基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討中醫(yī)藥治療急性胰腺炎的用藥規(guī)律及潛在機(jī)制*

李 軍，王 淼，王 林，左俊嶺，朱章志△

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是消化系統(tǒng)常見的危急重癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球急性胰腺炎的發(fā)病率為33.74例/（10萬人·年）（95%CI 23.33-48.81），死亡率為1.60例/（10萬人·年）（95%CI 0.85-1.58）[1]，并且有21%的患者在第一次急性胰腺炎發(fā)作后會發(fā)展為復(fù)發(fā)性急性胰腺炎[2]。急性胰腺炎是胰酶在胰管內(nèi)被激活引起胰腺的局部或全身炎癥，治療上多予禁食、抑酶、液體復(fù)蘇、維持器官功能及抗感染等[3]。

中醫(yī)并無急性胰腺炎的病名，根據(jù)其發(fā)病特點(diǎn)，可歸屬于“脾心痛”“腹痛”“胃心痛”等范疇。近年來，中醫(yī)在急性胰腺炎的治療上積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，先后發(fā)布了《急性胰腺炎中醫(yī)診療專家共識意見（2017）》《消化系統(tǒng)常見病急性胰腺炎中醫(yī)診療指南（基層醫(yī)生版）》。指南共識指出“腑氣不通”是急性胰腺炎的基本病機(jī)，而重癥急性胰腺炎的關(guān)鍵病機(jī)是“瘀毒內(nèi)蘊(yùn)”，并提出“通里攻下”是急性胰腺炎的治療原則。根據(jù)證型的不同，臨床可選用大柴胡湯、大承氣湯、小承氣湯、大黃牡丹湯、柴胡疏肝散等治療[4-5]。

結(jié)合嶺南地區(qū)的氣候特點(diǎn)、人群體質(zhì)特征，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院在臨床運(yùn)用中醫(yī)藥治療急性胰腺炎方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 中藥處方的收集 收集2020年1月1日至2020年12月31日在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院且第一診斷為“急性胰腺炎”的患者中藥處方。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①患者出院的第一診斷為急性胰腺炎，符合急性胰腺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)：a.急性、突發(fā)、持續(xù)、劇烈的上腹部疼痛，可向背部放射；b.血清淀粉酶和/或脂肪酶活性至少高于正常上限值3倍；c.增強(qiáng)CT/MRI呈AP典型影像學(xué)改變（胰腺水腫或胰周滲出積液）。臨床上符合上述3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中的2項(xiàng)，即可診斷為AP[3]；②住院期間接受中藥湯劑治療，具有完整的中藥處方；③年齡≥18周歲。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①患者住院期間合并有其他急性或嚴(yán)重循環(huán)、呼吸、神經(jīng)、免疫等系統(tǒng)疾病，如：急性心力衰竭、急性心肌梗死、急性腦血管意外、惡性腫瘤等；②急性胰腺炎患者接受外科手術(shù)治療者；③妊娠或哺乳期女性患者。

1.2 運(yùn)用古今醫(yī)案云平臺分析 將中藥處方進(jìn)行篩選并錄入Microsoft Excel 2016，并建立處方表格數(shù)據(jù)庫。根據(jù)《中華人民共和國藥典2020版》將中藥名稱標(biāo)準(zhǔn)化，如麩炒白術(shù)統(tǒng)一為白術(shù)，北柴胡統(tǒng)一為柴胡。再將處方數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入古今醫(yī)案云平臺（http：//www.yiankb.com），由兩名研究者進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，其中一名負(fù)責(zé)將處方錄入古今醫(yī)案云平臺，另一名研究者對錄入信息進(jìn)行校正。最后利用古今醫(yī)案云平臺進(jìn)行用藥頻次統(tǒng)計(jì)、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析及聚類分析。

1.3 藥對化學(xué)成分及靶點(diǎn)檢索 通過TCSMP數(shù)據(jù)庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php/）獲取核心藥對的活性成分及靶點(diǎn)信息[6]。使用 Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將藥物的靶點(diǎn)名稱進(jìn)行矯正統(tǒng)一[7]。

1.4 急性胰腺炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)檢索 以“Acute pancreatitis”為關(guān)鍵詞檢索以下數(shù)據(jù)庫：OMIM（https：//omim.org/）、Drugbank（https：//go.drugbank.com/）、Gene Card（https：//www.genecards.org/），得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)[8-10]，將所有靶點(diǎn)合并，剔除重復(fù)項(xiàng)。

1.5 交集靶點(diǎn)獲取及藥對-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Venn在線平臺（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）獲取藥對與疾病交集靶點(diǎn)[11]，運(yùn)用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建藥對-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），選擇物種為Homo sapiens，minimum required interaction score ＞0.7，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并保存結(jié)果[12]。將結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，并通過Degree值獲取網(wǎng)絡(luò)中排名靠前的核心基因。

1.7 GO及KEGG通路富集分析 通過 David（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）數(shù)據(jù)庫對于藥對-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG功能通路富集[13]，并對富集結(jié)果進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 中藥處方及藥物頻次 經(jīng)過檢索共獲取中藥處方238首，共涉及中藥164味，總頻次為2 946次，其中柴胡出現(xiàn)的頻次最高，為186次，其次為黃芩167次、法半夏161次，頻次＞50次的藥物有16味。見表1。

表1 高頻藥物頻數(shù)表（頻數(shù)＞50）

2.2 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析及核心藥對獲取 使用古今醫(yī)案云平臺中的關(guān)聯(lián)規(guī)則算法進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)定支持度>0.4，置信度>0.5，最大前項(xiàng)數(shù)為2。得出治療急性胰腺炎藥對組合的關(guān)聯(lián)規(guī)則，見表2。其中，置信度最高的且關(guān)聯(lián)性強(qiáng)的藥對是大黃-黃芩-柴胡，置信度為 97.58%，支持度為 50.84%，是我院臨床治療急性胰腺炎的核心藥對。

表2 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果

2.3 聚類分析 將頻次＞60的15味中藥進(jìn)行歐式、最長距離聚類分析，以橫向聚類圖展示，見圖1。結(jié)果表明，根據(jù)歐式距離11可將高頻藥物分為5類。第1類：厚樸、丹參、赤芍；第2類：茯苓、白術(shù)、甘草、枳殼；第3類：延胡索；第4類：法半夏、枳實(shí)、生姜；第5類：白芍、大黃、柴胡、黃芩。

圖1 藥物聚類分析樹狀圖

2.4 柴胡-黃芩-大黃活性成分及靶點(diǎn)篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18，篩選得到柴胡活性成分12種，對應(yīng)靶點(diǎn)157個(gè)，黃芩活性成分32種，對應(yīng)靶點(diǎn)90個(gè)，大黃活性成分7種，對應(yīng)靶點(diǎn)49個(gè)，刪除重復(fù)成分及靶點(diǎn)后共得到49種活性成分和185個(gè)靶點(diǎn)。

2.5 急性胰腺炎相關(guān)靶點(diǎn) 以“Acute pancreatitis”為關(guān)鍵詞分別檢索 OMIM、GeneCards（取 score＞15）、DrugBank數(shù)據(jù)庫，去除重復(fù)后共得到576個(gè)急性胰腺炎相關(guān)基因。

2.6 交集靶點(diǎn)獲取及藥對-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將藥對柴胡-黃芩-大黃與急性胰腺炎的靶點(diǎn)分別輸入Venn在線平臺，共獲得交集靶點(diǎn)71個(gè)，對應(yīng)柴胡活性成分11種；大黃活性成分6種；黃芩活性成分29種，去除重復(fù)后剩余44種活性成分。利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建藥對-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。

圖2 藥對-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，獲取核心靶點(diǎn) 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲取蛋白相互作用關(guān)系，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI圖（見圖3）。圖中方形節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，連線表示靶點(diǎn)之間相關(guān)聯(lián)，共有71個(gè)節(jié)點(diǎn)，254條連線。根據(jù)Degree值對PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)進(jìn)行排序，得到排名前 10 的核心基因?yàn)椋篈KT1、TNF、TP53、IL-6、JUN、MAPK1、MAPK8、VEGFA、EGF、MMP9。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）及核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.8 GO及KEGG功能通路富集分析 將71個(gè)交集靶點(diǎn)輸入David數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO及KEGG功能通路富集分析。GO通路富集分析包括biological process（BP，生物過程）、cellular component（CC，細(xì)胞組分）和molecular function（MF，分子功能）3個(gè)生物學(xué)過程。設(shè)置P<0.05，對排名前15個(gè)通路進(jìn)行可視化處理。生物過程主要涉及凋亡過程的負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process，23個(gè)靶點(diǎn)），RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter，27 個(gè)靶點(diǎn)），對藥物的反應(yīng)（response to drug，17個(gè)靶點(diǎn)）等，見圖4；細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞外間隙（extracellular space，29個(gè)靶點(diǎn)），細(xì)胞外組分（extracellular region，24個(gè)靶點(diǎn)），細(xì)胞漿（cytosol，32個(gè)靶點(diǎn)）等，見圖 5；分子功能主要涉及相同蛋白質(zhì)結(jié)合（identical protein binding，25個(gè)靶點(diǎn)），酶結(jié)合（enzyme binding，17個(gè)靶點(diǎn)），蛋白質(zhì)異二聚活性（protein heterodimerization activity，18個(gè)靶點(diǎn)）等，見圖 6。

圖4 BP富集分析結(jié)果圖

圖5 CC富集分析結(jié)果圖

圖6 MF富集分析結(jié)果圖

KEGG富集通路結(jié)果根據(jù)其Count值得出排名前15的通路（圖7）。主要涉及PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway，23個(gè)靶點(diǎn)）；腫瘤壞死因子信號通路（hsa04668：TNF signaling pathway，19個(gè)靶點(diǎn)）；絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路（hsa04010：MAPK signaling pathway，18個(gè)靶點(diǎn)）等。

圖7 KEGG富集分析結(jié)果圖

3 討論

中醫(yī)古籍并無急性胰腺炎的治療記載，根據(jù)臨床觀察、辨證論治，認(rèn)為急性胰腺炎的基礎(chǔ)病機(jī)是腑氣不通，緣于食積、氣滯、酒毒、血瘀等病理因素導(dǎo)致機(jī)體氣機(jī)不暢，脾胃運(yùn)化失司，痰濕內(nèi)蘊(yùn)，郁久化熱，久則血瘀、濁毒漸生，有形邪實(shí)阻滯中焦，從而導(dǎo)致“腑氣不通，不通則痛”[4-5]。《內(nèi)經(jīng)》云：“熱氣留于小腸，腸中痛，癉熱焦渴，則堅(jiān)干不得出，故痛而閉不通矣”[14]，指出了氣滯郁熱導(dǎo)致腹痛的病因病機(jī)。本文通過對2020年在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院患者的處方進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，得出臨床上治療急性胰腺炎的高頻藥物是柴胡、黃芩、法半夏等，并根據(jù)關(guān)聯(lián)規(guī)則分析得出支持度與置信度最高的核心藥對為柴胡-黃芩-大黃。柴胡味辛、苦，歸肝、膽經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載柴胡“主心腹，去腸胃中結(jié)氣，飲食積聚，寒熱邪氣，推陳致新”[15]。柴胡不僅可以疏肝解郁，也可疏解胃腸氣滯，通腹泄?jié)帷，F(xiàn)代藥理研究表明，柴胡具有促進(jìn)胰酶分泌的功能，可減輕因胰酶分泌受阻導(dǎo)致的胰腺自我消化[16]。柴胡的主要成分柴胡皂苷可以促進(jìn)內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的分泌，減輕全身炎癥反應(yīng)[17]。黃芩味苦性寒，《別錄》中記載：“（黃芩）療痰熱胃中熱，小腹絞痛，消谷，利小腸”[18]。黃芩入膽經(jīng)可清少陽邪熱；入脾、大腸經(jīng)則燥腸胃濕熱，通利腸腑，為清熱瀉火、燥濕解毒之要。大黃別名將軍，味苦性寒，《本經(jīng)》曰：“（大黃）破癥瘕積聚，留飲宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷”[15]。臨床上，大黃是治療實(shí)熱便秘、積滯腹痛、瀉痢不爽、濕熱黃疸的常用藥。柴胡-黃芩-大黃三藥配伍，有行氣通腹，清熱解毒之功，在急性胰腺炎的治療上發(fā)揮著相輔相成的作用。最后，聚類分析將高頻藥物分為5類，其中第5類（白芍、大黃、柴胡、黃芩）包含核心藥對，從另一方面驗(yàn)證了柴胡-黃芩-大黃藥對在治療急性胰腺炎中的關(guān)鍵作用。

急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制是胰腺內(nèi)的消化酶被激活，引起胰實(shí)質(zhì)及胰周組織的自我消化，又進(jìn)一步促使各種有害物質(zhì)釋放，從而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），造成呼吸、循環(huán)、內(nèi)分泌等多系統(tǒng)損害[19]。本研究通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到柴胡-黃芩-大黃藥對的活性成分，包括黃芩苷（Baicalin，MOL002776）、大黃素（Emodin，MOL002288）等成分?，F(xiàn)代藥理研究大黃素能夠通過抑制P2X7/NLRP3通路顯著減輕胰腺組織和腺泡細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷，并能顯著下調(diào)血漿淀粉酶和脂肪酶水平以及胰腺組織MPO活性[20]。大黃素能抑制重癥胰腺炎大鼠中性粒細(xì)胞的遲發(fā)性凋亡，防止全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生[21]。另一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，大黃素與黃芩苷連用可以通過上調(diào)或下調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)，減少體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，對AP模型大鼠有益[22]。根據(jù)Degree值得出核心靶點(diǎn)包括 AKT1、TNF、IL-6、MAPK1、MAPK8 等。IL-6（白介素-6）、TNF（腫瘤壞死因子）是體內(nèi)重要的炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控，在局部炎癥反應(yīng)及全身炎癥反應(yīng)中都有很高的表達(dá)。一項(xiàng)研究表明，在急性胰腺炎早期，IL-6的值可以用來預(yù)測重癥胰腺炎，臨界值為196.6 pg/mL（敏感性81.9%，特異性91.3%）[23]。此外，大黃能顯著增加胰腺組織的血流灌注，逆轉(zhuǎn)線粒體損傷，促進(jìn)胰腺腺泡和星狀細(xì)胞增殖，大黃酸通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路和抑制AMPK活性，在胰腺組織中有較高的分布，對AR42J細(xì)胞線粒體有保護(hù)作用[24]。GO富集結(jié)果表明，柴胡-黃芩-大黃藥對治療AP主要與負(fù)調(diào)控凋亡過程、正調(diào)控RNA聚合酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄及藥物反應(yīng)有關(guān)，這些靶點(diǎn)存在于細(xì)胞外間隙、組分及細(xì)胞漿，通過干預(yù)蛋白質(zhì)的結(jié)合、酶的結(jié)合等分子活動(dòng)。KEGG結(jié)果表明，PI3KAkt、TNF、MAPK等信號通路是柴胡-黃芩-大黃藥對干預(yù)AP的主要通路。IL-17等促炎因子能夠快速磷酸化MAPK激活 NF-κB進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，可加重全身炎癥的反應(yīng)[25]，而抑制MAPK/NF-κB通路則對重癥胰腺炎大鼠的急性肺損傷具有保護(hù)作用[26]。此外，上調(diào)胰腺炎模型大鼠胰腺組織中PI3K和p-Akt的表達(dá)，可以減少胰腺細(xì)胞凋亡[27]。

中醫(yī)治療急性胰腺炎在臨床上取得了一定的療效和認(rèn)可，中藥內(nèi)服、外敷以及灌腸治療應(yīng)用普遍。本文通過數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)淺談中醫(yī)藥治療急性胰腺炎的理論基礎(chǔ)與潛在機(jī)制，提出了柴胡-黃芩-大黃藥對通過多靶點(diǎn)、多通路治療急性胰腺炎的機(jī)制。但數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法還有不足，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)及臨床驗(yàn)證。