無創(chuàng)診斷指標聯合抗gp210對原發(fā)性膽汁性膽管炎肝纖維化的預測價值

王靜，劉曉峰，李文波，帖君

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種進行性、自身免疫性、慢性膽汁淤積性肝病，其特征是免疫介導的門脈炎癥和肝內膽管進行性破壞［1－3］，最終發(fā)展為肝硬化［4］。PBC的診斷通?；谀懼俜e相關血清學指標和抗線粒體抗體（antimitochondrial antibodies，AMA）或特異性抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）的檢測。PBC的病程進展個體差異很大，癥狀隱匿且非特異［3，5］。肝纖維化進展階段對于PBC的預后評估和監(jiān)測治療應答反應非常有價值［6］，特別是對熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）治療反應不佳的高?；颊?，評估肝纖維化程度是制定治療方案、評價療效的重要手段。最近，一項基于全球PBC研究組數據庫的研究再次強調了將肝纖維化進展階段納入PBC個體風險分層的必要性［7］。

肝穿刺活檢仍是診斷PBC肝纖維化分期的金標準。然而，它是一種侵入性檢查手段，并且存在導致并發(fā)癥甚至死亡的風險［8］。根據最新的指南［1－3］，在診斷PBC或監(jiān)測病情進展時通常不推薦肝活檢。因此，通過簡單可靠的無創(chuàng)方法評估PBC肝纖維化程度具有重要意義。瞬時彈性成像（transient elastography，TE）測量肝臟硬度值成為評估肝纖維化的熱點［1］。然而，其準確性是在有限的證據資料中建立［9－10］，并且依賴于專業(yè)設備和專家解讀經驗，因此并不適用于基層醫(yī)療機構。

早期研究報告了基于常規(guī)血清學檢測的簡單且經濟的無創(chuàng)診斷指標，如天冬氨酸氨基轉移酶與丙氨酸氨基轉移酶比值（AST to ALT ratio，AAR）［11］、天冬氨酸轉氨酶與血小板計數比值指數（AST-to-platelet ratio index，APRI）［12］、基于4因子的纖維化指數（fibrosis index based on 4 factors，FIB-4）［13－14］、Forns指數［15］、LOK指數［16］和FibroIndex［17］。這些方法已被證實可用于預測慢性病毒性肝炎和非酒精性脂肪肝的肝纖維化程度。然而，無創(chuàng)血清標志物在PBC的肝臟病理組織學分期中是否具有準確的預測價值目前仍存在爭議［6］。這些指標對PBC肝纖維化或肝硬化的診斷性能仍值得深入探討?？筭p210和抗sp100是PBC特異性ANA。盡管之前的研究報道了抗gp210在PBC患者中的診斷和預后價值［18－19］，但其作為肝臟組織學分期生物標志物的作用仍有待證明。

因此，在這項雙中心回顧性研究中，我們評估了一些無創(chuàng)診斷指標（如AAR、APRI、FIB-4和LOK指數）聯合或不聯合抗gp210用于評估初治PBC患者肝纖維化的診斷效能。此外，我們在抗gp210陽性PBC患者中探索了這些無創(chuàng)標志物與肝臟組織學分期之間的關系，試圖驗證一種簡單、可靠、無創(chuàng)的方法用于評估PBC肝纖維化程度。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集解放軍第九六〇醫(yī)院消化內科（中國濟南）和空軍軍醫(yī)大學西京消化病醫(yī)院（中國西安）2005年12月至2020年12月初診未經治療的PBC患者208例，并均經肝穿刺活檢確診。其中，男性43例，女性165例，平均年齡為（52.35±8.64）歲，194例（93.3%）AMA陽性，抗gp210陽性患者91例（43.8%），抗sp100陽性患者24例（11.5%）。根據Scheuer分期將患者分為四組：其中Ⅰ期24人，Ⅱ期102人，Ⅲ期57人，Ⅳ期25人。

該研究是根據赫爾辛基宣言進行的回顧性研究，肝活檢獲得每位患者的書面知情同意，研究方案獲得解放軍第九六〇醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 患者納入與排除標準

根據EASL指南和美國肝病研究協會制定的PBC診斷標準［1，3］納入患者，即需符合以下任意2項：①堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）或γ-谷氨酰轉移酶（gammaglutaryl-transferase，GGT）升高超過6個月；②血清AMA和／或M2亞型陽性；③組織病理學顯示小葉間膽管損傷，符合非化膿性膽管炎。排除標準：①合并病毒性肝炎、人類免疫缺陷病毒感染等感染性疾??；②其他肝病如酒精性／非酒精性肝病、Wilson′s病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）／原發(fā)性硬化性膽管 炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）重疊綜合征患者，以及表現出高轉氨酶和免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G水平等特征的提示AIH／PBC重疊綜合征的患者；③炎癥性腸病或乳糜瀉等其他慢性疾??；④肝臟或肝外惡性腫瘤。

1.3 肝穿刺活檢和組織學評估

肝穿刺活檢在局部麻醉下由彩色多普勒超聲引導進行。肝臟樣品經福爾馬林固定和石蠟包埋用于組織學分析。常規(guī)蘇木精-伊紅染色用于評估肝臟炎癥和纖維化分期?；顧z標本由兩名經驗豐富的病理學專家進行評估，他們對彼此的診斷和患者的臨床信息均不知情。組織學特征評估包括膽管損傷、膽管減少、淋巴細胞聚集、肉芽腫形成和膽汁淤積，并評估界面性肝炎以排除PBC／AIH重疊綜合征。參照Scheuer分期標準：Ⅰ期，膽管炎期，炎癥局限于匯管區(qū)；Ⅱ期，小膽管增生期，損傷涉及周圍實質，膽管減少出現代償反應；Ⅲ期，瘢痕期，伴有橋接纖維化；Ⅳ期，肝硬化期，明顯肝硬化伴再生結節(jié)。

1.4 患者臨床特征和血清學指標

所有患者在肝活檢前均進行常規(guī)臨床檢驗檢查，并在活檢前不超過3d采集血樣。利用Hep-2細胞和大鼠組織切片的間接免疫熒光檢測血清AMA。通過免疫印跡分析（EUROIMMUN 檢測試劑盒；EUROIMMUN，Medizinische Labordiagnostika AG）檢測抗－gp210和抗－sp100。通過免疫比濁法評估血清免疫球蛋白水平。

從病歷信息系統(tǒng)中提取患者基線時的人口統(tǒng)計學和臨床特征資料，包括年齡、性別、癥狀、生物化學指標、免疫學指標等，包括自身免疫性抗體、IgG、IgM、白細胞（white blood cell，WBC）、中性粒細胞（neutrophil，NEU）、紅細胞（red blood cell，RBC）、平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）、總膽汁酸（total biliary acid，TBA）、總膽固醇（cholesterol，CHO）、甘油三酯（triglyceride，TG）、球蛋白（globulin，GLB）、白蛋白（albumin，ALB）、丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、ALP、GGT、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）和國際標準化比值（international normalized ratio，INR）等。

1.5 無創(chuàng)診斷模型計算公式

根據文獻［11，13，15－16］中公式計算無創(chuàng)血清學診斷指標，包括AAR、APRI、FIB-4和LOK：AAR ＝AST／ALT；APRI＝［（AST／ULN）×100］／PLT（其中ULN是AST的正常值上限）；FIB-4＝（年齡×AST）／（PLT×ALT1／2）；LOK＝－5.56－0.0089×PLT＋1.26×AST／ALT＋5.27×INR。

1.6 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 21.0（IBM，Armonk，NY，USA）軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，呈偏態(tài)分布的計量以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。單因素和多因素邏輯回歸分析確定與肝纖維化相關的變量，候選變量包括與纖維化嚴重程度相關的參數以及之前研究中報告的參數。在單因素分析中具有顯著差異（P＜0.05）的變量納入多元邏輯回歸模型中。

通過計算受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積來評估診斷效能，根據Youden指數計算識別肝纖維化的最佳截斷值，計算敏感度、特異度、陽性和陰性預測值以及似然比，計算診斷的準確性。

2 結果

2.1 不同肝臟組織病理學分期患者臨床特征比較

我們將患者分為兩組：早期纖維化（ScheuerⅠ和Ⅱ期）和進展期纖維化（ScheuerⅢ和Ⅳ期）。在208名PBC患者中，126名（60.58%）患者被定義為早期纖維化，其余82名（39.42%）患者被定義為進展期纖維化。不同肝臟組織病理學分期的PBC患者臨床特征見表1。女性分別占早期和進展期患者的78.6%和80.5%，沒有觀察到顯著的組間差異（P＞0.05）。早期和進展期患者的平均年齡分別為（51.40±8.97）歲和（53.76±8.00）歲，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。血清HGB、MCV、ALT、AST、TP、GLB、ALP、GGT、TBA、CHO、TG、BUN、CRE、FIB、TT、IgM、IgG、AMA、ANA、抗sp100抗體均無明顯組間差異（P＞0.05）。與早期患者相比，進展期患者的WBC、NEU、RBC、PLT和ALB顯著降低（P＜0.05），TBIL、APTT、INR水平顯著升高（P＜0.05）。進展期患者中49例（59.8%）抗gp210陽性，早期患者中42例（33.3%）抗gp210陽性（P＜0.01）。與早期患者相比，進展期患者表現出顯著更高的AAR（P＝0.000）、APRI（P＝0.000）和FIB-4（P＝0.000）水平（表1）。

表1 早期和進展期PBC患者的臨床特征及單因素分析

續(xù)表1

2.2 PBC患者肝纖維化分期相關變量的Logistic回歸分析

單因素分析顯示，WBC、RBC、PLT、ALB、TBIL、APTT、INR和抗gp210是PBC患者出現進展期肝纖維化的可能危險因素。結合文獻報道，將可能影響PBC患者肝纖維化進展的因素進一步納入多因素回歸分析，以PBC患者肝纖維化分期為因變量，賦值如下：早期＝0，進展期＝1，以WBC、RBC、PLT、ALB、TBIL、APTT、INR和抗gp210為自變量，其中自變量賦值如下：抗gp210（－）＝0，抗gp210（＋）＝1。結果顯示，PLT水平降低、APTT延長和抗gp210陽性表達是PBC患者肝纖維化進展的獨立危險因素（表2）。

表2 PBC患者肝纖維化進展的多因素Logistic回歸分析

2.3 AAR、APRI、FIB-4、LOK聯合或不聯合抗gp210對PBC患者進展期肝纖維化的診斷效能對比

ROC曲線分析顯示，AAR、APRI、FIB-4和LOK預測診斷PBC進展期肝纖維化的AUC均＜70%（圖1A和表3）；而AAR、APRI、FIB-4和LOK聯合抗gp210預測診斷晚期肝纖維化的AUC分別為0.798（95% CI：0.735－0.860）、0.816（95% CI：0.758－0.875）、0.834（95% CI：0.779－0.888）和0.778（95% CI：0.713－0.844）（圖1B和表3）。

圖1 AAR、APRI、FIB-4、LOK聯合或不聯合抗gp210預測診斷PBC患者進展期肝纖維化的ROC曲線 A：AAR、APRI、FIB-4、LOK單獨診斷效能；B：AAR、APRI、FIB-4、LOK聯合抗gp210的診斷效能

2.4 AAR、APRI、FIB-4和LOK對抗gp-210陽性PBC患者進展期肝纖維化的診斷效能

在抗gp-210陽性患者中，AAR、APRI、FIB-4和LOK值在肝纖維化進展期顯著升高（AAR：P＝0.001；APRI：P＝0.000；FIB-4：P＝0.000；LOK：P＝0.016；表3和圖2）。AAR、APRI、FIB-4和LOK預測診斷抗gp-210陽性PBC患者進展期肝纖維化的AUC分別為0.748（95% CI：0.633－0.863）、0.812（95% CI：0.709－0.915）、0.874（95% CI：0.798－0.951）和0.674（95%CI：0.548－0.799）（圖3和表3）。APRI和FIB-4在預測抗gp210陽性PBC患者進展期肝纖維化的準確性較好。然而，AAR、APRI、FIB-4和LOK用于預測抗gp-210陰性患者進展期肝纖維化的AUC均＜70%（表3）。

圖2 抗gp210陽性PBC患者不同病理學分期AAR、APRI、FIB-4和LOK的箱式圖

圖3 AAR、APRI、FIB-4、LOK診斷抗gp210陽性PBC患者進展期肝纖維化的ROC曲線

表3 AAR、APRI、FIB-4、LOK聯合或不聯合抗gp210對PBC患者進展期肝纖維化的診斷效能

在本研究中，抗gp210陽性PBC患者有91例，其中早期肝纖維化42例，進展期肝纖維化49例。分別選擇兩個臨界值（使其特異性達到約95%）以確定早期肝纖維化或進展期肝纖維化。對于AAR、APRI和FIB-4，分別應用較低的臨界值（≤0.760、0.734、1.484），此時的敏感性分別為36.4%、31.8%、40.9%，分別有88.3%、90.9%和89.5%的患者被準確診斷為早期肝纖維化；同樣，分別應用AAR、APRI和FIB-4較高的臨界值（≥1.324、1.999、3.295），其敏感性分別為36.5%、36.5%、60.3%，分別有89.0%、89.0%、93.1%的患者被準確診斷為進展期肝纖維化（表4）。

表4 AAR、APRI、FIB-4對抗gp-210陽性PBC患者進展期肝纖維的化的診斷效能

3 討論

在這項雙中心回顧性研究中，我們分析了抗gp210和無創(chuàng)診斷標志對PBC患者肝纖維化分期的診斷價值。當與抗gp210聯合診斷時，AAR、APRI和FIB-4具有更好的診斷效能。在抗gp210陽性PBC患者中，APRI和FIB-4在預測肝纖維化分期方面表現出較高的特異性和敏感性。

與Yang等［20］研究一致，我們的研究隊列中抗gp210陽性率（43.8%）與日本（26.1%）［21］和西方國家（16%）［22］之前報告的陽性率相比相對較高，其中一個導致患者異質性的原因可能是就診于三級中心的患者往往病情更為嚴重［20］。因此，我們可以在一個具有更多抗gp210陽性PBC患者的相對較大的隊列中全面探討抗gp210的作用。在以前的研究中，抗gp210被認為是PBC肝功能嚴重受損和長期預后更差的預測指標［20－22］。我們的研究證實了抗gp210在預測PBC進展期肝纖維化中的作用。另外，抗gp210也可作為評估PBC治療反應和長期預后的有價值的標志物。

開發(fā)替代肝活檢的無創(chuàng)診斷標志物具有非常重要的意義。近年來，有橫斷面研究驗證了增強型肝纖維化評分（enhanced liver fibrosis，ELF）［23］和瞬時彈性成像（transient elastography，TE）［24］測量肝臟硬度預測肝纖維化程度的準確性。然而，這些方法的系統(tǒng)評估和最佳應用范圍目前仍是一個需要驗證的問題［1－2］。已報道的幾種無創(chuàng)標志物，如紫藤凝集素陽性mac-2結合蛋白（wisteria floribunda agglutininpositive mac-2 binding protein，WFA-M2BP）［14］、富含亮氨酸的α2糖蛋白（leucine-rich alpha 2 glycoprotein，LRG）［25］、和嗜酸性粒細胞強效趨化因子（potent chemokines for eosinophils）［26］，也可作為預測肝纖維化的手段。然而，這些指標的測量缺乏標準化，并非所有實驗室都可以檢測。

由于AST、PLT、GGT和CHO在大多數醫(yī)院和實驗室中都是常規(guī)檢測項目，因此它們的測量結果可靠且足夠準確。許多模型（不同的標準）如AAR、APRI、FIB-4、LOK、Forns指數和FibroIndex被證明可以預測病毒性肝炎肝硬化的程度。由于本研究中不同Scheuer分期之間的血清GGT和CHO水平沒有顯著差異，因此我們沒有測試Forns指數和FibroIndex的預測價值。實際上，在我們的隊列中，單獨使用這些無創(chuàng)標志物預測PBC肝纖維化階段的敏感性和特異性效能較低，這與先前的研究一致［6，14，26］。然而，當與抗gp210聯合診斷，或用于抗gp210陽性PBC亞組的診斷時，它們顯示出更高的診斷效能，尤其是FIB-4，顯示出較高的特異性和敏感性。在基線特征方面，抗gp210陽性組具有較高的膽紅素水平，這在一定程度上提示抗gp210可能與PBC患者膽汁淤積狀態(tài)相關，而不是與門靜脈高壓狀態(tài)（包括較低的白蛋白水平和較低的血小板計數）相關。因此，抗gp210陽性與AAR、APRI、FIB-4和LOK作為診斷標準之間沒有重疊效應。

當然，我們應該注意到這項研究有幾個局限性。主要限制是這項研究的回顧性和雙中心性質，仍需要在不同的隊列中進一步驗證。第二個限制是，除了PLT、ALP和抗gp-210外，我們沒有研究與肝臟病理組織學分期相關的其他指標；在抗gp210陰性患者中仍需要進一步評估。此外，我們中心的另一項研究報道，維生素D水平與PBC患者的疾病嚴重程度和對UDCA的治療應答相關［27］。基線水平維生素D的缺乏可能會增加患者對UDCA不完全應答的風險。因此，其他指標如維生素D，與肝臟組織學分期的相關性需要進一步確認。第三，抗gp210和間接血清標志物在預后中的作用需要在未來進一步驗證。

綜上所述，這項研究探討了非侵入性標志物和抗gp210對PBC肝臟纖維化嚴重程度的預測價值。AAR、APRI和FIB-4與抗gp210聯合，對評估PBC肝纖維化嚴重程度具有較高診斷效能。由于其在抗gp210陽性患者中的高診斷敏感性和特異性性，FIB-4可作為預測PBC肝纖維化嚴重程度的有價值的補充診斷手段。此外，由于FIB-4公式中的參數通過常規(guī)實驗室檢測很容易獲得，因此可作為基層醫(yī)療機構確定初診PBC患者纖維化階段的替代標志物。