影響 A：circ_0000739＋miR-337-3p mimics成功轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞；B、C、D：CCK-8和Transwell分別檢測(cè)circ_0000739組和circ_0000739＋miR-337-3p mimics組對(duì)HCC細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的影響。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001與NC組相比；＃P＜0.05；＃＃P＜0.01；＃＃＃P＜0.001與circ_0000739組相比

2.5 circ_0000739／miR-337-3p軸參與調(diào)節(jié)JAK2的表達(dá)

之前的研究表明，miR-337-3p能與JAK2 mRNA的3′UTR結(jié)合，為了進(jìn)一步探究circ_0000739／miR-337-3p軸對(duì)JAK2表達(dá)的影響。我們?cè)赾irc_0000739轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞的基礎(chǔ)上加入miR-337-3p mimics（圖5A）。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，circ_0000739顯著促進(jìn)了JAK2在mRNA和蛋白的表達(dá)水平，而miR-337-3p mimics加入后，JAK2的表達(dá)上調(diào)被部分削弱（圖5B）。這些結(jié)果表明circ_0000739／miR-337-3p軸促進(jìn)參與調(diào)節(jié)JAK2的表達(dá)，從而參與調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的惡性表型。

圖5 circ_0000739和miR-337-3p對(duì)JAK2表達(dá)的影響 A：qRT-PCR分別檢測(cè)circ_0000739組和circ_0000739＋miR-337-3p mimics對(duì)HCC細(xì)胞中JAK2表達(dá)水平的影響。B：Western blot檢測(cè)circ_0000739＋miR-337-3p mimics共轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞對(duì)JAK2蛋白表達(dá)水平的影響；***P＜0.001，與NC組相比；＃P＜0.05，與circ_0000739組相比

3 討論

近年來(lái)，circRNAs在多種癌癥中作為重要的調(diào)控因子，包括HCC［4，6］。其在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮促癌或抑癌作用，因此進(jìn)一步研究circRNAs的生物學(xué)功能，有助于為腫瘤患者提供新的治療靶點(diǎn)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)circ_0000739在HCC組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，其高表達(dá)水平與T分期級(jí)別增加和分化程度低顯著相關(guān)。機(jī)制上，circ_0000739通過(guò)吸附miR-337-3p上調(diào)JAK2的表達(dá)水平從而促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移。

circRNAs比其他線(xiàn)性RNA（如mRNA和miRNA）更穩(wěn)定［13］。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)circ_0008450作為一種新型circRNA在HCC組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)上調(diào)EZH2的表達(dá)從而促進(jìn)HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲［14］。在本研究中，circ_0000739在HCC組織和細(xì)胞中高表達(dá)，CCK8和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示circ_0000739顯著促進(jìn)了HCC細(xì)胞的增長(zhǎng)、遷移和侵襲。這說(shuō)明circ_0000739可作為HCC的一種促癌因子。

多項(xiàng)研究表明，miRNA的異常表達(dá)參與人類(lèi)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。作為miRNA家族中的重要一員，miR-337-3p在人類(lèi)多種腫瘤中通過(guò)直接結(jié)合下游靶點(diǎn)從而抑制腫瘤進(jìn)展。例如，miR-337-3p通過(guò)靶向PIK3CA和PIK3CB抑制上皮性卵巢癌的增殖［15］。miR-337-3p通過(guò)調(diào)節(jié)Capn4抑制透明細(xì)胞型腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［16］。近年來(lái)，miRNA作為circRNA的下游靶點(diǎn)受到廣泛關(guān)注［17］。例如circ_0008450吸附miR-548促進(jìn)了HCC的發(fā)生和發(fā)展［18］。此外，circ_33287吸附miR-214-3p促進(jìn)成骨分化［19］。在我們的研究中，circ_0000739通過(guò)吸附miR-337-3p并負(fù)向調(diào)控其表達(dá)水平，以加速HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

研究發(fā)現(xiàn)JAK2／STAT3信號(hào)通路的連續(xù)激活與惡性腫瘤有關(guān)，JAK2是JAK2／STAT3信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)因子，JAK2可將下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子STAT3磷酸化，STAT3形成二聚體暴露出核信號(hào)并進(jìn)入核內(nèi)，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［20］。例如IL-10與JAK2之間以蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的方式直接結(jié)合，激活JAK2／STAT3信號(hào)通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖［21］。JAK2／STAT3信號(hào)通路的異常激活在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌中發(fā)揮促癌作用也相繼報(bào)道［22－23］。此外JAK2還受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，例如miR-608、miR-151a-3p［24－25］。已有研究表明miR-337-3p通過(guò)調(diào)控JAK2／STAT3從而抑制HCC的增殖、遷移和侵襲［2］。在本探究中，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)circ_0000739促進(jìn)JAK2在HCC細(xì)胞中的表達(dá)，另一方面miR-337-3p能部分減弱其促癌作用。綜上所述，circ_0000739通過(guò)miR-337-3p／JAK2軸促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

總之，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)circ_0000739作為促癌因子在HCC細(xì)胞及組織中高表達(dá)。其高表達(dá)與HCC患者臨床的惡性病理特征相關(guān)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circ_0000739通過(guò)miR-337-3p／JAK2軸促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。為治療HCC提供了有價(jià)值的新靶點(diǎn)和新方向。