利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)檢測(cè)基質(zhì)剛度對(duì)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)的調(diào)控*

周穎，鄧林紅，歐陽(yáng)明星，徐華棟

(常州大學(xué)藥學(xué)院&醫(yī)學(xué)院(籌)，生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院，常州 213164)

1 引 言

生物體內(nèi)的細(xì)胞處在一種復(fù)雜的力學(xué)微環(huán)境中。在胚胎發(fā)育并分化成不同組織的過程中，細(xì)胞周圍的基質(zhì)剛度會(huì)發(fā)生變化，例如腦組織的剛度為103Pa，而骨組織的剛度達(dá)107Pa[1]。當(dāng)組織發(fā)生病變時(shí)，其細(xì)胞的剛度及周圍基質(zhì)剛度也隨之變化，例如，癌變的細(xì)胞相比普通細(xì)胞會(huì)更軟一些[2]，而由于細(xì)胞增殖和基質(zhì)沉淀，癌變處的局部組織會(huì)變得較硬[3]；肝臟病變時(shí)出現(xiàn)肝硬化的現(xiàn)象[4]；體內(nèi)膽固醇水平升高時(shí)，紅細(xì)胞硬化的程度也會(huì)隨之增加[5]。

細(xì)胞周圍基質(zhì)剛度的變化同樣也會(huì)影響細(xì)胞生化信號(hào)和細(xì)胞遷移、生長(zhǎng)、分化等生理活性[6-9]。在針對(duì)癌細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)通過提高細(xì)胞周圍基質(zhì)剛度可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜上整合素表達(dá)升高，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[10]。有研究表明，將干細(xì)胞培養(yǎng)于不同基質(zhì)剛度上，其分化成不同的細(xì)胞，且分化的細(xì)胞與基質(zhì)剛度接近，如當(dāng)基質(zhì)剛度接近于體神經(jīng)組織(<1 kPa)時(shí)，干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化；當(dāng)基質(zhì)剛度接近于肌肉組織剛度(8～17 kPa)時(shí)，干細(xì)胞向肌肉細(xì)胞分化；在給予較硬的基質(zhì)(25～100 kPa)時(shí)，干細(xì)胞則向成骨細(xì)胞分化[11]。力學(xué)微環(huán)境的改變還能調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，較軟的基質(zhì)可以促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪、軟骨細(xì)胞分化，較硬的基質(zhì)則使其向肌肉細(xì)胞分化[12]。在這些研究中，生物力學(xué)因素起了關(guān)鍵的作用。

基質(zhì)剛度的改變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部一些信號(hào)的激活。細(xì)胞外蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)是促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要成員，其信號(hào)傳遞途徑涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、發(fā)育等信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，與細(xì)胞增殖息息相關(guān)[13-14]。研究表明ERK信號(hào)調(diào)節(jié)哮喘條件下的氣道炎癥反應(yīng)和平滑肌增生[15-17]。有研究報(bào)道環(huán)境剛度的變化也影響細(xì)胞中的ERK信號(hào)，剛度增加會(huì)上調(diào)ERK活性[18-20]，而其力-化學(xué)偶聯(lián)機(jī)制仍有待探索。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)是指兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)距離足夠近(接近納米級(jí)別)并且供體熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜與受體熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜有一定重疊的條件下，激發(fā)供體基團(tuán)時(shí)會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移到受體基團(tuán)的現(xiàn)象[21-22]。本研究利用FRET技術(shù)，通過ERKFRET探針實(shí)時(shí)觀察并十分靈敏地記錄大鼠氣道平滑肌中ERK活性的變化[23]，探究基質(zhì)剛度的力學(xué)微環(huán)境對(duì)細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)的影響。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1細(xì)胞種類與來源 大鼠氣道平滑肌(ASM細(xì)胞)來源于6～8周的雌性Sprague Dawley大鼠，采用機(jī)械分散法與酶消化分離取得原代細(xì)胞，通過反復(fù)貼壁法提純ASM細(xì)胞，免疫熒光法結(jié)合相差顯微鏡的形態(tài)學(xué)觀察法進(jìn)行鑒定[24]。

2.1.2主要試劑和儀器 DMEM低糖培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶、細(xì)胞貼壁消化試劑Accutase細(xì)胞消化液、轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 3000、血小板生長(zhǎng)因子均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific；纖連蛋白購(gòu)自Corning；ERK抑制劑PD98059購(gòu)自MCE；3—氨丙基三甲氧基硅烷、戊二醛購(gòu)自阿拉??；丙烯酰胺、甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、N,N,N',N'—四甲基二乙胺購(gòu)自塞爾斯；磺基琥珀酰亞胺 6—(4'—疊氮基—2'—硝基苯氨基)己酸酯購(gòu)自Abcam；激光共聚焦培養(yǎng)皿(14 mm)購(gòu)自NEST公司；FRET顯微鏡平臺(tái)和倒置顯微鏡Primo Vert 購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司。

2.2 方法

2.2.1ERK探針和Paxillin-dsRed的質(zhì)粒DNA擴(kuò)增 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)菌DH5α中，菌液涂在含氨芐青霉素(Amp)抗性的LB固體瓊脂平板上，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，挑出單克隆菌落置于含100 μg/mL Amp的LB液體中，于37℃搖菌擴(kuò)增。使用中提試劑盒(德國(guó)QIAGEN)提取和純化質(zhì)粒，用NanoDrop(瑞士TECAN)測(cè)定DNA濃度后，質(zhì)?？捎糜诩?xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2.2.2不同剛度聚丙烯酰胺凝膠的制備 在共聚焦皿中制備不同剛度聚丙烯酰胺凝膠的主要步驟如下[25-26]：

(1)共聚焦皿活化加入1 mL 0.1M NaOH溶液，放置5 min后吸除并風(fēng)干；在皿中的玻璃底上加入200 μL 3—氨丙基三甲氧基硅烷，靜置4～5 min后吸除，用三蒸水清洗3次；然后加入400 μL 0.5%戊二醛，避光放置30 min后吸除，用三蒸水清洗3次并倒扣過夜晾干。

(2)聚丙烯酰胺凝膠制備根據(jù)下表的成份比例配置不同剛度的凝膠溶液(見表1)，即形成的凝膠楊氏模量(Young＇s modulus)分別為2.5、9.0、21.5 kPa，然后分別加入3 μL 10%過硫酸銨(APS)和2 μL(四甲基乙二胺TEMED)，立刻在每個(gè)皿中的玻璃上加入2.9 μL凝膠溶液，覆蓋上用乙醇洗干凈的蓋玻片(14 mm)，室溫下避光放置30～60 min。移除蓋玻片，三蒸水清洗后，加入PBS溶液，可在4℃冰箱短暫保持。

表1 不同剛度凝膠溶液的配置比例

(3)結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)制備好的聚丙烯酰胺凝膠上覆蓋150 μL Sulfo-SANPAH活化溶液(0.2 mg/mL)，在紫外燈下(相距小于20 cm)照射10～20 min，更換Sulfo-SANPAH溶液后重復(fù)一次，然后用PBS緩沖液洗滌3次，再加入150 μL 纖維連接蛋白 (Fn, 100 μg/mL)溶液，于37 ℃孵育4 h。PBS洗滌1次，加入PBS后存放于4 ℃，使用前不超過2個(gè)星期。

(4)種植細(xì)胞凝膠樣本在紫外燈下消毒10 min，吸掉PBS后加入0.5 mL DMEM培養(yǎng)基(1% FBS，無抗生素)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中平衡10 min，然后加入含細(xì)胞的培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁后的密度達(dá)60%左右。

2.2.3ASM細(xì)胞培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染FRET探針 ASM細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基中，放置于含5% CO2、飽和濕度的37℃恒溫培養(yǎng)箱里，實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞一般傳代不超過10次。根據(jù)Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種在六孔板中，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度約60%～80%，每個(gè)孔轉(zhuǎn)染2.5 μg ERK FRET質(zhì)粒DNA；8～12 h后用1×PBS清洗細(xì)胞一次，更換成新鮮培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染開始24 h后，用Accutase消化液消化細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到結(jié)合有Fibronectin的凝膠或玻璃上(共聚焦皿里)，并換成含1% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基；24 h后開始顯微鏡活細(xì)胞成像。

2.2.4FRET顯微鏡成像 在FRET顯微鏡成像系統(tǒng)中，ECFP成像通道的熒光濾片參數(shù)為激發(fā)(436±10) nm，分光455 nm，發(fā)射(480±20) nm；FRET成像通道的熒光濾片參數(shù)為激發(fā)(436±10) nm，分光455 nm，發(fā)射(535±15) nm。FRET成像時(shí)，通過Zeiss軟件系統(tǒng)控制ECFP和FRET成像通道的快速切換，確保同時(shí)采集兩個(gè)通道的圖像數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)拍攝過程中，在10～12 min時(shí)，通過外接導(dǎo)管給細(xì)胞樣品注射加入1 mL含PDGF(終濃度50 ng/mL)的DMEM低糖培養(yǎng)基(1% FBS)。

2.2.5FRET圖像數(shù)據(jù)的定量和統(tǒng)計(jì)分析 通過MATLAB軟件平臺(tái)開發(fā)的FRET圖像分析軟件Fluocell6.0.0(Lu S et al.，美國(guó))來進(jìn)行數(shù)據(jù)定量分析[27]，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±方差”表示。采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Origin8.0和GraphPad Prism6.0進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)之間的差異，P<0.05表示具有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)ERK信號(hào)激活

轉(zhuǎn)染ERK FRET質(zhì)粒的大鼠氣道平滑肌(ASM)細(xì)胞種植在不同剛度的凝膠(2.5、9.0、21.5 kPa)及玻璃上(都包被有100 μg/mL fibronectin)，培養(yǎng)在含1% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基中24 h以上，以降低血清的影響。FRET顯微鏡延時(shí)成像記錄不同剛度凝膠上的ASM細(xì)胞在PDGF(50 ng/mL)刺激前后的ERK FRET探針信號(hào)。通過FluoCell軟件分析得到代表熒光比值(FRET/ECFP)的細(xì)胞彩圖，顏色從藍(lán)到紅顯示ERK激酶活性從低到高的分布或變化。PDGF刺激有效地激活了培養(yǎng)在凝膠和玻璃上的ASM細(xì)胞中ERK活性，而且細(xì)胞群體的ERK活性具有不均一性，見圖1(a)。FRET定量分析曲線顯示，同一組細(xì)胞在PDGF刺激后，ERK活性幾乎同步地發(fā)生不同程度的升高，(培養(yǎng)在2.5、9.0、21.5 kPa凝膠及玻璃上的細(xì)胞統(tǒng)計(jì)數(shù)分別為n=27、20、35、29)見圖1(b)。通過比較各組細(xì)胞中FRET比值的平均曲線趨勢(shì)(平均值±方差)，細(xì)胞培養(yǎng)在硬玻璃上時(shí)比在軟凝膠上具有更高的ERK活性，而細(xì)胞中ERK活性在2.5 kPa凝膠上又低于在9.0 kPa和21.5 kPa凝膠上，見圖1(c)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)PDGF刺激前和刺激后，細(xì)胞中ERK活性在2.5 kPa凝膠上都保持最低，而在玻璃上保持最高，具有統(tǒng)計(jì)上的顯著性差異，見圖1(d)，這些結(jié)果顯示ASM細(xì)胞中的ERK活性與基底剛度有正相關(guān)性。小分子化合物PD98059通過結(jié)合ERK上游信號(hào)激酶MEK(未激活狀態(tài))而抑制ERK的活性[28]，為了證實(shí)所觀察的FRET信號(hào)代表了細(xì)胞中ERK的相對(duì)活性，我們轉(zhuǎn)染ERK FRET探針的兩組細(xì)胞培養(yǎng)在9.0 kPa凝膠上，加入PDGF(50 ng/mL)16 min后，其中一組加入ERK抑制劑PD98059(10 μM)。根據(jù)FRET比值隨時(shí)間變化的曲線(平均值±方差)，加PD98059細(xì)胞組及對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)分別為n=39、45。發(fā)現(xiàn)PDGF刺激后一段時(shí)間再加入抑制劑PD98059，F(xiàn)RET比值曲線立即出現(xiàn)了快速下降，見圖1(e)，表明FRET變化反映了ERK活性。

注：(a)PDGF激活A(yù)SM細(xì)胞中的ERK活性。(b)來源于(a)的同一組細(xì)胞在PDGF刺激(0 min時(shí))前后的ERK FRET比值定量分析。(c)對(duì)(b)中的各細(xì)胞群體曲線進(jìn)行平均值統(tǒng)計(jì)分析(平均值±方差)。(d)分別取-8 min和10 min兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)作t檢驗(yàn)分析比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。(e)ERK FRET探針驗(yàn)證。

3.2 基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)ERK信號(hào)的上游機(jī)制探索

我們初步研究了Src信號(hào)通路和細(xì)胞內(nèi)部的收縮力是否參與調(diào)控基質(zhì)剛度對(duì)ERK活性的影響。PP1是常用的Src激酶抑制劑，Blebbistatin和Y27632分別抑制肌球蛋白II(Myosin II)ATP水解酶和ROCK信號(hào)通路，從而抑制了細(xì)胞內(nèi)部的收縮力反應(yīng)。轉(zhuǎn)染ERK FRET探針的細(xì)胞培養(yǎng)在2.5、9.0、21.5 kPa三種剛度的聚丙烯酰胺凝膠上，實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞和抑制劑提前孵育1 h，濃度分別為PP1(10 μM)、Blebbistatin(25 μM)、Y27632(20 μM)、PD98059(10 μM)。

根據(jù)每組細(xì)胞反應(yīng)的FRET平均值曲線，在添加DMSO溶劑(0.1%體積比)的參照實(shí)驗(yàn)中，ERK 活性仍然呈現(xiàn)了與凝膠剛度參數(shù)的正相關(guān)性，見圖2(a)；在分別添加PP1、Blebbistanin、Y27632抑制劑的實(shí)驗(yàn)中，總體趨勢(shì)上ERK激酶在2.5 kPa凝膠上的活性(紅色曲線)仍低于在9.0 kPa和21.5 kPa凝膠上的活性，同時(shí)PDGF都能有效激活ERK，見圖2(b)-(d)。添加ERK抑制劑PD98059后，ERK在不同剛度凝膠上的活性差距減小，其本底活性水平受到抑制，但該實(shí)驗(yàn)條件下未有效抑制PDGF刺激對(duì)ERK的激活，見圖2(e)。通過數(shù)值統(tǒng)計(jì)和t檢驗(yàn)分析，比較各組細(xì)胞在PDGF刺激前8 min和刺激后10 min的FRET比值分布，結(jié)果仍顯示ERK活性在不同凝膠剛度上的差異受PP1、Blebbistatin、Y27632三個(gè)抑制劑的影響較小，受PD98058抑制劑的影響很顯著，見圖3。這些結(jié)果初步顯示基質(zhì)剛度對(duì)細(xì)胞ERK活性的調(diào)控受Src信號(hào)和胞內(nèi)收縮力的影響較小。

注：不同抑制劑作用下，細(xì)胞組中ERK探針的FRET/ECFP比值隨時(shí)間變化的平均值曲線(平均值±方差)，培養(yǎng)在2.5、9.0、21.5 kPa凝膠上的細(xì)胞統(tǒng)計(jì)數(shù)分別為(a)：n=48、113、72；(b)：n=144、66、133；(c)：n=46、102、67；(d)：n=62、144、69；(e)：n=65、93、86。

3.3 基質(zhì)剛度對(duì)黏著斑形態(tài)的影響

細(xì)胞主要通過黏著斑(focal adhesions)錨定在基質(zhì)上，粘著斑也是細(xì)胞對(duì)基質(zhì)剛度的一個(gè)主要感受器[29-30]。Paxillin是一種定位于黏著斑的細(xì)胞骨架蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞的黏附和遷移[31]。通過在細(xì)胞中表達(dá)熒光標(biāo)記的Paxillin-dsRed[32]，我們初步探索了基質(zhì)剛度對(duì)黏著斑形態(tài)的影響。ASM細(xì)胞轉(zhuǎn)染Paxillin-dsRed質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)移到2.5、9.0、21.5 kPa三種凝膠及玻璃上，在含1% FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下拍攝細(xì)胞熒光圖像。Paxillin-dsRed定位于黏著斑中，將顯示黏著斑的細(xì)胞切割出來后，觀察不同基質(zhì)剛度上黏著斑的形態(tài)差異。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)在玻璃上時(shí)，黏著斑主要呈典型的斑點(diǎn)狀和短直線狀，而培養(yǎng)在軟的凝膠上時(shí)，許多細(xì)胞中的黏著斑呈不規(guī)則的形狀或彎曲的線條狀，見圖4。根據(jù)黏著斑形態(tài)粗略計(jì)算每組條件下的細(xì)胞比率，黏著斑形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞在玻璃上占比8.8%(55個(gè)細(xì)胞中的5個(gè))，21.5 kPa凝膠上占比37.3%(59個(gè)細(xì)胞中的22個(gè))，9.0 kPa凝膠上占比58.8%(51個(gè)細(xì)胞中的33個(gè))，2.5 kPa凝膠上占比76.3%(38個(gè)細(xì)胞中的29個(gè))。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步提示細(xì)胞可能為了適應(yīng)不同的基質(zhì)剛度而調(diào)節(jié)黏著斑的形態(tài)，或黏著斑的變化是基質(zhì)剛度調(diào)控細(xì)胞生化活性的一種途徑。同時(shí)我們注意到，對(duì)不同基質(zhì)剛度上的細(xì)胞黏著斑形態(tài)變化仍需要有更加定性、定量方面的分析。

注：(a，b)各組細(xì)胞中分別選取加PDGF前(-8 min)后(10 min)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)和t檢驗(yàn)比較。

圖4 基質(zhì)剛度對(duì)細(xì)胞黏著斑形態(tài)的影響

4 討論

細(xì)胞的環(huán)境剛度變化不僅存在于發(fā)育過程，也常見于臨床的病理情況下，如肝硬化、血管硬化、肺纖維化、癌細(xì)胞腫塊等[1,33-36]。物理因素如何參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的活動(dòng)，是近年來快速發(fā)展的研究領(lǐng)域。本研究利用FRET技術(shù)實(shí)時(shí)觀測(cè)細(xì)胞中ERK激酶活性，試圖研究基質(zhì)剛度的物理環(huán)境因素對(duì)細(xì)胞中生化活動(dòng)的影響。此前的一項(xiàng)工作利用FRET技術(shù)證明基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)干細(xì)胞中鈣信號(hào)震蕩的頻率和幅度，該過程受肌球蛋白活性(Actin filaments/Myosin II)的調(diào)控作用不明顯[26]。利用ERK FRET檢測(cè)技術(shù)，證實(shí)ERK活性與基質(zhì)剛度有正相關(guān)性，其在硬玻璃上的活性高于在軟的凝膠上，而在2.5 kPa凝膠上的活性又低于在9.0 kPa和21.5 kPa凝膠上。細(xì)胞內(nèi)的收縮力信號(hào)如Myosin活性以及Src信號(hào)對(duì)基質(zhì)剛度調(diào)控ERK活性的影響不明顯，提示在該力-化學(xué)信號(hào)偶聯(lián)過程中存在其它的作用途徑。

考慮細(xì)胞通過黏著斑與基質(zhì)接觸，通過進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在軟凝膠上，細(xì)胞黏著斑形態(tài)變得不規(guī)則，初步計(jì)算其不規(guī)則比率與基質(zhì)剛度呈一定的正相關(guān)性，提示黏著斑介導(dǎo)的細(xì)胞黏附力改變可能是調(diào)控該力-化學(xué)信號(hào)偶聯(lián)過程的一種途徑。黏著斑是細(xì)胞感受基質(zhì)環(huán)境的一種效應(yīng)器，根據(jù)結(jié)果推測(cè)細(xì)胞通過黏著斑形態(tài)的改變以適應(yīng)不同的基質(zhì)剛度，而黏著斑形態(tài)如何進(jìn)一步影響細(xì)胞的黏附力及下游的生化活動(dòng)，有待后續(xù)研究。